Участь бомбезину у регуляції жовчосекреторної функції печінки щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 612.35+616.36+591.132.5

Участь бомбезину у регуляції жовчосекреторної функції печінки щурів

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Мороз Олеся Федорівна

Київ 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Нурищенко Наталія Євгенівна НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідувач НДС "Біофізика"

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Берегова Тетяна Володимирівна НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, завідувач відділу фармако-фізіології

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Алексєєва Ірина Миколаївна Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділу імунології і цитотоксичних сироваток

Захист відбудеться 16.12.2009 р. о _13-30__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03117, Київ, пр.Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд.2

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул.Володимирська, 64

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, м.Київ, вул.Володимирська, 58)

Автореферат розісланий 14.11.2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В.Цимбалюк

бомбезин жовчоутворення холерез

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. З-поміж численних функцій печінки особливе місце посідає жовчоутворення, що є складним фізіологічним процесом, який об'єднує секреторний та екскреторний компоненти (Hofmann A.F., 2007). Регуляція секреції жовчі здійснюється завдяки взаємодії різних систем, серед яких істотну роль відіграють регуляторні пептиди. Регулюючий вплив на секрецію жовчі деяких пептидів нервового і ендокринного походження показаний експериментально (Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986; Лященко П.С., 1988; Масюк А.И., 1991; Громов Л.А., 1992; Alvaro D. et al., 1995; Гомазков О.А., 1996; Лященко Т.П., 2002; Співак Л.С., 2005; Hanales J.M. et al., 2006). Проте роль бомбезину (БН) в регуляції холесекреції вивчена недостатньо.

У ранніх роботах з дослідження регуляторної дії бомбезину на жовчоутворення наводяться дані про зміни інтенсивності холерезу, секреції бікарбонатів, жовчних кислот, фосфоліпідів та виділення холестеролу під його впливом, а пізніші дослідження присвячені вивченню механізмів дії пептиду на транспорт води та електролітів. Так, на тепер описано стимулюючий вплив бомбезину на секрецію холангіоцитами води та бікарбонатів за рахунок активації Cl^-/HCO^3- обмінника та Na⁺/НСО^3- симпорту (Kaminski D.L., Deshpande Y.G., 1983; Alvaro D. et al., 1997; Сho W.K., 1997; Сho W.K. et al., 1997; Сho W.K. et al., 1998). На ізольованих гепатоцитах показано, що бомбезин не впливає ні на захоплення цими клітинами таурохолатів із середовища, ні на вивільнення ними жовчних кислот (Knodell R.G., Steele N., 1987). В хронічних дослідах на собаках встановлено, що бомбезин посилює інтенсивність холесекреції, зменшує виділення холестеролу, проте не впливає на вихід жовчних кислот та фосфоліпідів (Kortz W.J. et al., 1986). Поряд з цим, дослідження інших авторів свідчать про відсутність ефекту бомбезину на жовчоутворення у собак (Kaminski D.L., Deshpande Y.G., 1983). У науковій літературі (Sievert C.E. et al., 1988; Schjodager B. et al., 1991; Thimister P.W., Hopman W.P., 1994; Cox M.R. et al., 1998; Thimister P.W. et al., 1998) також є дані про участь бомбезину в регуляції тонусу жовчовивідних шляхів, зокрема сфінктера Одді. Описано здатність пептиду зменшувати токсичні ефекти при холестатичних ураженнях печінки за рахунок активації портального кровообігу та посилення секреції жовчі (Leister I., Mbachu E.M., 2002, Assimakopoulos S.F., Scopa C.D., 2005).

Незважаючи на те, що в літературі зустрічаються поодинокі експериментальні роботи, присвячені дослідженню змін вмісту основних органічних компонентів в жовчі під впливом бомбезину, дотепер не з'ясовано характер дії пептиду на секрецію окремих жовчних кислот, вільних жирних кислот та тригліцеридів та екскрецію ефірів холестеролу, в умовах цілісного організму. Залишаються невивченими зміни гідроксилювання та кон'югації холатів під впливом бомбезину. Попри те, що встановлено взаємодію бомбезину і холінорецепторної й адренорецепторної регуляторних ланок, механізми такої співдії у реалізації ефекту пептиду на холерез не досліджені. Показано присутність бомбезинових рецепторів у печінці (Sano H., Feighner S.D., 2004) та встановлено участь бомбезинових рецепторів ІІ типу (ВВ2 рецепторів) у реалізації секреторних ефектів пептиду (Alvaro D., Gigliozzi A., 1997; Basso N., Giri S., 1975; Iwatsuki N. Petersen O. H., 1978; Fletcher D.R., Shulkes A., 1983), але на сьогодні їхню роль у реалізації регуляторної дії бомбезин-споріднених пептидів на холерез не з'ясовано. Недостатня дослідженість участі бомбезину в регуляції секреторної функції печінки та відсутність даних про механізми реалізації його впливу на жовчоутворення були визначальними при формулюванні загальної мети і конкретних завдань наших досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідних робіт відділу загальної фізіології НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка по темі: «Дослідити системні і молекулярні механізми регуляції моторної діяльності м'язів, секреторних процесів у шлунково-кишковому тракті і лімбічні механізми регуляції функціонального стану організму людини і тварин» (№ д/р 0101U002164); та темі біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка: «Дослідити системні, клітинні і молекулярні механізми діяльності нервової системи, внутрішніх органів і рухового апарату організму людини і тварин в нормі і патології» (№ д/р 0106U005751).

Мета і завдання дослідження - з'ясувати дію бомбезину на жовчосекреторну функцію печінки у щурів та встановити участь бомбезинових рецепторів ІІ типу, холіно- й адренорецепторів у реалізації ефектів пептиду на холерез в умовах цілісного організму.

Для досягнення цієї мети були визначені такі завдання:

- дослідити вплив бомбезину на рівень жовчоутворення;

- дослідити дію бомбезину на секрецію жовчних кислот, фосфоліпідів, вільних жирних кислот та тригліцеридів і виділення з жовчю холестеролу та його ефірів;

- дослідити дію бомбезину на об'ємну швидкість жовчоутворення та якісний склад секрету за умов застосування агоніста бомбезинових рецепторів ІІ типу гастрин-рилізинг пептиду та селективного антагоніста цих рецепторів D-Phe12-бомбезину;

- дослідити вплив бомбезину на інтенсивність секреції та хімічний склад жовчі у тварин з пригніченою функціональною активністю М-холінорецепторів та б- і в-адренорецепторів;

- дослідити особливості ефекту бомбезину на рівень холерезу та секрецію жовчних кислот у тварин різного віку.

Об'єкт дослідження - жовчоутворювальна функція печінки.

Предмет дослідження - вплив бомбезину на жовчосекреторну функцію печінки у щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше досліджена динаміка секреції жовчі, жовчних кислот, фосфоліпідів, вільних жирних кислот і тригліцеридів, транспорту холестеролу та його ефірів під впливом бомбезину на рівні цілісного організму. Встановлено, що досліджувана речовина при внутрішньопортальному введенні підвищує рівень холерезу, вміст і співвідношення в жовчі жовчних кислот та біліарних ліпідів. Вперше встановлено, що під впливом цього пептиду змінюється рівень синтезу, гідроксилювання і кон'югації холатів. У дослідах із застосуванням природного агоніста ІІ типу бомбезинових рецепторів гастрин-рилізинг пептиду та їх селективного антагоніста D-Phe12-бомбезину встановлено участь цих рецепторів у реалізації ефектів бомбезину на секрецію жовчі. В роботі вперше показано, що регуляторна дія бомбезину на жовчоутворення залежить від функціональної активності б- і в-адренорецепторів та М-холінорецепторів, а також досліджено вікові особливості дії пептиду.

Практичне значення одержаних результатів. З'ясування фізіологічних ефектів бомбезину, гастрин-рилізинг пептиду та антагоніста ІІ типу бомбезинових рецепторів D-Phe12-бомбезину на жовчоутворювальну функцію печінки та механізмів впливу цих речовин суттєво розширюють перспективу їхнього застосування у клініці. Зокрема, дані про те, що нейропептид бомбезин не порушує балансу основних міцелоутворюючих компонентів жовчі, не виступаючи таким чином літогенним фактором, уможливлюють клінічне застосування пептиду пацієнтам із захворюваннями гепато-біліарної системи. Крім того, важливо, що пептид підвищує виділення холестеролу з жовчю, тобто є антиатерогенним фактором. У процесі клінічної апробації біорегулятора варто врахувати, що за умов комбінованого застосування бомбезину та М-холінолітиків і адреноблокаторів холеретичний ефект пептиду не проявляється. Практичне значення мають також відомості про суттєві вікові відмінності у дії бомбезину на різні показники жовчоутворювальної функції печінки.

Отримані результати використовуються у навчальному процесі при читанні спеціального курсу лекцій для студентів кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Особистий внесок здобувача. Авторкою дисертаційної роботи проведено аналіз літератури за темою дисертації, підбір і оволодіння методами дослідження, виконання експериментальної частини дисертації, статистичну обробку результатів, їх аналіз та інтерпретацію. За участю наукового керівника поставлено мету та основні завдання дослідження, обговорено отримані результати та сформульовано загальні висновки.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень були представлені і обговорені на V Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів (Київ, 2005 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми вікової фізіології” (Луцьк, 2005 р.), ІІІ Всеукраїнській науковій конференції "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології" (Київ, 2006 р.), Міжнародній конференції "Regpep-2006" (Токіо, Японія, 2006 р.), З'їзді Федерації європейських фізіологічних товариств (Братислава, Словаччина, 2007 р.); VІІ Всеукраїнській конференції студентів та аспірантів (Київ, 2007 р.), ІV Міжнародній науковій конференції "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології" (Київ, 2008 р.), XXXVI Світовому конгресі фізіологічних наук "Функції живого: Елементи та взаємодія" (Кіото, Японія, 2009 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових робіт, із них 3 статті в фахових виданнях та 8 тез доповідей.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, узагальнень та висновків. Список використаної літератури містить 235 найменувань. Робота викладена на 171 сторінці основного об'єму, ілюстрована 75 рисунками і 41 таблицею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Дослідження жовчоутворення під впливом бомбезину були проведені в гострих спробах на 84 самцях лабораторних білих щурів. В дослідженнях використовувались препарати: пептиди бомбезинової родини - бомбезин, БН, (Sigma, USA); ендогенний агоніст ІІ типу бомбезинових рецепторів гастрин-рилізинг пептид, ГРП, (Sigma, USA); антагоністи - селективний антагоніст бомбезинових рецепторів ІІ типу D-Phe12-бомбезин, D-Phe12-БН, (Sigma, USA); антагоніст М-холінорецепторів атропін (Київ "Здоров'я", Україна); комбінований антагоніст б- та в-адренорецепторів карведилол (Genom Biotech PVT Ltd., India). Гострі досліди на щурах проводились після 18-годинного голодування тварин з вільним доступом до води. Тварин наркотизували внутрішньочеревним введенням тіопенталу натрію (5 мг/100 г маси тіла тварини), фіксували в положенні на спині, розтинали черевну стінку і у відпрепаровану загальну жовчну протоку вводили тонку канюлю, з'єднану поліетиленовою трубкою з мікропіпеткою, в яку збирали жовч. Досліджувані речовини вводили внутрішньопортально за допомогою катетера. Впродовж досліду збирали 5 півгодинних проб жовчі, враховуючи її об'єм (в мікролітрах). Об'ємну швидкість холерезу розраховували в мкл/г маси тіла тварини за 30 хв.

У першій серії дослідів двом окремим групам зрілих щурів (12 місяців) у ворітну вену вводили бомбезин у дозі 1 мкг /100 г маси тіла або гастрин-рилізинг пептид в дозі 2 мкг/100 г маси тіла, розчинені у фізіологічному розчині (із розрахунку об'єму 0,1 мл на 100 г маси тіла тварини). Контролем для цих досліджень слугували тварини, яким внутрішньопортально вводили відповідний об'єм фізіологічного розчину.

В другій серії експериментів вивчали зміни рівня жовчоутворення і хімічного складу жовчі у зрілих щурів під впливом бомбезину та гастрин-рилізинг пептиду за умов блокади бомбезинових рецепторів ІІ типу селективним антагоністом D-Phe12-бомбезином, який вводили внутрішньопортально в дозі 10 мкг/100 г маси тіла тварини за 10 хвилин до застосування пептиду. Контролем при цьому слугували тварини з окремо введеним пептидом.

В третій серії експериментів досліджували участь М-холіно- та б- та в-адренорецепторів у реалізації ефекту бомбезину на холерез. Для цього двом окремим групам зрілих тварин внутрішньопортально вводили бомбезин у вищезазначеній дозі на фоні внутрішньочеревного введення атропіну у дозі 0,15 мг/100 г маси тіла тварини або внутрішньопортального введення блокатора б- та в-адренорецепторів карведилолу в дозі 0,1 мг/100 г маси тіла тварини за 10 хвилин до застосування пептиду. Контролем у цій серії експериментів слугували щурі із окремо введеним бомбезином.

Четверта серія експериментів, присвячена з'ясуванню вікових особливостей дії бомбезину на холерез у щурів, об'єднувала досліди із уведенням пептиду в дозі 1 мкг/100 г маси тіла тваринам ювенільного (статево не зрілого) віку (2-4 місяці, масою 130-175 г), зрілим (12 місяців, масою 220-270 г) та старим щурам віком 24 місяці і більше, масою 330-370 г (Фролькис В.В., 1982; Западнюк И.А. Западнюк В.И., 1983). Отримані дані порівнювали із показниками тварин відповідної вікової категорії без пептидного навантаження (внутрішньопортальне введення фізіологічного розчину).

В кожній відібраній пробі жовчі методом тонкошарової хроматографії визначали концентрацію (в мг%) окремих жовчних кислот (Весельський С.П. і співавт., 1991), фосфоліпідів, холестеролу та його ефірів, вільних жирних кислот, тригліцеридів (Весельський С.П. і співавт., 2001). На основі визначених концентрацій досліджуваних речовин у пробах жовчі розраховували дебіт цих складових. Кількість і хімічний склад жовчі, одержаної після застосування досліджуваних речовин, порівнювали з такими контрольних дослідів.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за допомогою пакету програм «Statistiсa 6.0» з використанням t-критерію Ст'юдента, оскільки дані мали нормальний розподіл при їх перевірці за допомогою тесту Шапіро-Уілка. Статистично значущими вважалися відмінності між контролем і дослідом при p<0,05.

Дослідження на тваринах проведені з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей. Прилади, які використовувались для наукових досліджень, пройшли метрологічний контроль.

Результати дослідження та їх обговорення

Вплив бомбезину на жовчоутворення. У контрольних дослідах печінка щурів секретувала жовч безперервно та нерівномірно. Об'ємна швидкість холерезу та вміст в секреті жовчних кислот з перебігом контрольних спроб не були стабільними і знижувалися до кінця досліду, що узгоджується із даними літератури про спонтанне жовчоутворення у щурів (Весельський С.П., Макарчук М.Ю., 2007).

Проведені експерименти показали, що у щурів бомбезин (1 мкг/100 г маси тіла) збільшував об'ємну швидкість холерезу порівняно із такою у тварин контрольної групи (рис.1).

Так, статистично значущо рівень холерезу зріс за першу півгодинну пробу на 46,4% (р<0,05), за четверту - на 18% (р<0,05) і за останню - на 23,2% (р<0,05). Блокатор ІІ типу бомбезинових рецепторів D-Phe12-бомбезин усував дію пептиду на секрецію жовчі. Зазначимо, що ендогенний агоніст цих рецепторів гастрин-рилізинг пептид істотніше підвищував об'ємну швидкість холерезу (на 62,8%, p<0,01; 34,0%, p<0,01; 46,9%, p<0,001; 41,9%, p<0,01; 52,0%, p<0,001 у кожній пробі відповідно), проте й ефект цього регулятора більшою мірою усувався D-Phe12-бомбезином.

Біохімічний аналіз жовчі показав, що під впливом бомбезину змінювалась як концентрація, так і загальний вміст жовчних кислот у жовчі щурів, в більшості проб достовірно збільшуючись (табл.1).

Таблиця 1

Вміст жовчних кислот (M±m) у жовчі щурів під впливом бомбезину (1 мкг/100 г маси тіла) та після введення антагоніста ІІ типу бомбезинових рецепторів D-Phe12-бомбезину (10 мкг/100 г маси тіла); n=6

Примітка: ^*- p<0,05; ^**- p<0,01; ^***- p<0,001 щодо контролю; ^# - р<0,05; ^## - р<0,01; ^### - р<0,001 щодо бомбезину; n - кількість тварин у вибірці; К - контроль; БН - бомбезин; D-Phe12-БН+БН - бомбезин на фоні дії D-Phe12-бомбезину

В цілому за весь дослід дебіт таурохолевої кислоти (ТХК) зріс на 33,5 % (р<0,05), а вміст тауродиоксихоланових кислот (ТХДХК+ТДХК) - на 30,8% (р<0,05). Дебіт глікохолевої кислоти (ГХК) перевищував контроль на 53,6% (p<0,01), а загальний вміст глікодигідроксихолатів (ГХДХК+ГДХК) був вищим від контролю на 270% (p<0,001). Зміни дебіту окремих вільних холатів (ХК, ХДХК+ДХК) не були статистично значущими, хоча загалом під впливом бомбезину некон'югованих жовчних кислот виділилося на 31,2% (р<0,05) більше порівняно із контролем. Після застосування бомбезину на фоні дії блокатора ІІ типу бомбезинових рецепторів загальний дебіт ТХК, глікокон'югованих холатів та вільної холевої кислоти був меншим порівняно із таким при дії самого лише пептиду на 26,3% (р<0,05), 40,0% (р<0,05) і 30,4% (р<0,05) відповідно, а вміст тауродигідроксихолатів і некон'югованих хенодезоксихолевої та дезоксихолевої кислот вірогідно не змінювався.

Слід зазначити, що після застосування гастрин-рилізинг пептиду дебіт таурохолатів перевищував контроль на 87,4% (р<0,05), вміст глікокон'югованих жовчних кислот був більшим на 95,5% (р<0,001), а секреція вільних жовчних кислот зросла на 38,5% (р<0,05). При цьому дебіт глікодигідроксихолатів збільшився порівняно з контрольним значенням на 423,2% (р<0,001). При дії ГРП на фоні пригніченої функціональної активності ВВ2 рецепторів сумарний за дослід вихід жовчних кислот був на 32,6-53,5% (р<0,05; р<0,01) меншим, ніж під впливом самого агоніста, хоча дебіт глікокон'югованих диоксихолатів статистично значущо не змінювався.

Таким чином, бомбезин стимулює секрецію таурокон'югованих жовчних кислот шляхом активації ВВ2 рецепторів. Стимулююча дія пептиду на секрецію глікохолевої кислоти також здійснюється за участю цих рецепторів. Проте вплив бомбезину на секрецію глікокон'югованих дигідроксихолатів опосередковується цими рецепторами лише частково.

Під впливом бомбезину статистично значущо підвищується концентрація вільних жовчних кислот та їх кон'югованих форм. Результати наших досліджень показали, що бомбезин впливає на інтенсивність зв'язування холатів із таурином та гліцином. Цей вплив здійснюється, очевидно, без участі бомбезинових рецепторів ІІ типу, про що свідчать дані, отримані при застосуванні їх селективних агоніста та антагоніста. Проте вплив бомбезину на інтенсивність синтезу вільних холатів здійснюється за участю ВВ2 рецепторів і має гальмівний характер.

На підставі зниження під впливом бомбезину коефіцієнта гідроксилювання, а також його змін за умов застосування селективних лігандів ІІ типу бомбезинових рецепторів, можна припустити гальмівний вплив бомбезину на альтернативний шлях біосинтезу холатів, що реалізується за участю ВВ2 рецепторів. Вплив даного пептиду на інтенсивність гідроксилювання холатів, ймовірно, здійснюється за участю інших механізмів.

Під впливом бомбезину спостерігались зміни вмісту основних фракцій ліпідів жовчі. Загалом за 2,5 години досліду на 64,2% (p<0,01) та 70,0% (p<0,001) більше ніж в контролі секретувалось фосфоліпідів (ФЛ) та вільних жирних кислот (ВЖрК), на 114,4% (р<0,001) та 135,2% (p<0,01) більше екскретувалося холестеролу (ХС) та його ефірів (ЕХС), а тригліцеридів (ТГ) вивільнилось на 28,0% (p<0,01) менше (рис.2). Після введення бомбезину на фоні дії антагоніста ВВ2 рецепторів дебіт фосфоліпідів був меншим від такого при дії самого пептиду на 38,7% (p<0,05), вміст холестеролу - на 46,5% (p<0,01), а такий ефірів холестеролу - на 39,7% (p<0,05).

Загальний вміст тригліцеридів підвищився на 48,2% (p<0,05), а секреція ВЖрК вірогідно не змінювалася.

Слід зазначити, що при дії ГРП секреція ліпідних компонентів, у тому числі й тригліцеридів, зростала більш істотно. Вплив цього пептиду щодо фосфоліпідів, холестеролу та вільних жирних кислот усувався дією D-Phe12-бомбезину більшою мірою, аніж в дослідах з бомбезином. Секреція ж ТГ за таких умов знижувалася на відміну від її посилення під впливом бомбезину. Отже, ІІ тип бомбезинових рецепторів залучений як до реалізації стимулюючого впливу бомбезину на секрецію ФЛ, холестеролу та його ефірів і ВЖрК, так і до здійснення гальмівного ефекту на синтез ТГ.

Результати наших досліджень показали, що під впливом бомбезину підвищення рівня холерезу супроводжувалось статистично значущим збільшенням концентрації етерифікованого холестеролу при менш помітному збільшенні такої вільного, що призвело до зменшення коефіцієнта етерифікації холестеролу. Поряд з цим, вірогідно збільшилась концентрація фосфоліпідів у жовчі, які разом із жовчними кислотами підвищують здатність утримувати холестерол у розчиненому стані, попереджуючи його нуклеацію у водній фазі секрету. Зазначимо, що ні під впливом бомбезин-споріднених пептидів, ні при дії блокатора бомбезинових рецепторів не спостерігалося патологічних порушень співвідношення міцелоутворюючих компонентів жовчі, про що свідчать значення показника потенційної здатності холестеролу до кристалізації.

Ймовірним механізмом диверсифікації ефектів бомбезину на різні показники холерезу може бути дія пептиду "каскадним" способом, де результат залежить від низки інших біорегуляторів, які вивільняються у кров під впливом досліджуваної речовини (Ашмарин И.П., Обухова М.Ф., 1986; Ашмарин И.П., 1996). Зокрема, показано, що бомбезин стимулює продукцію холецистокініну, гастрину, глюкагону (Romanski K.W., Bochenek W.J., 1983) та інсуліну (Jones R.S., 1976). Кінцевий ефект бомбезину, мабуть, залежить і від активації конкретного типу G білків, як-от G_q або G_i/o форм (Jian X. et al., 1999). Цілком можливо, що перелічені вище регуляторні чинники спрацьовують і в гепатоцитах.

Участь М-холіно- та б- і в- адренорецепторів у реалізації ефектів бомбезину на холерез. З метою з'ясування участі М-холіно- та б- і в- адренорецепторів у реалізації ефекту бомбезину на холерез ми дослідили його вплив на жовчоутворення за умов блокади М-холінорецепторів атропіном та на фоні дії комбінованого б- і в- адреноблокатора карведилолу. Результати наших досліджень показали, що після застосування бомбезину на фоні дії атропіну об'єм кожної проби секретованої жовчі знизився на 48-51% (р<0,05; р<0,01; р<0,001) порівняно із дією бомбезину, застосованого окремо. За умов дії карведилолу досліджуваний пептид не проявляв свого стимулюючого ефекту повною мірою, про що свідчить зниження рівня холерезу у першій пробі на 39,8% (р<0,01), в третій на 47,7% (р<0,01), а в останню півгодину 53,8% (р<0,01) від такого в дослідах без фармакологічного впливу на адренорецептори (рис.3).

Біохімічний аналіз жовчі (табл.2) показав, що загальний за дослід дебіт ТХК під впливом бомбезину на фоні дії атропіну був меншим від такого при окремому введенні пептиду (контроль) на 55,8% (р<0,001), а за умов попереднього застосування карведилолу - на 45,9% (р<0,01).

Таблиця 2

Дебіт жовчних кислот (M±m) у жовчі щурів під впливом бомбезину (1 мкг/100 г маси тіла) на фоні дії атропіну (0,2 мг/100 г маси тіла) та карведилолу (0,1 мг/100 г маси тіла); n=6

Примітка: ^* - p<0,05; ^** - p<0,01; ^*** - p<0,001 щодо бомбезину; n - кількість тварин у вибірці; БН - бомбезин; А+БН - бомбезин на фоні дії атропіну; КВ+БН - бомбезин на фоні дії карведилолу

Зміни секреції тауродиоксихолатів при дії бомбезину на фоні пригніченої активності М-холіно- та б- і в- адренорецепторів порівняно з окремо застосованим пептидом не мали статистичної значущості. Дебіт ГХК за таких умов досліду був меншим від контрольного на 63,6% (р<0,001) при дії М-холінолітика та на 60,9% (р<0,001) після введення симпатолітика. Загальний вихід глікодигідроксихоланових кислот під впливом бомбезину на фоні дії як атропіну, так і карведилолу також був меншим щодо пептиду, застосованого окремо, на 70,7% (р<0,001) та 52,7% (р<0,01) відповідно. Бомбезин на фоні дії атропіну зумовив зменшення дебіту вільної ХК на 29,2% порівняно із дослідами без участі холіноблокатора, а попереднє введення карведилолу спричинило зниження секреції цієї кислоти на 76,7% (р<0,001). При дії пептиду на фоні холінолітика дебіт ХДХК+ДХК збільшився щодо впливу самого бомбезину на 69,2% (р<0,01), а після введення карведилолу він був меншим від контролю на 62,8% (р<0,001). За весь час досліду при послідовному застосуванні атропіну та бомбезину таурохолатів секретувалося на 56,5% (р<0,001), глікохолатів - на 64,7% (р<0,001) менше порівняно із дією лише пептиду, а вихід сумарних вільних жовчних кислот вірогідно не змінився. При цьому на фоні дії карведилолу дебіти цих кислот були відповідно на 35,0% (р<0,01), 59,6% (р<0,001) та 73,5% (р<0,001) меншими від контролю.

Отже, результати наших досліджень показали, що сумарний вміст кон'югованих жовчних кислот під впливом бомбезину, введеного на фоні дії блокаторів М-холіно- або б- і в- адренорецепторів, був статистично значущо меншим за такий при окремому введенні пептиду. При цьому атропін істотніше пригнічував стимулюючий ефект бомбезину на секрецію тауро- та глікохолатів, а дебіт вільної холевої кислоти змінювався більш істотно на фоні дії карведилолу. Разом з тим на фоні дії атропіну посилювався ефект пептиду щодо некон'югованих диоксихолатів, а карведилол навпаки його усував.

Під впливом бомбезину на фоні дії атропіну або карведилолу дебіт ліпідних компонентів жовчі змінювався односпрямовано (рис.4).

Так, вміст фосфоліпідів зменшувався на 39,3% (р<0,05) та 66,8% (р<0,001), холестеролу - на 52,6% (р<0,01) і 71,9% (р<0,001), ефірів холестеролу - на 36,4% (р<0,05) та 61,2% (р<0,01) і вільних жирних кислот - на 37,0% (р<0,01) та 57,0% (р<0,001) відповідно. Дебіт тригліцеридів за умов попереднього введення атропіну був нижчим на 71,0% (р<0,01), а на фоні дії карведилолу вірогідно не змінився порівняно із виключно пептидним навантаженням (рис.4). Тобто карведилол суттєвіше модифікував вплив бомбезину на синтез ФЛ, ХС, ЕХС і ВЖрК, а М-холінолітик більшою мірою впливав на дію пептиду щодо тригліцеридів.

Таким чином, отримані нами результати свідчать, що регуляторні впливи бомбезину на різні ланки жовчоутворення залежать від функціональної активності М-холіно- та б- і в- адренорецепторів, які залучені до реалізації як стимулюючих ефектів пептиду, так і гальмівних.

Вікові особливості регуляторної дії бомбезину на секрецію жовчних кислот. При постановці контрольних дослідів було показано, що у ювенільних та старих тварин об'ємна швидкість холерезу та дебіт вільних холатів були вірогідно меншими, ніж у зрілих щурів. Таке явище у пубертатних тварин пояснюється неспроможністю незрілого організму забезпечити достатню кількість енергії для адекватного жовчоутворення (Beath S.V., 2003), а у старих тварин є результатом зменшення кількості гепатоцитів з віком (Annoni G., Galiano N., 2003), зниження активності їх ферментних систем (Aspinall R., 2003), а також зниження печінкового кровотоку (Zoli M., Magalotti D., Bianchi G., 1999). Тобто, зміни холерезу є прямим наслідком старіння функціонального апарату печінки.

Проведені експерименти із введенням бомбезину щурам трьох вікових груп показали, що пептид неоднаково впливає на секрецію жовчних кислот. Зокрема, у ювенільних тварин бомбезин вірогідно не змінював загальний дебіт кон'югованих холатів, хоча вміст ТХК перевищував контроль на 100,1% (р<0,05), а дебіт ГХК - на 143% (р<0,05). Разом з тим вміст сумарних вільних жовчних кислот вірогідно перевищував показники контролю: на 251,5% (р<0,001) для ХК та на 189,3% (р<0,01) для ХДХК+ДХК. У старих тварин зміни секреції таурохолатів, глікодигідроксихолатів та некон'югованих жовчних кислот статистично значущими не були, тоді як дебіт ГХК під впливом бомбезину був меншим на 57,2% (р<0,01) щодо контролю (рис.5).

Отже, на підставі отриманих даних можна резюмувати, що бомбезин максимально стимулює секрецію холатів у пубертатних тварин. У той же час у старих особин пептид пригнічує біосинтез окремих фракцій жовчних кислот. Крім того, у ювенільних тварин бомбезин не впливає на інтенсивність кон'югації жовчних кислот, тоді як у старих щурів цей пептид пригнічує зв'язування холатів із таурином та гліцином.

Також у пубертатних тварин бомбезин посилює гідроксилювання холатів та, ймовірно, активує класичний (нейтральний) шлях їх біосинтезу, а у старих щурів пептид гальмує гідроксилювання жовчних кислот і, можливо, не впливає на активність ключових ферментів як класичного, так і альтернативного (кислого) шляхів утворення холатів.

ВИСНОВКИ

Вперше комплексним експериментальним дослідженням показана важлива роль нейропептиду бомбезину в нейро-гуморальній регуляції жовчоутворювальної функції печінки. Під впливом бомбезину і споріднених з ним пептидів змінюється як об'ємна швидкість жовчоутворення, так і вміст в жовчі органічних компонентів.

1. Бомбезин бере участь в нейрогуморальній регуляції зовнішньосекреторної функції печінки, впливаючи на об'ємну швидкість жовчоутворення та біохімічний склад жовчі, проявляючи таким чином холеретичні властивості.

2. Бомбезин впливає на процеси синтезу і секреції жовчних кислот в клітинах печінки, збільшуючи абсолютний вміст в жовчі як вільних, так і кон'югованих жовчних кислот. Підтвердженням цього є зміни значень коефіцієнтів кон'югації та гідроксилювання холатів.

3. Бомбезин регулює синтез та виділення з жовчю ліпідних компонентів, не порушуючи при цьому балансу основних міцелоутворюючих фракцій. Про це свідчать зміни показника потенційної здатності холестеролу до кристалізації.

4. Стимулюючий ефект бомбезину на рівень жовчоутворення, секрецію жовчних кислот та фосфоліпідів, холестеролу і його ефірів, а також вільних жирних кислот та гальмівна дія пептиду на секрецію тригліцеридів реалізується через ІІ тип бомбезинових рецепторів.

5. Регуляторний вплив бомбезину на жовчоутворення залежить від функціональної активності М-холінорецепторів і б- та в-адренорецепторів. Про це свідчить пригнічення атропіном та карведилолом холесекреторної відповіді печінки на введений пептид.

6. Жовчосекреторна відповідь печінки на введений бомбезин залежить від віку щурів. Найбільш виражене збільшення рівня холерезу та секреції жовчних кислот під впливом бомбезину спостерігається у зрілих тварин, порівняно з ювенільними та старими.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив бомбезину на жовчну секрецію у щурів / Мороз О.Ф., Лященко Т.П., Весельський С.П. [та ін.] // Вісник Волинського державного університету. - 2006. - №5. - С. 43-46. (Здобувач - проведення експериментів та підготовка матеріалу до друку; Лященко Т.П. - ідея дослідження, загальне редагування; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі; Макарчук М.Ю. - загальне редагування).

2. Жовчоутворювальна функція печінки у щурів різного віку / Мороз О.Ф., Можеїтова О.А., Нурищенко Н.Є. [та ін.] // Вісник Київського національного університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. -2007. - №12. - С. 16-17. (Здобувач - проведення експериментів та підготовка матеріалу до друку; Можеїтова О.А. - статистична обробка результатів; Лященко Т.П. - ідея дослідження; Нурищенко Н.Є. - загальне редагування).

3. Зміни співвідношення ліпідних компонентів жовчі щурів при застосуванні нейропептиду бомбезину / Мороз О.Ф., Весельський С.П., Лященко Т.П. [та ін.] // Український біохімічний журнал. - 2009. - т. 81, № 1. - С. 52-58. (Здобувач - літературний пошук, проведення експериментів, статистична обробка результатів та підготовка матеріалу до друку; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі; Лященко Т.П. - інтерпретація результатів; Нурищенко Н.Є. - ідея дослідження, загальне редагування).

4. Фур О.Ф. Співвідношення вмісту жовчних кислот у жовчі щурів різного віку / Фур О.Ф., Лященко Т.П., Весельський С.П. // Матеріали V Всеукраїнської конференції студентів та аспірантів. - Київ, 2005. - С. 110-111. (Здобувач - проведення експериментів, статистична обробка результатів; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі, інтерпретація результатів; Лященко Т.П. - ідея дослідження, загальне редагування).

5. Вікові особливості жовчосекреторної функції печінки у щурів / Фур О.Ф., Лященко Т.П., Весельський С.П. [та ін.] // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції “Проблеми вікової фізіології”. - Луцьк, 2005. - С. 151-152. (Здобувач - аналіз літератури та підготовка матеріалу до друку; Лященко Т.П. - інтерпретація результатів, загальне редагування; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі; Можеїтова О.А. - статистична обробка результатів).

6. Мороз О.Ф. Вплив бомбезину на секрецію жовчі у щурів / Мороз О.Ф., Весельський С.П., Лященко Т.П. // "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології". Тези доповідей ІІІ Всеукраїнської наукової конференції. - К. : "Знання України" - 2006. - С. 95. (Здобувач -проведення експериментів; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі, інтерпретація результатів; Лященко Т.П. - ідея дослідження, загальне редагування).

7. Influence of cholinergic blockade on bombesin regulation of bile formation in rat liver / Moroz O., Veselsky S., Lyaschenko T. [et al.] // Regulatory Peptides. - 2006. - Vol. 135. - P. 145-146. (Здобувач - проведення експериментів, підготовка матеріалу до друку; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі; Лященко Т.П. - ідея дослідження, інтерпретація результатів; Макарчук М.Ю. - загальне редагування).

8. Мороз О.Ф. Участь нейропептиду бомбезину у регуляції жовчосекреторної функції печінки щурів / Мороз О.Ф. // Матеріали VІІ Всеукраїнської конференції студентів та аспірантів. - Київ, 2007. - C. 57-59.

9. Bombesin influence on bile lipid composition in rat / Moroz O., Veselsky S., Lyaschenko T. [et al.] // Acta Physiologica. - 2007. - Vol. 191, Suppl. 658. - P. 39. (Здобувач - проведення експериментів; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі, інтерпретація результатів; Лященко Т.П. - загальне редагування; Нурищенко Н.Є. - ідея дослідження, загальне редагування).

10. Мороз О.Ф. Вплив бомбезин-подібних пептидів на рівень секреції жовчі у щурів / Мороз О.Ф., Лященко Т.П., Нурищенко Н.Є. // ІV Міжнародна наукова конференція "Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і патології". Тези доповідей. - К. : "Знання України". - 2008. - С. 134. (Здобувач - підготовка матеріалів до друку; Лященко Т.П. - інтерпретація результатів; Нурищенко Н.Є. - ідея дослідження, загальне редагування).

11. Bombesin-like peptides change secreted bile volume and the output of bile acids into the rat bile / Moroz O., Lyaschenko T., Veselsky S. [et al.] // Journal of Physiological Sciences. - 2009. - Vol. 59, Suppl. 1. - P. 388. (Здобувач -проведення експериментів, статистична обробка результатів; Весельський С.П. - біохімічний аналіз жовчі; Лященко Т.П. - інтерпретація результатів; Нурищенко Н.Є. - ідея дослідження, загальне редагування).

АНОТАЦІЇ

Мороз О.Ф. Участь бомбезину у регуляції жовчосекреторної функції печінки щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертація присвячена дослідженню впливу нейропептиду бомбезину на жовчоутворення. У гострих спробах на щурах з канюльованою загальною жовчною протокою досліджено вплив пептиду на об'ємну швидкість холерезу, вміст в жовчі вільних і кон'югованих жовчних кислот та основних фракцій ліпідів. Показано, що бомбезин в дозі 1 мкг/100 г маси тіла збільшує об'єм секретованої жовчі, вміст у ній кон'югованих жовчних кислот, фосфоліпідів, холестеролу та його ефірів, вільних жирних кислот. При цьому пептид пригнічує секрецію вільних диоксихолатів та тригліцеридів. Такі зміни кількісного складу жовчі покращують її емульгуючі та солюбілізуючі властивості і не порушують балансу основних міцелоутворюючих компонентів. Показано, що на фоні блокади ІІ типу бомбезинових рецепторів бомбезин не проявляє свого холеретичного ефекту, тоді як гальмівна дія пептиду потенціюється, що свідчить про участь цього типу рецепторів в реалізації впливу бомбезину на жовчоутворення. Встановлено, що регуляторна дія бомбезину на секрецію жовчі залежить від функціонального стану М-холінорецепторів та б- і в-адренорецепторів. Показано, що бомбезин найбільш інтенсивно проявляє свою дію на холерез у ювенільних тварин, пригнічуючи при цьому секрецію деяких жовчних кислот у старих щурів.

Ключові слова: бомбезин, жовчоутворення, жовчні кислоти, фосфоліпіди, холестерол, ефіри холестеролу, ІІ тип бомбезинових рецепторів.

Мороз О.Ф. Участие бомбезина в регуляции желчесекреторной функции печени. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию влияния бомбезина на желчеобразование. В острых опытах на крысах с канюлированным общим желчным протоком показаны влияния пептида на объемную скорость желчеотделения, содержание свободных и конъюгированных желчных кислот и основных фракций липидов. Установлено, что бомбезин в дозе 1 мкг/100 г массы тела увеличивает объем секретированной желчи, дебитов в ней конъюгированных желчных кислот, фосфолипидов, холестерола и его эфиров, свободных жирных кислот. При этом пептид угнетал секрецию свободных холатов и триглицеридов. Такие изменения количественного состава желчи улучшают ее солюбилизирующие и емульгирующие свойства и не нарушают баланс основных мицеллообразующих компонентов. Показано, что на фоне блокады ІІ типа бомбезиновых рецепторов холеретический эфект бомбезина не наблюдается, но угнетающее влияние потенцируется, что свидетельствует об участии этого типа рецепторов в реализации влияния бомбезина на желчеобразование. Показано, что влияние бомбезина на желчеобразование зависит от функциональной активности М-холино и б- и в- адренорецепторов. Установлено, что бомбезин наиболее интенсивно проявляет свое влияние на холерез у ювенильных животных, угнетая при этом секрецию некоторых желчных кислот у старых крыс.

Ключевые слова: бомбезин, желчеобразование, желчные кислоты, фосфолипиды, холестерол, эфиры холестерола, ІІ тип бомбезиновых рецепторов.

Moroz O.F. Effect of bombesin on bile formation in the rat liver. - A manuscript.

Dissertacion for the candidate biological science degree in speciality 03.00.13 - human and animal physiology. - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2009.

The thesis deals with the results of experimental studies about the effect of the neuropeptide bombesin on bile formation. The studies about the choleresis level and chemical compositions of bile under the effect of this peptide conducted in acute experiments in common bile duct cannulated rats. The effect of bombesin on bile volume, free and conjugated bile acids, biliary lipid components content is shown.

It was established that bombesin after intraportal administration at the dose of 1 мg/100 g rat's body weight enhances biliary secretion of the liver. Bombesin stimulates the choleresis volume velocity and increases the absolute content of bile acids and lipids.

In rats bombesin increases biliary concentration and output of tauro- and glycoconjugated bile acids, free cholic acid that was followed by decreasing of the total amount of unconjugated dihydroxycholates. These results and also the conjugation index calculation proved bombesin influence on bile acids conjugation with amino acids. After peptide administration the trihydroxy- to dihydroxycholate ratio has changed. Cholic acid secretion was more intensive than that of dihydroxycholates. Taking in mind that hydroxylation intensity changing give us the possibility to speculate about bombesin effects on the mode of bile acids biosynthesis (acidic or alternative either neutral or classic) our results show that in rat liver the neutral way of bile acids synthesis dominates in case of bombesin-stimulated secretion.

It is noticeable that bombesin after blocking of BB2 bombesin receptors with D-Phe-12-bombesin shows lesser stimulative effect on conjugated cholates and free cholic acid secretion as well as on the output of phospholipids, free fatty acids and transport of cholesterol and its ethers but more potent inhibitive action on unconjugated chenodeoxycholic acid and triglycerides, than the effect of peptide alone. In experiments with the selective agonist of BB2 bombesin receptors gastrin-releasing peptide the more potent stimulation of bile acids secretion and biliary lipid components output that followed much more intensive bile flow was observed. This fact clears the role of BB2 bombesin receptors in realization of bombesin effects in bile formation.

Bombesin significantly enhances phospholipids and free fatty acids secretion, and also intensifies cholesterol and its ethers transport while inhibits triglycerides secretion. The output elevation of phospholipids which are necessary for cholesterol stabilization in the water phase of bile and also the biliary quantity of cholesterol ethers and free fatty acids suggest the activation of etherification process in hepatocytes. These changes improve emulgative and solubilising properties of bile and also do not impair the balance of main micelle forming components that is proved by index of potential cholesterol crystallization capacity. In case of biliary lipids secretion bombesin acts via the II bombesin receptors subtype too.

It is revealed that bombesin influence on bile secretion depends upon the functional activity of M-cholinergic and б- and в-adrenergic receptors. In the experiments with atropine and carvedilol significant decrease in the secreted bile volume, total amount of cholic and conjugated bile acids, phospholipids, free fatty acids, quantity of excreted cholesterol and its ethers were observed. It is worth mentioning that M-acetylcholine receptors mediate strengthening of inhibitive bombesin effect on free chenodeoxycholic acids and triglycerides secretion. Obtained data show that bombesin-stimulated secretion of conjugated bile acids and triglycerides mostly depends upon the functional activity of M-acetylcholine receptors. In contrary the biliary secretion of unconjugated cholates, phospholipids and free fatty acids as well as the excretion of cholesterol and its ethers is affected after adrenoreceptors blocade.

This study shows the age-dependent particularities of bombesin effect on secreted bile volume and bile acids output. Bombesin-stimulated tauroconjugated bile acids, glycocholic acid and unconjugated cholates secretion was more intensive in juvenile rats than in animals of mature or old age. Absolute biliary amount of glycodihydroxycholates was higher in mature rats than in juveniles. To the contrast in old animals this peptide inhibits secretion of bile acids conjugated with glycine and chenodeoxycholic acid.

Key words: bombesin, bile formation, bile acids, phospholipids, cholesterol, cholesterol esters, BB2 bombesin receptors.

Размещено на Allbest.ru