8

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ НАН УКРАЇНИ

УДК 575.24:631.528:633.15

РОЛЬ МІКРО- І МАКРОМУТАЦІЙ В ГЕНЕТИЧНОМУ ПОЛІПШЕННІ СОРТІВ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Назаренко Микола Миколайович

К И Ї В 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Моргун Володимир Васильович

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Лях Віктор Олексійович завідувач кафедри, Запорізький національний університет

кандидат біологічних наук Якимчук Руслан Андрійович доцент кафедри агробіотехнології та хімії, Уманський державний педагогічний університет імені Павла Тичини

Захист дисертації відбудеться „ 21 ” 05 2009 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська,31/17

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ-22, вул. Васильківська, 31/17

Автореферат розіслано „14” 04 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Мордерер Є.Ю.

3

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми Однією з актуальних задач в мутаційній селекції пшениці є розробка методів та пошук нових методичних засобів, що підвищують вихід практично-цінних мутацій. Дослідження ролі макро- та мікромутацій у зв'язку з вдосконаленням методів мутаційної селекції та розробкою ефективних прийомів генетичного поліпшення рослин, вивчення специфічності дії мутагенів при індукції макро- та мікромутантів на різних генотипах можуть сприяти прогресу у вирішенні питання спрямованого керування мутаційним процесом. Нагальною є проблема визначення пріоритетів використання мікро- та макромутацій в практичній селекції, визначення оптимальних доз мутагенів в їх індукції, ідентифікація цих доз мутагенів за показниками росту та розвитку рослин М1, цитологічного аналізу, чому недостатньо приділялося уваги в попередніх дослідженнях.

Приклади досліджень з індукції та використання мікро- та макромутацій на пшениці нечисленні, зазвичай пов'язані з поліпшенням лише окремих параметрів, потребують методичного удосконалення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відділі експериментального мутагенезу Інституту фізіології рослин і генетики НАН України в рамках наукової тематики відділу „Вивчення ефективності мутагенних факторів в селекції на ранньостиглість озимої пшениці і кукурудзи” (№ державної реєстрації 0101U009220) та „Вивчення ефективності поєднання ефективності мутаційної і комбінаційної мінливості з метою генетичного поліпшення якості зерна злаків” (№ державної реєстрації 0107U004020).

Об'єкт дослідження - індукція макро- та мікромутантів озимої м'якої пшениці.

Предмет дослідження - частота макро- та мікромутацій, індукована фізичними та хімічними мутагенами в озимої пшениці в залежності від генотипу сорту, природи та дози мутагенів; порівняння можливості їх використання для генетичного поліпшення.

Мета та завдання дослідження. Головною метою наших досліджень було вивчення ефективності використання макро- та мікромутацій в генетичному поліпшенні сучасних сортів озимої пшениці.

При цьому ставилися наступні завдання:

1. Вивчити вплив фізичних та хімічних мутагенних факторів на ріст та розвиток рослин починаючи з М1.

2. Дослідити частоту та спектр хромосомних аберацій.

3. Дослідити частоту та спектр видимих мутацій в поколіннях М2 - М3. Визначити частоту цінних мутацій.

4. Провести доскональне прикладне та генетичне вивчення мутантів старших поколінь. мікромутант рослина хромосомний аберація

5. Провести класифікацію всього матеріалу на макро- та мікромутації, встановити залежність між величиною дози мутагенного фактору та виходом корисних макро- та мікромутантів.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлена суттєва кореляція (на рівні 0,7 - 0,8) між частотою видимих мутацій, частотою хромосомних аберацій та виживанням рослин в М1. Цей ефект може використовуватись для добору за показниками М1 найбільш оптимальних для індукції мутацій доз мутагенів.

На основі аналізу показника рівня індукованої мутаційної мінливості встановлено, що на відміну від гамма-променів хімічні мутагени у високих концентраціях звужують формотворчий процес.

Ідентифікована специфічність дії гамма-променів, НМС та НЕС в індукції окремих типів мутацій, що дозволяє добирати мутагенні фактори в залежності від цілей селекції.

Вперше виявлено, що найефективнішими в індукції практично-цінних мутацій є наступні дози мутагенних факторів: гамма-промені в діапазоні помірно високих доз (100 - 200 Гр), хімічні мутагени в діапазоні помірно низьких доз. Найбільш ефективними мутагенами в індукції селекційно-цінних макро- та мікромутантів є наступні: НМС (0,005 - 0,0125 %), гамма-промені (100 Гр), НЕС (0,005 - 0,01 %).

Встановлено, що для індукування мікромутацій необхідно використовувати низькі дози мутагенів, при дії яких виживання рослин в М1 складає 70 - 80 %, спостерігається стимуляція або незначна депресія за показниками структури врожайності рослин М1, частота хромосомних аберацій не перевищує 15 %.

З метою індукції макромутацій необхідно використовувати помірно високі та високі дози мутагенів, що спричиняють виживання рослин в М1 на рівні 40 - 70 %, значну депресію за показниками структури врожайності рослин М1 та частоту хромосомних аберацій в межах 18 - 30 %.

Використання високих доз мутагенних факторів (ЛД50) є ефективним засобом індукування макромутантів як джерела нових цінних для комбінативної селекції ознак.

Отримані нами дані динаміки змін частоти та спектру індукованих макро- та мікромутацій в залежності від мутагенного фактору, його дози та генотипу сорту, сприятимуть підвищенню ефективності мутаційної селекції озимої пшениці.

Практичне значення одержаних результатів. При доборі найбільш ефективних для індукції видимих мутацій концентрацій та доз мутагенних факторів доцільно керуватися виявленою в работі тісною кореляційною залежністю між частотою видимих мутацій, частотою хромосомних аберацій та виживанням рослин в М1.

Встановлена закономірність індукування гамма-променями переважно мостів хромосомного типу, нітрозоалкілмочевинами - поодиноких фрагментів, може бути використана при визначенні природи мутагенного чинника.

Для індукції практично-цінних мутацій рекомендовано використовувати гамма-промені в діапазоні помірно високих доз (100 - 200 Гр), тоді як хімічні мутагени - в діапазоні помірно низьких доз. В мутаційній селекції бажано використовувати наступні найбільш ефективні мутагени: НМС (0,005 - 0,0125 %), гамма-промені (100 Гр), НЕС (0,005 - 0,01 %).

В залежності від цілей селекції в разі необхідності отримання мікромутацій рекомендується використовувати низькі дози та концентрації мутагенів. З метою індукції макромутацій необхідно використовувати високі та помірно високі дози мутагенів.

Отримано перспективні мутантні лінії озимої пшениці, які передані для подальшої роботи в Інститут фізіології рослин і генетики НАН України.

Особистий внесок здобувача полягає в оволодінні необхідними методами досліджень, підборі і опрацюванні даних літератури, підготовці та проведенні експериментів, розробці планів досліджень, обґрунтуванні та статистичній обробці результатів, підготовці до друку наукових робіт. Матеріали дисертаційної роботи одержані автором самостійно або спільно з співробітниками ІФРГ НАН України. Частка особистої участі дисертанта складає 80%.

Апробація роботи. Результати досліджень дисертаційної роботи доповідались на Х конференції молодих дослідників “Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології” (Київ, 2007), 3-й міжнародній конференції молодих учених “Біологія від молекули до біосфери” (Харків, 2008), на семінарах МАГАТЕ (IAEA Regional Training Course on Induced Mutations and Related Biotechnologies in Cereal Breeding, Turkish Atomic Energy Authority, Saraykov Nuclear Research and Training Center, Анкара, Турція, 2007, IAEA Regional Training Course on PCR based molecular markers, West Silesian University, Катовіце, Польша, 2008 ).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті в фахових виданнях та 6 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація містить 118 сторінок, 31 таблицю, 10 рисунків, посилань на літературу 238 назв, з них 138 іноземних.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літературних джерел висвітлено сучасний стан використання методу експериментального мутагенезу з метою генетичного поліпшення сортів культурних рослин, зокрема пшениці, світові досягнення, перспективні напрями отримання мутацій та пошуку методичних підходів підвищення ефективності мутаційного процесу, у тому числі в напрямку отримання господарсько цінних ознак, з урахуванням способів дії мутагенів на вихідний матеріал, концентрацій та доз мутагенів, використання принципово нових мутагенів та методичних протоколів. Розглянуто питання історії досліджень з макро- та мікромутацій, досягнень в цьому напрямі досліджень, сучасного стану проблеми та перспектив. Вивчення саме цих питань покладено в основу наших досліджень.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Досліди проводились протягом 2005 - 2008 рр у Дослідному сільськогосподарському виробництві Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (смт Глеваха Васильківського району Київської області), зона Полісся.

Вихідним матеріалом у роботі було насіння мутантних сортів та ліній озимої м'якої пшениці (Triticum aestivum L.) сортів Смуглянка, Панна, Одеська 333, Матильда. Обробку насіння хімічними мутагенами проводили за загальноприйнятою методикою, а опромінення насіння здійснювали на гамма-установці “Исследователь” Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України гамма-променями радіоактивного ізотопу Со60, потужність установки 7,3 р/с.

Вивчали вплив хімічних та фізичних мутагенів на повітряно-сухе насіння. Наважки хімічних мутагенів розчиняли в дистильованій воді при кімнатній температурі безпосередньо перед обробкою насіння. Використані такі концентрації та дози мутагенів: гамма-промені - 50, 100, 150, 200 Гр, НЕС - 0,005, 0,01, 0,025, 0,05 %, НМС - 0,001, 0,005, 0,0125, 0,025 %.

В М1 здійснювали облік польової схожості та виживання рослин, проводили аналіз структури врожайності, вивчали спектри та частоти хромосомних аберацій у клітинах меристеми первинних корінців.

В М1, М2, М3 вивчали частоту та спектр мутацій в залежності від концентрацій і доз мутагенів - всього 26 варіантів досліду. Загальна кількість вивчених сімей - 12580.

Мутації виділяли шляхом старанного огляду рослин всіх сімей під час проходження ними основних фаз росту і розвитку у поколіннях М1, М2 та М3.

У фазу повних сходів враховували хлорофільні мутації. На стадії колосіння спостерігали за видимими змінами стебла, листя і колоса, відмічали рослини з інтенсивною восковою поволокою і без неї, враховували відставання чи випередження масового колосіння в сім'ях у порівнянні з контролем та ранньостиглим сортом (Донська напівкарликова). Під час цвітіння продовжували спостереження за ранніми і пізніми формами, а також вели облік змін за колосом. На стадії дозрівання пшениці продовжували облік змінених форм за будовою колоса. Протягом всієї вегетації відмічали форми, стійкі до хвороб, вилягання, продуктивні та змінені за висотою рослин. Змінені форми етикетували із зазначенням польового номера, зміненої ознаки та варіанта досліду. Всі дані занотовувалися у польовому журналі.

Мутаціями вважали змінені ознаки, що успадковувались в наступному поколінні. Облік мутацій проводили за кількістю змінених сімей від загальної кількості вивчених сімей в М2. В поколінні М3 проводили фенологічні спостереження і описували всі змінені сім'ї. В М3 також були виявлені нові мутації.

В М3 відібрано мутанти з практично-цінними ознаками для подальшого їх вивчення та випробування на продуктивність.

Проведено вивчення та опис мутантів (М₄ - М₅) старших поколінь, отриманих у відділі. Для повної характеристики мутантів в М4 проводили структурний аналіз кращих мутантних ліній (тридцять рослин з кожної лінії). В М4 проводили класифікацію на макро- та мікромутації. До мікромутацій відносили такі, що не мали різких відмінностей від своїх вихідних форм, але відрізнялися мікрозмінами за кількісними ознаками. До макромутацій відносили мутанти зі зміненим фенотипом (морфології та структури колосу, рослини; за висотою). Проводили аналіз продуктивності та якості мутантів М4-5. Аналіз включав у себе визначення вмісту білку для діляночних посівів та електрофорез білків перспективних та оригінальних форм. Вміст білку в зерні пшениці визначали за методом ISO (прилад Inframatik-8600).

Екстракція, електрофоретична сепарація та ідентифікація глютенинів проводилась за Lemli. HMW-GS були ідентифіковані у відповідності з HMW-GS каталогом. Усі електрофорези проводились тричі.

Математичну обробку одержаних результатів проводили за методикою дисперсійного аналізу. Достовірність різниці між середніми дослідних варіантів і контролем оцінювали за критерієм Ст'юдента і Фішера. Нормальність розподілу визначали за критерієм Колмогорова-Смірнова та за коефіцієнтами асиметрії (As) та ексцесу (Ex). Дискримінантний аналіз проводився за загальновизнаною методикою.

ВПЛИВ МУТАГЕНІВ НА ФОРМУВАННЯ ПОКОЛІННЯ М₁ РОСЛИН ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ

Вивчення впливу мутагенних чинників розпочали в поколінні М₁. Аналізом схожості рослин М₁ при дії на насіння мутагенів НЕС, НМС та гамма-променів встановлено, що в усіх варіантах досліду вона достовірно знизилась порівняно з контролем. Також встановлено суттєве зниження схожості рослин при застосуванні високих концентрацій мутагенів у порівнянні з середніми та низькими.

При обробці мутагенами насіння пшениці вражаюча дія впливає в першу чергу на ті ознаки, які починають формуватися в момент обробки. В найбільшій мірі це проявляється на показниках схожості та виживання, росту та розвитку, елементах структури продуктивності в М₁. В залежності від дози мутагени можуть виявляти депресивну або стимулюючу дію на процеси росту та розвитку рослин М₁.

Більшу депресію викликають гамма-промені та НМС, ніж НЕС. Виживання варіює в межах 82,7 - 40,7 % для сорту Панна та 87,9 - 7,2 % у сорту Смуглянка. Залежність майже лінійна. За виживанням рослин дози можна класифікувати так: низькі - гамма-промені 50, 100 Гр, НЕС 0,005 %, 0,01 %, НМС 0,001 %, 0,005 %, оптимальні - гамма-промені 150 Гр, НЕС 0,025 %, НМС 0,0125 %, напівлетальні - гамма-промені 200 Гр (Панна), НЕС 0,05 %, НМС 0,025 % (Панна), критичні - для Смуглянки дози 200 Гр та НМС 0,025 %.

За результатами факторного та дискримінантного аналізу структури врожайності рослин М₁ озимої пшениці встановили, що найбільш цінну інформацію про індуковані мутагенними чинниками зміни в морфометрії покоління М₁ пшениці несуть наступні складові структури врожайності - висота рослин, маса и кількість зерен з головного колоса, маса зерен з рослини (останній менш достовірний, ніж три попередні), в окремих випадках можливе також використання такої модельної ознаки як довжина головного колоса.

Таким чином, чутливими та інформативними показниками токсичної дії мутагенів при визначенні впливу доз та концентрацій на рослини М₁ є схожість, виживання та висота рослин, вага зерна з колосу та інші показники структури врожайності. Спостерігається зворотній зв'язок: чим більша доза чи концентрація мутагенного фактора, тим нижчі показники розвитку вищезазначених ознак. Градація мутагенів за зниженням схожості, виживання і висоти рослин та ваги зерна з колосу наступна - НЕС>НМС>гамма-промені.

ЦИТОГЕНЕТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ ХРОМОСОМНИХ ПОРУШЕНЬ В М1 ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ

Цитологічний аналіз хромосомних аберацій є однією з найбільш достовірних методик оцінки й ідентифікації факту мутагенної дії. Хромосомні перебудови є надійним показником пошкоджувальної дії мутагенів і генетичної мінливості організмів.

Як показано в таблиці 1, всі варіанти із статистичною достовірністю відрізнялися за частотою хромосомних аберацій один від одного і від контролю. Для спрощення схеми статистичної обробки варіанти були розбиті на групи за природою мутагену та вивчалася спочатку значущість відмінності варіанту з найменшою дозою мутагену від контролю, а потім відмінності варіантів усередині групи. Частота хромосомних аберацій варіювала від 3,26 % до 41,2 % для Панни і від 5,14 % до 47,7 % для Смуглянки. Ряд мутагенів за частотою індукованих аберацій можна представити так: гамма-промені >НМС >НЕС.

Цитологічний аналіз набагато надійніший метод ідентифікації депресії, викликаної мутагенами ніж аналіз структури врожайності. Модельними змінними для аналізу такої депресії виступають частота хромосомних аберацій: для гамма-променів - частота аберації за типом хромосомний міст, для хімічних мутагенів - за типом поодинокий фрагмент. Подвійні фрагменти не можуть використовуватись для ідентифікації мутагенної дії. Характеристики цитологічного аналізу перш за все залежать від генотипу, потім дози, природи мутагену. Механізм дії НЕС, відмінний від інших алкілуючих агентів, знаходить своє відображення в співвідношенні фрагментів і мостів при відповідних з НМС концентраціях.

Частота хромосомних аберацій, індукована мутагенними факторами, залежить від доз та концентрацій мутагенів з дуже високим ступенем прямої кореляції (0,94). Встановлена суттєва кореляція (на рівні 0,7 - 0,8) між частотою видимих мутацій, частотою хромосомних аберацій та виживанням рослин в М1.

Таблиця 1

Частота хромосомних аберацій

Варіант	Мітозів в стадії анафази	Всього аберацій	Мітозів в стадії анафази	Всього аберацій
		шт	%		шт	%
	Панна	Смуглянка
Контроль, вода	1013	13	1,28±0,43	1018	19	1,87±0,48
50 Гр	1004	119	11,85±0,98*	1032	151	14,63±1,17*
100 Гр	984	204	20,73±1,42*	1031	283	27,45±1,63*
150 Гр	1002	302	30,14±1,78*	1012	387	38,24±1,99*
200 Гр	551	227	41,20±2,01*	846	404	47,75±2,18*
НЕС 0,005 %	1011	33	3,26±0,57*	1006	56	5,57±0,64*
НЕС 0,01 %	1002	91	9,08±0,92*	1023	121	11,83±0,97*
НЕС 0,025 %	1018	169	16,60±1,22*	1017	192	18,88±1,39*
НЕС 0,05 %	1024	218	21,29±1,47*	1028	281	27,33±1,70*
НМС 0,001 %	1036	37	3,57±0,61*	1051	54	5,14±0,61*
НМС 0,005 %	1041	105	10,09±0,95*	1007	125	12,41±1,02*
НМС 0,0125 %	1019	197	19,33±1,36*	1026	213	20,76±1,42*
НМС 0,025 %	982	289	29,43±1,71*	846	290	34,28±1,79*

*- статистично достовірно у порівнянні з контролем при Р<0,05

На клітинному рівні встановлена чітка специфічна дія мутагенних факторів різної природи. Гамма-промені індукують переважно мости, а хімічні мутагени - фрагменти. Зазначена специфічна дія мутагенних факторів може бути використана для їх ідентифікації як при індукованому, так і спонтанному мутагенезі, а також в разі мутагенного забруднення навколишнього середовища.

ЧАСТОТА ТА СПЕКТР МУТАЦІЙ В М2 - М3 ПОКОЛІННЯХ. ДОСЛІДЖЕННЯ ТА КЛАСИФІКАЦІЯ МУТАНТІВ М4 - М5 ПОКОЛІНЬ

При аналізі частоти мутацій в М2 - М3 (табл. 2) знаходимо наступну динаміку: її поступове зростання до максимальної дози з подальшою стабілізацією при високих дозах мутагену або невеликим спадом частоти при найвищій дозі мутагену. Градація в ефективності індукції видимих мутацій наступна: НМС > НЕС > гамма-промені у сорту Панна та гамма-промені > НЕС > НМС у сорту Смуглянка.

Значимий коефіцієнт прямої кореляції між дозою та мутагеном склав у Смуглянки r=0,77 (при гама-опромінені - r=0,97; при НМС - r=0,75; при НЕС - r=0,74), у Панни r=0,74 (при гама-опромінені - r=0,85; при НМС - r=0,61; при НЕС - r=0,80). Вочевидь, такий розподіл частот в залежності від дози мутагену повинен мати більш складну залежність ніж прямолінійна кореляція.

Таблиця 2

Частота мутацій у М2 - М3 сортів Панна та Смуглянка

Варіант	Панна	Смуглянка
Контроль	1,2±0,49	1,1±0,47
Гамма-промені, 50 Гр.	8,0 ±1,21*	6,2±1,08*
Гамма-промені, 100 Гр.	10,4±1,37*^	7,9±1,21*^
Гамма-промені, 150 Гр.	11,8±1,44*^	12,2±1,46*^
Гамма-промені, 200 Гр	10,6±1,38*	12,5±1,48*
НЕС 0,005 %	10,4±1,37*	6,6±1,11*
НЕС 0,01 %	12±1,45*^	7,6±1,19*^
НЕС 0,025 %	13,2±1,51*^	9,0±1,28*^
НЕС 0,05 %	12±1,45*^	7±0,14*^
НМС 0,001 %	12,6±1,48*	4,8±0,96*
НМС 0,005 %	14,8±1,59*^	6,5±1,10*^
НМС 0,0125 %	12,2±1,46*^	8,2±1,23*
НМС 0,025 %	11,9±1,45*	5,6±1,03*^

* - різниця з контролем достовірна при Р<0,05;

^ - різниця з попереднім варіантом достовірна при Р<0,05.

Але аналіз лише за частотою мутацій не дає повністю коректну картину мутаційних змін. Необхідно враховувати також кількість типів мутацій у кожному варіанті.

Таблиця 3

Рівень мінливості у М2 - М3 сортів Панна та Смуглянка

Варіант	Панна	Смуглянка
Контроль, вода	0,11±0,01	0,04±0,01
Гамма-промені, 50 Гр.	1,28±0,04*	0,68±0,03*
Гамма-промені, 100 Гр.	1,35± 0,04*^	1,19±0.03*^
Гамма-промені, 150 Гр.	1,89±0,05*^	1,22±0,04*
Гамма-промені, 200 Гр.	1,91±0,06*	1,38±0,04*^
НЕС 0,005 %	1,14±0,03*	0,59±0,02*
НЕС 0,01 %	1,68±0,05*^	0,91±0,03*^
НЕС 0,025 %	2,38±0,06*^	1,35±0,04*^
НЕС 0,05 %	2,04±0,06*^	0,91±0,03*^
НМС 0,001 %	2,02±0,05*	0,48±0,02*
НМС 0,005 %	2,22±0,05*^	0,62±0,02*^
НМС 0,0125 %	2,25±0,06*	1,07±0,04*^
НМС 0,025 %	1,98±0,04*^	0,67±0,03*^

* - різниця з контролем достовірна при Р<0,05;

^ - різниця з попереднім варіантом достовірна при Р<0,05.

Рівень мінливості вираховувався за формулою:

Pн = б·г

де Pн - рівень мінливості варіанту;

б - відношення кількості мутацій до загальної кількості сімей у варіанті;

г - кількість типів змінених ознак у варіанті.

Якщо за основу аналізу беремо рівень мінливості, то у варіантах з гамма-променями ми бачимо класичну пряму залежність частоти мутацій від дози мутагену. Для обох сортів при дії НЕС та НМС проявляється кінетика кривої. Вочевидь, максимальні дози хімічних мутагенів для цих сортів виявилися граничними, тобто викликали зниження як частоти, так і різноманітності формотворчого процесу.

Для ретельного аналізу ми класифікували виділені мутації на декілька груп за загальновизнаною для озимої пшениці методикою (за Моргун В.В., Логвиненко В.Ф.). При цьому також урахували візуально виділені продуктивні та кущисті форми, оскільки, за твердженнями деяких дослідників, саме такі змінені сім'ї більш цінні для наступного селекційного процесу, ніж потомства від макромутантів. Всього виділено 34 типи ознак. При застосуванні хімічних мутагенів за аналізом в М2-3 бажано використовувати їх для індукції цінних мутацій у помірних концентраціях. Щодо гамма-променів обґрунтованим є застосування високих доз (200 Гр). Високі дози хімічних мутагенів необхідні для індукції макромутацій, а також в спеціальних генетичних дослідженнях. На нашу думку, питання щодо пріоритетного використання фізичних чи хімічних мутагенів не має особливого сенсу, оскільки в багатьох випадках вони доповнюють одне одного.

Суттєвим моментом при вивченні частоти і спектру мутацій є виявлення серед них частоти господарсько-цінних форм. До корисних мутацій відносяться короткостеблові, напівкарлики, мутанти з довгим циліндричним, щільним колосом, з крупним колосом, ранньостиглі, продуктивні, стійкі до хвороб, з підвищеною кущистістю, з високим вмістом білку і незамінних амінокислот, продуктивні та інші.

Для фізичних мутагенів також встановлена досить висока кореляція (0,7 - 0,8) між зростанням дози та виходом селекційно-цінних мутацій. Максимальну частоту практично цінних форм отримано при помірно-високих дозах (за виходом корисних мутацій від загальної кількості сімей в М2). Максимальне значення виходу селекційно-цінних мутацій становило: для Панни - 6,2 % (доза НМС 0,0125 %), у Смуглянки - 6,0 % (гамма-промені 150 Гр.) Таким чином, зберігається та ж сама градація мутагенів за ефективністю в індукуванні селекційно-цінних мутацій, що й для індукції загальної частоти мутацій (для Панни - НМС ?НЕС ? гамма-промені, для Смуглянки - гамма-промені ? НЕС ? НМС).

Основними показниками, за якими аналізували М4 - М5 лінії, були загальна продуктивність (врожайність з ділянки перерахована на центнери з гектару) та кількісний вміст у відсотках білка та клейковини як показник якості. Фактично при аналізі М4 розпочалося об'єктивне оцінювання продуктивності мутантних ліній (в М2 - М3 оцінка проводилася лише візуально).

В усіх випадках продуктивні мутації індуковані низькими та помірно-високими дозами (гамма-промені 50 - 100 Гр, НЕС - 0,005 - 0,01 %, НМС -- 0,005 - 0,0125 %). Використання високих доз гамма-променів - 200 Гр не призвело до отримання продуктивних ліній. Для сорту Смуглянка ефективними в індукції продуктивних мутацій була НЕС 0,01 % та гамма-промені у дозі 100 Гр. Високобілкова лінія Смуглянки була індукована НЕС у концентрації 0,025 %. У сорту Одеська 333 продуктивні лінії індуковані НЕС у концентрації 0,005 %. За ефективністю для всіх вихідних форм мутагени можна розташувати так: НЕС > гамма-промені > НМС. НЕС була однаково ефективна в індукуванні продуктивних ліній як для сорту Смуглянки, так і для Одеської 333.

Встановлено суттєву залежність виходу корисних мікро- та макромутацій від генотипу вихідної форми, тому підбір належних генотипів є обов'язковою умовою успіху мутаційної селекції.

Таблиця 4

Оптимальні дози для індукції макро- та мікромутацій та відповідні їм показники виживання, структури врожайності та частоти хромосомних аберацій рослин М1. Сорт Панна

Оптимальна доза	Виживання, %	Показники структури врожайності	Частота хромосомних аберацій, %
Індукція мікромутацій
Гамма-промені 50 Гр.	79,55	стимуляція	11,85
НЕС 0,005 %	80,85	стимуляція	3,26
НМС 0,001 %	75,8	стимуляція	3,57
Індукція макромутацій
Гамма-промені 150 Гр.	64,05	депресія	30,14
НЕС 0,05 %	59,01	депресія	21,29
НМС 0,025 %	40,7	депресія	29,43

В залежності від цілей селекції виникає потреба в індукуванні конкретного типу мутацій. За частотою видимих мутацій нами встановлені оптимальні дози мутагенних факторів для індукції мікро- чи макромутацій.

Для індукції мікромутацій варто використовувати низькі дози мутагенів. При цих дозах виживання рослин в М1 складає 70 - 80 %, спостерігається стимуляція або невелика депресія за показниками структури врожайності рослин М1, частота хромосомних аберацій не вища 15 %.

З метою індукції макромутацій необхідно використовувати високі та помірно високі дози мутагенів. При цих дозах виживання рослин в М1 складає 40 - 70 %, спостерігається значна депресія за показниками структури врожайності рослин М1, частота хромосомних аберацій складає 18- 30 %.

Таблиця 5

Оптимальні дози для індукції макро- та мікромутацій та відповідні їм показники виживання, структури врожайності та частоти хромосомних аберацій рослин М1. Сорт Смуглянка

Оптимальна доза	Виживання, %	Показники структури врожайності	Частота хромосомних аберацій, %
Індукція мікромутацій
Гамма-промені 50 Гр.	76,05	депресія	14,63
НЕС 0,01 %	68,4	депресія	11,83
НМС 0,001 %	79,15	депресія	5,14
Індукція макромутацій
Гамма-промені 100 Гр.	70,35	депресія	27,45
НЕС 0,025 %	64,8	депресія	18,88
НМС 0,0125 %	64,35	депресія	20,76

Використання високих доз мутагенних факторів (ЛД50) є ефективним засобом індукування макромутантів, як джерела нових цінних для комбінативної селекції ознак.

За молекулярними маркерами виділено перспективні мутантні лінії сортів Смуглянка, Одеська 333, Матильда. Суттєве поліпшення за якістю зерна показали як мікро-, так і макромутації. Серед них переважна більшість була мікромутації.

Для сорту Панна характерні як макро-, так і мікрозміни, але переважають макромутації. Мутації Смуглянки, як правило, не мають такого різкого характеру, переважають мікрозміни. Для Смуглянки відносно більш характерні мікрозміни за продуктивністю та кущистістю (вони і є для Смуглянки більш перспективними на прикладі досліджень М4 - М5.)

Основними показниками порівняння ефективності використання макро- та мікромутантів є: по-перше, кількість зразків, відібраних для подальшого випробування; по-друге, середні дані за продуктивністю та якістю цих зразків; по-третє, наявність рекордних за врожайністю та якістю зразків. Ми використовуємо класичний підхід, розглядаючи кожний параметр окремо.

Поява ліній з високим вмістом білку більш характерна для мікромутантів, ніж для макромутантів.

У Смуглянки відношення макро- та мікромутацій не змінилось, а у сорту Одеська 333 домінували макромутації.

Таблиця 6

Результати класифікації мутантних ліній М4 -- М5 у попередньому випробуванні (2007-2008)

Вихідний сорт	Тип мутанта	Кількість ліній, шт.	Від загальної кількості ліній, %
Смуглянка	макро	4	11
	мікро	31	89
	всього	35	100
Матильда	макро	2	67
	мікро	1	33
	всього	3	100
Панна	макро	3	17
	мікро	15	83
	всього	18	100
Одеська 333	макро	6	25
	мікро	18	75
	всього	24	100

Таким чином, отримані нами дані стосовно залежності виходу частоти та спектру індукованих макро- та мікромутацій від мутагенного фактору і його дози, а також генотипу сорту, будуть сприяти підвищенню ефективності мутаційної селекції озимої пшениці.

ВИСНОВКИ

1. Показано, що чутливими та інформативними показниками токсичної дії мутагенів при визначенні впливу доз та концентрацій на рослини М1 є схожість, виживання та висота рослин, вага зерна з колосу та інші показники структури врожайності. Спостерігається зворотній зв'язок: чим більша доза чи концентрація мутагенного фактора, тим нижчі показники розвитку вищезазначених ознак. Градація мутагенів за зниженням схожості, виживання і висоти рослин та ваги зерна з колосу наступна: НЕС > НМС > гамма-промені.

2. Частота хромосомних аберацій, індукована мутагенними факторами, залежить від доз та концентрацій мутагенів з дуже високим ступенем прямої кореляції (0,94). Встановлена суттєва кореляція (на рівні 0,7 - 0,8) між частотою видимих мутацій, частотою хромосомних аберацій та виживанням рослин в М1.

3. На клітинному рівні встановлена чітка специфічна дія мутагенних факторів. Гамма-промені індукують переважно мости, а хімічні мутагени - фрагменти. Зазначена специфічна дія мутагенних факторів може використовуватись для ідентифікації мутагенного фактора як в індукованому, так і в спонтанному мутагенезі, а також в разі забруднення навколишнього середовища.

4. Мутагенні фактори індукували в поколіннях М2 - М3 наступну частоту видимих мутацій: для сорту Панна - 1,2-14,8 %, для сорту Смуглянка - 1,1-12,5 %. Зі збільшенням дози мутагенного фактору частота мутацій поступово зростає до максимальної дози з подальшою стабілізацією або невеликим спадом при найвищих дозах мутагенів. Ефективність мутагенів по збільшенню частоти в індукції мутацій наступна: НМС > НЕС > гамма-промені у сорту Панна та гамма-промені > НЕС > НМС у сорту Смуглянка. Генетична активність НЕС, як мутагена, найменш залежить від генотипу вихідного сорту.

5. При аналізі рівня індукованої мутаційної мінливості, як інтегративного показника частоти та спектру мутацій, встановлено, що для гамма-променів характерна класична пряма залежності частоти та різноманітності мутацій від дози мутагену, в той час як у хімічних мутагенів високі концентрації звужують формотворчий процес.

6. Аналіз спектру індукованих видимих мутацій засвідчив специфічну дію окремих мутагенів в індукуванні певних типів мутацій. Гамма-промені більш ефективні в індукції структурних мутацій стебла, кущистих форм, інтенсивності воскової поволоки; НЕС ефективна в індукції високостеблових форм, карликів, ранньостиглих, білоколосих форм; НМС ефективна в змінах структури колосу, індукції пізньостиглості, продуктивних форм.

7. Найбільшу частоту практично-цінних мутацій індукували гамма-промені в діапазоні помірно високих доз (100 -- 200 Гр), тоді як хімічні мутагени були більш активними в діапазоні помірно низьких доз. Вагомість цього висновку засвідчує аналіз походження створених мутантних сортів всього світу.

8. Саму високу активність в індукуванні практично цінних макро- та мікромутантів старших поколінь (М4 - М5) на різних генотипах мали: НМС (0,005 - 0,0125 %), гамма-промені (100 Гр), НЕС (0,005 - 0,01 %).

9. Встановлено суттєву залежність виходу корисних мікро- та макромутацій від генотипу вихідної форми, тому підбір належних генотипів є обов'язковою умовою успіху мутаційної селекції.

10. В залежності від цілей селекції виникає потреба в індукуванні конкретного типу мутацій. За частотою видимих мутацій нами установлені оптимальні дози мутагенних факторів для індукції мікро- чи макромутацій.

Для індукції мікромутацій варто використовувати низькі дози мутагенів. При цих дозах мутагенів виживання рослин в М1 складає 70 - 80 %, спостерігається стимуляція або невелика депресія за показниками структури врожайності рослин М1, частота хромосомних аберацій не вища 15 %.

З метою індукції макромутацій необхідно використовувати високі та помірно високі дози мутагенів. При цих дозах виживання рослин в М1 складає 40 - 70 %, спостерігається значна депресія за показниками структури врожайності рослин М1, частота хромосомних аберацій складає 18 - 30 %.

Використання високих доз мутагенних факторів (ЛД50) є ефективним засобом індукування макромутантів як джерела нових цінних для комбінативної селекції ознак.

11. Виділені практично-цінні за комплексом господарсько-цінних ознак мутантні лінії озимої пшениці будуть використовуватися в подальшій селекційній роботі.

12. Таким чином, отримані нами дані стосовно частоти та спектру індукованих макро- та мікромутацій, залежності їх виходу від мутагенного фактору і його дози, а також генотипу сорту, будуть сприяти підвищенню ефективності мутаційної селекції озимої пшениці.

18

Размещено на http://www.allbest.ru/

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Назаренко М.М. Виживаність і структура врожайності як показники мутагенної депресії у першому поколінні мутантів сортів озимої пшениці / М.М. Назаренко // Физиол. и биохим. культ. раст. 2007. №5, 39. С. 438-446

2. Назаренко Н.Н. Частота и спектр хромосомных нарушений в клетках корневой меристемы проростков пшеницы под действием мутагенов / Н.Н. Назаренко // Вісник ХНАУ Сер.: Біол. 2007. №3. С. 82-89

3. Назаренко Н.Н. Классификационный анализ мутантного материала / Н.Н. Назаренко // Физиол. и биохим. культ. раст. 2008. №1, 40. С. 33-42

4. Назаренко Н.Н. Результаты отбора селекционно-ценных мутантних линий в М4 озимой пшеницы. Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології.-Зб. матеріалів Х конф. молод. дослідників. К.:Інститут фізіології рослин і генетики НАН У, 2007. С. 122-123

5. Nazarenko N.N. Estimation of winter wheat mutagenic depression by morphometric parameters and surviving Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution. in: Proceedings of the III Internetional Young scientists conference “Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution.” (Odesa, 15 - 18 May, 2007). Odesa: Pechatnyi dom, 2007. P. 211.

6. Назаренко Н.Н. Анализ мутагенного воздействия на хромосомный аппарат клетки Актуальні проблеми ботаніки та екології. Матеріали міжнародної конференції молодих учених-ботаніків. К.: Фітосоціоцентр, 2007. С. 219 - 220.

7. Назаренко Н.Н. Изучение константных генетически и селекционно-ценных мутантов озимой пшеницы. Тези доповідей молодій вчених. Матеріали 2-ї міжнародної конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (19 - 21 листопада 2007 року). Х.: Планета-Принт, 2007. с. 142 -- 143.

8. Назаренко Н.Н. Использование экспериментального мутагенеза для индукции новых ценных форм у современных украинских сортов озимой мягкой пшеницы. Тези доповідей молодій вчених. Матеріали 3-ї міжнародної конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (19 - 21 листопада 2008 року). Х.: Планета-Принт, 2008. с. 142 -- 143.

9. Nazarenko N.N. Role of Macro- and Micromutants in Common Winter Wheat genetic improvement. Book of Abstracts FAO/IAEA International Symposium on Induced Mutations in Plants, 12 -- 15 August 2008, Vienna, Austria. Vienna, 2008. p. 155.

18

Размещено на http://www.allbest.ru/

АНОТАЦІЯ

Назаренко М.М. Роль мікро- і макромутацій в генетичному поліпшенні сортів озимої пшениці.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15. - Генетика. - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2009.

В дисертації викладено результати дослідження індукції мікро- та макромутацій при дії фізичних (гамма-промені) та хімічних мутагенів (НЕС, НМС) в залежності від доз та концентрацій на прикладі сучасних українських сортів озимої пшениці.

На основі аналізу поколінь М₁- М₃ встановлена пошкоджувальна дія мутагенів, вплив на елементи структури урожаю, проаналізована частота та спектр хромосомних аберацій, виникаючих під дією мутагенних факторів, визначена загальна частота мутацій в М1-М3 при дії мутагенів у різних концентраціях та дозах і частота практично цінних мутацій, визначені та проаналізовані спектри мутацій.

Проведено прикладне та генетичне вивчення перспективних мутантних ліній старших поколінь М4 - М5 за продуктивністю, вмістом білку, білковим спектрам. Класифікували отриманий мутантний матеріал на макро- та мікромутанти. Провели вивчення частот макро- та мікромутацій в залежності від дози та концентрації мутагену.

Створено генетично - та селекційно-цінні мутантні лінії перспективні як вихідний матеріал як для використання в якості компонентів селекційних схрещувань, так і для прямого використання в випробуваннях в якості перспективних кандидатів.

Ключові слова: мікромутація, макромутація, мутаген, доза, концентрація, частота мутацій, спектр мутацій, селекційно-цінна мутація, мутантна лінія.

АННОТАЦИЯ

Назаренко Н. Н. Роль микро- и макромутаций в генетичеcком улучшении сортов озимой пшеницы.- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15. - Генетика. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

В диссертации изложены результаты исследований индукции микро- и макромутаций под действием физических (гамма-лучи) и химических мутагенов (НММ, НЄМ) в зависимости от доз и концентраций на примере современных украинских сортов озимой пшеницы.

На основе анализа поколений М1 - М3 установлено повреждающее действие мутагенов, влияние на элементы структуры урожая, проанализирована частота и спектр хромосомных аберраций, возникающих под действием мутагенных факторов, определена общая частота мутаций М1-М3 при действии мутагенов в разных концентрациях и дозах и частота практически-ценных мутаций, определены и проанализированы спектры мутаций.

Проведено прикладное и генетическое изучение перспективных мутантных линий старших поколений М4 - М5 по продуктивности, содержанию белка, белковым спектрам. Классифицирован полученный мутантный материал на макро- и микромутации. Провели изучение частот макро- и микромутаций в зависимости от дозы и концентрации мутагена.

Созданы генетически- и селекционно-ценные мутантные линии, перспективные как для использования в качестве компонентов селекционных скрещиваний, так и для прямого использования в испытаниях в качестве перспективных кандидатов.

Ключевые слова: микромутация, макромутация, мутаген, доза, концентрация, частота мутаций, спектр мутаций, селекционно-ценная мутация, мутантная линия.

SUMMARY

Nazarenko M.M. Role of Micro- and Macromutations in Winter Wheat Varieties Genetic Improvement. - Manuscript.

Thesis for Candidate's degree in Biological Sciences on specialty 03.00.15. - Genetics. - Institute of Plant Physiology and Genetics, NASU, Kyiv, 2009.

The results of induction micro- and macromutations investigation have been presented in dissertation upon mutagen action by physical (gamma-rays) and chemical mutagens (NMU, NEU) according to doses, concentrations on modern Ukrainian winter wheat varieties example.

On the basis of the analysis of М1 - М3 generations, the striking effect of mutagens has been established, the influence for the elements of the yield structure, the frequency and spectra of chromosomal aberrations at action by mutation factors has been conducted, the general frequency of mutations under the influence of different concentrations and doses and the frequency of practically valuable mutations in M1- M3 has been determined, spectra of mutations has been determined and analyzed.

Practical and genetically investigation of perspective mutant lines М4 - М5 has been provided by productivity, protein content and spectrums. Mutant material has been ranged on micro- and macromutations. The frequency of micro- and macromutations according to concentrations and doses of mutagen has been investigated.

New genetically- and breeding-valuable mutant lines are obtained, which are used as an initial material in the selection process as components for crossbreeding or direct using as perspective candidates in exams.

Key words: micromutation, macromutation, mutagen, dose, concentration, frequency of mutations, spectrum of mutations, economically valuable mutation, mutant line.

Размещено на Allbest.ru

...