Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут біології тварин УААН

УДК 616-003.811:619:636.2

БІОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ПРІОН-ПРОТЕЇНУ ЗА НОРМИ ТА ПАТОЛОГІЇ

03.00.04 -- біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

СТАДНИК Віталій Віталійович

Львів 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.

Науковий керівник Ї доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Влізло Василь Васильович, Інститут біології тварин УААН, директор інституту, керівник НВЦ з вивчення пріонних інфекцій.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Луцик Максим Дмитрович, Інститут біології клітини НАН України, провідний науковий співробітник відділу регуляції проліферації та апоптозу;

доктор біологічних наук, професор Сибірна Наталія Олександрівна, Львівський національний університет ім. Івана Франка, завідувач кафедри біохімії.

Захист дисертації відбудеться “20“ січня 2009 р. о 10 ⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01. в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

Автореферат розісланий “18” грудня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пріонні інфекції, або трансмісивні спонгіформні енцефалопатії (ТСЕ) - це група летальних нейродегенеративних хвороб, які характеризуються вибірковим ураженням центральної нервової системи (ЦНС). Збудником пріонних інфекцій є білок, який було названо пріоном (Prusiner S.B. et al., 1982).

В останні роки з'явилися нові, нетипові форми ТСЕ, зокрема губчастоподібна амілоїдна енцефалопатія великої рогатої худоби (ГАЕ ВРХ), яка характеризується особливостями клінічного перебігу та розвитком патологічних змін у мозку (Biacabe A., 2004; Влізло В.В зі співавт., 2008). Проте молекулярні властивості штаму, який викликає ГАЕ ВРХ вивчені ще недостатньо, не існує інформативних методів диференційної діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби (ГЕ ВРХ) та ГАЕ ВРХ.

Окремим питанням, яке потребує вирішення, є проблема особливостей вивчення вмісту фізіологічного пріона (PrP^C) та його ізоформ і способів впливу на нього. Багато дослідників зосередилися на вивченні патологічного пріона (PrP^SC), забуваючи, що саме фізіологічний пріон є тим необхідним компонентом, без якого розвиток інфекції неможливий. Зараз виводять трансгенних тварин, у яких відсутній ген пріона. Отримано велику рогату худобу, нокаутну за геном Prnp (Richt J. et al., 2007). Однак повна відсутність PrP^C - білка, який є необхідним для нормального функціонування організму, може негативно впливати на здоров'я тварин. Сьогодні можливими для широкого застосування могли би бути препарати, які частково знижують рівень фізіологічного пріона. З одного боку, це позбавляє патологічний пріон достатньої кількості матеріалу, необхідного для реплікації, а з іншого Ї забезпечує нормальне виконання фізіологічним пріоном своїх функцій. Таким чином, ці препарати можуть стати засобом для профілактики ТСЕ. Саме тому у нашій роботі вивчалися сполуки, здатні зменшувати рівень фізіологічного пріона, передусім у центральній нервовій системі (ЦНС).

Зв'язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною планової наукової тем: «28. 03/017-01. Вивчення етіологічних факторів і біологічних механізмів розвитку пріонних хвороб, розробка методів ранньої діагностики трансмісивних спонгіформних енцефалопатій у тварин» та «37.01/046. Вивчити дію деяких хімічних препаратів на експресію пріона, етіологічні чинники, що спричиняють розвиток пріонних інфекцій та розробити методи їх діагностики» Науково-виробничого центру з вивчення пріонних інфекцій Інституту біології тварин УААН (№ Держреєстру 0105U006969, договір 81/2). У ній автор досліджував загальний рівень фізіологічного пріона та його ізоформ у головному мозку великої рогатої худоби і різних відділах центральної нервової системи лабораторних тварин. У рамках цієї теми проводилося дослідження впливу сульфатованих поліаніонів на рівень фізіологічного пріона та його ізоформ у ЦНС лабораторних тварин.

Мета і завдання досліджень. Мета дисертаційної роботи - з'ясувати особливості експресії пріон-протеїна та його ізоформ у здорових тварин, хворих на ГЕ ВРХ і ГАЕ ВРХ, провести пошук сполук, які б знижували рівень фізіологічного пріона у ЦНС.

Для досягнення мети нами були поставлені такі завдання:

· дослідити загальний рівень PrP^C та співвідношення його ізоформ у структурно-функціональних відділах головного мозку великої рогатої худоби.

· встановити особливості виявлення ізоформ, клітинну та тканинну локалізацію патологічного пріона при ГАЕ ВРХ.

· з'ясувати вплив сульфатованих поліаніонів на рівень фізіологічного пріона у ЦНС лабораторних тварин.

· дослідити взаємодію сульфатованих поліаніонів та фізіологічного рекомбінантного пріон-протеїну in vitro.

Об'єкт досліджень - фізіологічний, патологічний пріони та їх ізоформи, клітинний та тканинний розподіл даних білків за норми та при ГЕ ВРХ. губчастоподібний пріон енцефалопатія поіланіон

Предмет досліджень - загальний рівень фізіологічного пріона, рівень ізоформ фізіологічного пріона, рівень ізоформ патологічного пріона, клітинна та тканинна локалізація патологічного пріона, вміст цинку та міді, активність Cu/Zn-супероксиддисмутази, електростатичні характеристики амінокислотних залишків фізіологічного пріона, спектри поглинання фізіологічного пріона в ультрафіолетовій ділянці.

Методи досліджень - біохімічні (імуноферментні, спектрофотометричні), гістологічні (імуногістохімічні), біоінформатичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено ряд додаткових ізоформ фізіологічного пріона, які детектуються у різних відділах головного мозку великої рогатої худоби. Вперше встановлено, що при ГАЕ ВРХ змінюється характер тканинної локалізації та спосіб депозитування патологічного пріона у ЦНС великої рогатої худоби, порівняно з ГЕ ВРХ. Відмічено зміни у клітинній локалізації патологічного пріона при ГАЕ ВРХ. Розроблено метод диференційної діагностики ГЕ ВРХ та ГАЕ ВРХ. Вперше виявлено, що сульфатовані поліаніони, зокрема пентосан полісульфат, здатні знижувати рівень фізіологічного пріона у ЦНС лабораторних тварин. Показано, що гепарин теж здатний знижувати вміст фізіологічного пріона у ЦНС лабораторних тварин, але, на відміну від пентосан полісульфату, даний препарат викликає ряд побічних ефектів, які проявляються у змінах пріон-залежних показників, зокрема у концентрації міді та цинку та активності Cu/Zn- залежної супероксиддисмутази. Досліджено характер взаємодії фізіологічного пріона та пентосан полісульфату, картовано функціональні групи, відповідальні за їх взаємодію.

Практичне значення отриманих результатів. У результаті проведених досліджень адаптовано метод точкової гібридизації для визначення загального рівня фізіологічного пріона. Проведені дослідження рівня та тканинної локалізації патологічного пріона при ГАЕ ВРХ та ГЕ ВРХ дали можливість розробити схему диференційної діагностики пріонних інфекцій у великої рогатої худоби. Дослідження впливу сульфатованих поліаніонів на рівень фізіологічного пріона показали перспективність застосування даної групи сполук для профілактики пріонних інфекцій.

Дисертантом у співавторстві видано методичні рекомендації «Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби», які затверджені НМК Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України (протокол № 3 від 19.12.2006). Розроблено СОУ 85.20-37-669:2007 «Пріонні інфекції. Метод визначення патологічного пріона - вестерн-блот» та СОУ 85.20-37-670:2007 «Пріонні інфекції. Імуноферментний метод визначення патологічного пріона», СОУ 85.20-37-569:2007 «Експрес-метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби», СОУ 85.20-37-568:2007 «Гістологічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби», СОУ 85.20-37-570:2007 «Імуногістохімічний метод діагностики губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби».

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведені експериментальні дослідження, статистична обробка результатів, написана та оформлена дисертація. Дослідження, які стосуються ГАЕ ВРХ, проводилися автором у Інституті контролю ветеринарних хвороб (Мьодлінг, Австрія) під час проходження наукового стажування. Частина роботи виконана із залученням коштів гранту Західно-Українського Центру Біо-Медичних Досліджень (WUBMRC).

Інтерпретація одержаних результатів та висновків здійснена разом з науковим керівником - академіком УААН В.В. Влізлом.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на міжнародній конференції студентів та молодих вчених “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology“ (Одеса, 2007), міжнародній конференції “Prion2007” (Единбург, Велика Британія, 2007), міжнародній конференції “Prion2008” (Мадрид, Іспанія, 2008), міжнародній конференції молодих вчених “Біологія: від молекули до біосфери” (Харків, 2007), конференції молодих вчених Інституту біології тварин УААН (Львів, 2007), всесвітньому конгресі з буятрики (Будапешт, Угорщина, 2008).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, з яких 6 статей Ї у фахових наукових виданнях, інші Ї в матеріалах та збірниках тез конференцій, отримано один патент, опубліковано одні методичні рекомендації.

Структура та об'єм дисертації. Дисертація викладена на 132 сторінках комп'ютерного тексту, містить 4 таблиці (3 сторінки) і 44 рисунки (20 сторінок), складається із вступу, чотирьох розділів (огляд літератури; методи й об'єкт досліджень, результати експериментальних досліджень; аналіз та узагальнення результатів досліджень), висновків, пропозицій виробництву, списку використаної літератури, який містить 249 джерела, в тому числі 235 латиною.

Вибір напрямів досліджень, матеріал і методи виконання роботи. Роботу виконували упродовж 2007-2008 рр. у Інституті біології тварин УААН. Матеріалом для дослідження були велика рогата худоба чорно-рябої молочної породи та лабораторні щури, лінії Vistar. Дослідження рівня фізіологічного пріона та його ізоформ у головному мозку проводилися на зразках, відібраних після забою тварин.

Експерименти з тваринами проводили згідно з правилами Європейської конвенції про гуманне ставлення до лабораторних тварин.

Під час виконання дисертаційної роботи були проведені 4 серії дослідів. У першій серії дослідів вивчали рівень фізіологічного пріона та його ізоформ у різних відділах головного мозку здорової великої рогатої худоби.

У другій серії дослідів проводили порівняння рівня ізоформ, клітинної та тканинної локалізації патологічного пріона у великої рогатої худоби, хворої на ГАЕ ВРХ та ГЕ ВРХ, шляхом дослідження довгастого мозку.

У третій серії дослідів досліджували вплив сульфатованих поліаніонів на рівень фізіологічного пріона та його ізоформ. Дослід проводили на статевозрілих самцях щурів лінії Vistar, вагою 250-350 г, поділених на три групи: І - контрольна; ІІ - тваринам внутрішньомґязово вводили гепарин у дозах 1; 50 та 300 мг/кг/день; ІІІ - тваринам внутрішньомґязово вводили пентосан полісульфат у дозах 0,1; 0,5; 1 мг/кг/день. Концентрації досліджуваних препаратів підбирали відповідно терапевтичних доз. На сьомий день тварин декапітували під легким ефірним наркозом, відповідні тканини та органи відбирали та використовували для подальших досліджень.

У четвертій серії дослідів вивчали механізми взаємодії пентосан полісульфтау та PrP^C. Для цього використовували високоочищений препарат пентосан полісульфату (Bene Gmbh, Німеччина), який належить до групи напівсинтетичних гепариноїдів та є полі-в-D-ксиланом, та рекомбінантний повнорозмірний бичачий пріон-протеїн (Prionics, Швейцарія).

Картування функціональних груп, які беруть участь у взаємодії фізіологічного пріона та пентосан полісульфату, здійснювалося за допомогою біоінформатичних методів, які ґрунтуються на рівнянні Пуассона-Больцмана, та шляхом реєстрації спектрів поглинання PrP^C в ультрафіолетовому діапазоні.

Концентрацію загального білка визначали методом Лоурі (Lowry O.H. et al., 1951). Загальний рівень фізіологічного пріона визначали методом точкової гібридизації. Спектр ізоформ PrP^C встановлювали методом імуноблот-аналізу. Концентрацію амілоїд-подібних фібрил та спектр ізоформ патологічного пріона визначали затвердженими МЕБ протоколами імуноблот-аналізів з використанням ультрацентрифугування у градієнті сахарози. Клітинну та тканинну локалізацію патологічного пріона досліджували методом імуногістохімії. Активність Cu/Zn-супероксиддисмутази вимірювалася у реакції відновлення нітросинього тетразолію з інгібуванням активного центру фермента ціанідом калію (McCord J. M., 1977). Вміст міді та цинку визначали спектрофотометрично за допомогою атомно-абсорбційного спектрофотометра С-115М. При дослідженні взаємодії пріон-протеїну та пентосан полісульфату було використано метод твердофазного імуноферментного аналізу (ТФ-ІФА) та біоінформатичні методи визначення основних електростатичних показників амінокислотних залишків фізіологічного пріона. Статистичний аналіз результатів досліджень проводили за допомогою програми Statgraphics Plus 5.1 з використанням t-тесту Стґюдента та обрахунком коефіцієнта кореляції. Зміни вважали вірогідними при р<0,05-0,001.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ АНАЛІЗ

Вміст фізіологічного пріона та його ізоформ у різних структурно-функціональних частинах головного мозку великої рогатої худоби. Найвищий рівень фізіологічного пріона спостерігається у довгастому мозку, нюховому шляху та нюхових горбиках. У інших частинах головного мозку, зокрема епіфізі, лобних долях великих півкуль, двогорбковому тілі та мозочку, фізіологічний пріон-протеїн також міститься, але його кількість є меншою на 30-60 % (р<0,05-0,001), порівняно з довгастим мозком та частинами нюхового шляху. Таким чином, клітинний пріон знаходиться не тільки у довгастому мозку, а й в інших частинах головного мозку, що свідчить про можливу участь даних ділянок у патогенезі пріонних інфекцій, оскільки саме фізіологічний пріон виступає в якості субстрату для реплікації інфекційного пріона.

Крім трьох основних глікоформ пріона нами було виявлено дві додаткові ізоформи в нюховому шляху та горбиках, двогорбковому тілі та мозочку, а у лобних долях та епіфізі додатково встановлено три ізоформи. Судячи із їхньої електрофоретичної рухливості, це були частково глікозильовані форми фізіологічного пріону.

Що стосується профілю глікоформ фізіологічного пріона, то нами встановлено особливості їхнього співвідношення у різних ділянках головного мозку великої рогатої худоби. Найвищий рівень має диглікозильована форма PrP^C, в меншій кількості представлені частково глікозильовані, співвідношення та кількість яких може варіювати, залежно від ділянки мозку. Найменший вміст мала деглікозильована ізоформа пріона.

Особливості реплікації ізоформ PrP^SC при ГАЕ ВРХ та ГЕ ВРХ. Використовуючи загальноприйняті клінічні та лабораторні методи діагностики, важко провести диференціацію ГАЕ ВРХ та ГЕ ВРХ. Тому було детально досліджено біохімічні особливості реплікації, клітинної та тканинної локалізації патологічного пріона при ГЕ ВРХ та ГАЕ ВРХ.

Імуноблот-аналіз показав, що співвідношення глікоформ у позитивному контролі та досліді практично не змінюється. Хоча відзначається тенденція до зростання рівня деглікозильованої ізоформи PrP^SC у дослідному зразку, що вказує на присутність у ньому штаму патологічного пріона, відмінного від того, який викликає ГЕ ВРХ.

Визначення особливостей реплікації ізоформ патологічного пріона показали, що при ГЕ ВРХ є три основні глікоформи PrP^SC з молекулярними масами 29, 25 та 19 кДа, відповідно. Водночас у тварини, хворої на ГАЕ ВРХ, відзначається збільшення електрофоретичної рухливості ди-, моно- та деглікозильованої форм PrP^SC, яка відповідала молекулярній масі 27 кДа для диглікозильованої, 23 кДа для моноглікозильованої та 17 кДа для деглікозильованої ізоформи. Отже, даний розподіл глікоформ за молекулярною масою є характерним для ГАЕ ВРХ.

Крім цього, виявлено високу концентрацію амілоїд-подібних фібрил у мозковій тканині тварини, хворої на ГАЕ ВРХ.

При імуногістохімічному аналізі зональної локалізації PrP^SC у довгастому мозку тварини, хворої на ГАЕ ВРХ, детектовано його високий рівень у оливному ядрі, тоді як у мозку тварин, хворих на ГЕ ВРХ, PrP^SC виявляється тільки в дорзальному ядрі блукаючого нерва та солітарному тракті (рис. 1), що є характерною діагностичною ознакою цього захворювання.

У результаті проведених імуногістохімічних досліджень було виявлено відмінності у клітинній локалізації патологічного пріона. Так, при ГЕ ВРХ він детектується переважно у нейрофілі (позаклітинному середовищі), тоді як у дослідному зразку спостерігається транслокація PrP^SC всередину нейронів оливного ядра (рис. 1). Крім цього, змінюється характер депозитування патологічного пріона з гранулярного на дифузний. Це свідчить про утворення амілоїд-подібних структур всередині клітини та є ще одним підтвердженням того, що даний випадок відноситься до ГАЕ ВРХ.

Вплив сульфатованих поліаніонів на вміст фізіологічного пріона та стан пріон-залежних показників пріон-реплікуючих органах щурів. Результати досліджень, отримані нами методом точкової гібридизації, свідчать про те, що введення гепарину в дозі 300 мг/кг/день викликає вірогідне зниження рівня фізіологічного пріона у великих півкулях головного мозку, довгастого та спинного мозку щурів. Введення гепарину в дозах 1 та 50 мг/кг/день спричиняє незначне зменшення вмісту PrP^C у великих півкулях та спинному мозку та вірогідно знижує його рівень у довгастому мозку (рис. 2).

При визначенні активності цитоплазматичної ізоформи СОД - Cu/Zn-залежної за дії гепарину виявлено, що активність його знижується майже вдвічі (р<0,01) при введенні дози 300 мг/кг/день гепарину, тоді як введення гепарину у дозах 1 та 50 мг/кг день викликало тенденцію до зменшення активності Cu/Zn-СОД.

Дослідження впливу гепарину на концентрацію міді та цинку, як пріон-зв'язаних мікроелементів, дозволило встановити, що препарат у концентраціях 1; 50 та 300 мг/кг/день не викликає вірогідних змін у кількостях даних мікроелементів.

Дот-блот аналіз ділянок ЦНС лабораторних щурів показав, що при введенні пентосан полісульфату в дозах 1; 0,5 та 1 мг/кг/день спостерігається зниження вмісту PrP^C у великих півкулях головного мозку, довгастого та спинного мозку (рис. 3).

Вивчивши співвідношення ізоформ фізіологічного пріона у великих півкулях головного мозку, було встановлено, що застосування пентосан полісульфату веде до прямо пропорційного зниження рівня диглікозильованої форми, залежно від дози препарату.

При аналізі профілів ізоформ фізіологічного пріона у довгастому мозку щурів встановлено, що введення пентосан полісульфату у різних дозах викликало збільшення моноглікозильованої форми. При цьому моноглікозильована форма виявлялася на досить високому рівні, який складав 30 - 40 % від сумарної кількості ізоформ (рис. 3).

Виявлено, що застосування пентосан полісульфату не впливає на активність Cu/Zn-СОД, але викликає зростання концентрації міді та цинку. Так, якщо введення пентосан полісульфату тваринам у дозах 0,1 та 0,5 мг/кг/день веде до незначного зростання кількості досліджуваних мікроелементів, то препарат у дозі 1 мг/кг/день викликає збільшення вмісту в 2 - 4 рази міді та цинку у ЦНС (р<0,01).

Отже, на відміну від гепарину, введення пентосан полісульфату у дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг/день спричиняє зниження рівня PrP^C та не викликає вірогідних змін у активності Cu/Zn-СОД, але у дозі 1 мг/кг/день веде до зростання вмісту міді та цинку. При порівнянні результатів, отриманих при застосуванні гепарину та пентосан полісульфату, виявлено, що діюча доза пентосан полісульфату є на два порядки нижчою, порівняно з гепарином, тобто пентосан полісульфат набагато ефективніше знижує вміст фізіологічного пріона. Ми припускаємо, що різний ефект сполук групи гепариноїдів обумовлений специфічними сайтами взаємодії з фізіологічним пріоном.

Дослідження взаємодії фізіологічного пріона та пентосан полісульфату in vitro. Методом ТФ-ІФА вдалося показати, що фізіологічний пріон та пентосан полісульфат взаємодіють in vitro. Ця взаємодія є специфічною, про що свідчить характер кривої, побудованої з результатів ТФ-ІФА аналізу. Вона характеризується наявністю двох ділянок: ділянки насичення, де відзначається прямопропорційна залежність кількості зв'язаного пентосан полісульфатом білка від кількості внесеного PrP^C, та ділянки плато, для якої характерна стабільна величина зв'язаного фізіологічного пріона, незалежно від кількості внесеного білка (рис. 4, А).

Для більш детального вивчення специфічності взаємодії досліджуваних молекул було перевірено вплив на неї моноклональних анти-PrP антитіл. Встановлено, що анти-PrP антитіла практично повністю пригнічують взаємодію фізіологічного пріона та пентосан полісульфату (рис. 4, Б).

Такий же ефект отримано і при додаванні вільного пентосан полісульфату до лунки, де проходила взаємодія фізіологічного пріона з сульфатованим поліаніоном (рис. 4, В).

Також було встановлено, що сайт взаємодії з пентосан полісульфатом не локалізований у ділянці октапептидних повторів PrP^C, оскільки додавання катіонів міді не впливало на динаміку зв'язування досліджуваних молекул in vitro (рис. 4, Г).

При використанні біоінформатичних методів та реєстрації спектрів поглинання амінокислот в УФ-діапазоні доз встановлено, що за взаємодію з сульфатними групами пентосан полісульфату відповідають амінокислотні залишки Arg148 та Arg151 поліпептидного ланцюга PrP^C.

ВИСНОВКИ

Вперше вивчено біохімічні особливості клітинної та тканинної локалізації фізіологічного і патологічного пріонів та їх ізоформ при типовій і нетиповій формах губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби, досліджено вплив гепарину та пентосан полісульфату на рівень фізіологічного пріона, його ізоформ та ряду пріон-залежних показників у лабораторних тварин, виявлено молекулярний механізм взаємодії фізіологічного пріона (рекомбінантний препарат) та пентосан полісульфату.

1. У головному мозку найвищий рівень фізіологічного пріона знаходиться у довгастому мозку та частинах нюхового шляху, менше - у мозочку, епіфізі та лобних долях великих півкуль.

2. У великих півкулях головного мозку, довгастому мозку, епіфізі, мозочку, двогорбковому тілі, нюховому тракті та нюхових горбиках великої рогатої худоби у співвідношенні глікоформ фізіологічного пріона переважає диглікозильована форма (44 - 70 %), деглікозильована ізоформа представлена у найменшій кількості (10 - 25 %), а проміжні форми мають середні положення (20 - 38 %).

3. Губчастоподібна енцефалопатія великої рогатої худоби та губчастоподібна амілоїдна енцефалопатія великої рогатої худоби відрізняються між собою молекулярними властивостями патологічного пріона, а саме різною молекулярною масою ізоформ та характером локалізації в тканинах та клітинах головного мозку, що може свідчити про наявність двох різних штамів збудника.

4. Для ГЕ ВРХ характерними ознаками є екстранейрональний тип акумуляції патологічного пріона в дорзальному ядрі блукаючого нерва та гранулярність його агрегатів, а для ГАЕ ВРХ - інтранейрональний тип накопичення патологічного пріона в нейронах оливного ядра довгастого мозку та дифузний характер відкладень PrP^SC.

5. Внутрішньом'язова ін'єкція щурам 1 та 50 мг/кг/день гепарину викликає тенденцію до зниження вмісту PrP^C у великих півкулях та спинному мозку і вірогідно зменшує його кількість у довгастому мозку, застосування гепарину в дозі 300 мг/кг/день гепарину щурам веде до зниження (р<0,01) рівня PrP^C у всіх досліджуваних тканинах. Гепарин не спричиняє вірогідних змін у співвідношенні глікоформ PrP^C в тканинах головного та спинного мозку.

6. Введення щурам гепарину в дозах 1 та 50 мг/кг/день не впливає на вміст міді та цинку і на активність Cu/Zn-СОД в мозку, а доза препарату 300 мг/кг/день веде до зниження активності Cu/Zn-СОД в мозку на 40 - 50 % (р<0,01), але не спричиняє змін кількості досліджуваних мікроелементів.

7. Введення щурам пентосан полісульфату в дозах 0,1; 0,5 та 1 мг/кг/день знижує рівень PrP^C та змінює профіль ізоформ PrP^C у великих півкулях головного мозку, зокрема зростає рівень деглікозильованої форми фізіологічного пріона від 0 до 26 % (р<0,01) за рахунок зниження рівня диглікозильованої від 100 до 74 % (р<0,05); у довгастому мозку зростає моноглікозильована форма фізіологічного пріона (від 0 до 34 - 46 %, р<0,01) за рахунок диглікозильованої.

8. Внутрішньом'язова ін'єкція пентосан полісульфату щурам у дозі 1 мг/кг/день спричиняє зростання вмісту міді у 1,5 - 2 рази (р<0,01) та цинку в 4 рази (р<0,01) у тканинах великих півкуль головного мозку, довгастого та спинного мозку, тоді як у дозах 0,1 та 0,5 мг/кг/день викликає тенденцію до зниження цих мікроелементів, водночас активність Cu/Zn-СОД залишається незмінною при застосуванні всіх досліджуваних доз пентосан полісульфату.

9. Взаємодія між фізіологічним пріоном та пентосан полісульфатом in vitro зумовлюється утворенням не ковалентних зв'язків між гуанідиновими групами залишків Arg148 і Arg151 поліпептидного ланцюга PrP^C з сульфатними групами пентосан полісульфату.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Диференційну діагностику типової (ГЕ ВРХ) та нетипової (ГАЕ ВРХ) форм губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби слід проводити на основі електрофоретичної рухливості глікоформ патологічного пріона, наявності амілоїд-подібних фібрил і особливостей тканинної локалізації PrP^SC.

2. Одним з методів профілактики пріонних інфекцій може бути зменшення рівня PrP^C в організмі шляхом внутрішньом'язового введення пентосан полісульфату у дозі 1 мг/кг/день.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стадник В.В. Експресія фізіологічного пріону у головному мозку ссавців за дії глікозаміногліканів / В.В. Стадник // Біологія тварин. 2007. Т. 9, № 1--2. С. 141--145.

2. Влізло В.В. Пентосан полісульфат - можливий засіб профілактики пріонних інфекцій / В.В. Влізло, В.В. Стадник, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький // Ветеринарна біотехнологія. 2008. № 13(1). С. 111-116. (Дисертант провів дослідження рівня фізіологічного пріона за дії пентосан полісульфату в довгастому мозку та дослідження взаємодії рекомбінантного пріона та пентосан полісульфату in vitro).

3. Стадник В.В. Взаємодія фізіологічного пріона з пентосан полісульфатом in vitro / В.В. Стадник, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький, В.В. Влізло // Експ. та клін. фізіол. та біохім. 2008. № 3. C. 33-37. (Дисертант провів імуноферментні та спектрофотометричні дослідження взаємодії пріону з пентосан полісульфатом та написав статтю).

4. Влізло В.В. Можливості ідентифікації патологічного пріона губчастоподібної амілоїдної енцефалопатії великої рогатої худоби / В.В. Влізло, В.В. Стадник, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький, Р.С. Стойка // Біотехнологія. 2008. №2. С. 75-80. (Дисертант провів ідентифікацію ізоформ патологічного пріона, імуногістохімічні дослідження та написав статтю).

5. Влізло В.В. Вміст фізіологічної форми пріону за дії пентосанполісульфату (sp-54) у тканинах щура / В. В. Влізло, В. В. Стадник, Х. Я. Майор, М. В. Кінах, П. І. Вербицький, М. M. Козак // Укр. біохім. журнал. 2008. Т. 80, № 1. С. 33-39. (Дисертант визначив вміст фізіологічного пріону, міді, цинку та активності супероксиддисмутази за дії пентосан полісульфату, узагальнив результати, написав статтю).

6. Влізло В. Локалізація ізоформ пріон-протеїну у мозку великої рогатої худоби / В.В. Влізло, П.І. Вербицький, В.В. Стадник, Х.Я. Майор, І.М. Петрух // Вет. Мед. України. 2007. №10. С. 8-10. (Дисертант провів імуноблот-аналіз ізоформ пріон-протеїну, написав статтю).

7. Влізло В.В. Профіль експресії фізіологічного пріона у головному мозку великої рогатої худоби / В.В. Влізло, П.І. Вербицький, Х.Я. Майор, В.В. Стадник // Вісник НТШ: хемія і біохемія. 2007. Т. XVIII. P. 228-232. (Дисертант провів дослідження рівня ізоформ фізіологічного пріона та написав статтю).

8. Влізло В.В. Лабораторна діагностика трансмісивних спонгіформних енцефалопатій (ТСЕ): сучасний стан та перспективи / В.В. Влізло, Х.Я. Майор, П.І. Вербицький, В.В. Стадник // Біологія тварин. 2007. Т. 9, № 1--2. С. 10-24. (Дисертант брав учать у написанні розділу про референс-методи діагностики ТСЕ).

9. Влізло В.В. Діагностика губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби: Методичні рекомендації / В.В. Влізло, П.І. Вербицький, А.В. Абрамов, О.В. Ложкіна, Д.Д. Остапів, І.М. Петрух, Ю.В. Мартин, Х.Я. Майор, В.В. Стадник. Київ, 2007. 61 с. (Дисертант підготував до друку підрозділи 3.4.1.2 та 3.4.1.3 третього розділу).

10. Пат. 32547 Україна, МПК (2206) А61Р 31/00. Застосування пентосан полісульфату (SP-54) як інгібуючого впливу на експресію фізіологічного пріон протеїну in vitro / В. Влізло, В. Стадник, Х. Майор; заявник і патентовласник Інститут біології тварин УААН. № u 2007 12191 ; заяв. 05.11.2007; опубл. 26.05.2008, Бюл. № 10.

11. Стадник В.В. Вплив пентосан полісульфату (SP-54) на експресію фізіологічного пріон-протеїна / В.В. Стадник, Х.Я. Майор, В.В. Влізло // Біологія: від молекули до біосфери: міжнар. конф. студентів і мол. вчених, 19 - 21 лис. 2007 р.: тези доп. Харків, 2007. С. 4.

12. Stadnyk V. Identification and characteristic of the of bovine amyloidogenic spongiform encephalopathy (BASE) / V. Stadnyk, Ch. Mayor, V. Vlizlo // Modern Problems of Microbiology and Biotechnology: int. sci. conf. of the young scientists and students, 28 - 31 May 2007: abstract book -- Odessa, 2007. P. 184.

13. Stadnyk V. Expression of PRPC Isoforms in the Parts of Cattle Brain / V. Stadnyk, Ch. Mayor, V. Vlizlo // Prion2007: int. sci. conf., 26 - 28 Sep., 2007: abstract book -- Edinburgh, United Kingdom, 2007. P. 74.

14. Stadnyk V. Molecular Mechanism of Action of Pentosan Polysulphate on the Cellular Prion Protein / V. Stadnyk, Ch. Mayor, V. Vlizlo // XXV World Buiatric Congress: int. sci. conf., 6 - 11 July, 2008: Hungarian Veterinary Journal. Budapest, Hungary, 2008. P. 76.

15. Vlizlo V. New Approaches in the Prophylaxis of Prion Infections / V. Vlizlo, P. Verbitskii, C. Mayor, V. Stadnyk // XXV World Buiatric Congress: int. sci. conf., 6 - 11 July, 2008: Hungarian Veterinary Journal. Budapest, Hungary, 2008. P. 84.

16. Stadnyk V. Polyanions and their influence on the cellular prion protein / V. Stadnyk, Ch. Mayor, L. Izyumova, V. Vlizlo // Prion2008: int. sci. conf., 8 - 10 Oct., 2008: abstract book. Madrid, Spain, 2008. P. 103.

АНОТАЦІЯ

Стадник В.В. Біохімічні особливості пріон-протеїну за норми та патології. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біології тварин УААН. Львів, 2008.

Дисертація присвячена вивченню біохімічних особливостей фізіологічного та патологічного пріон-протеїнів і їхніх ізоформ за норми та при пріонних інфекціях у тварин.

З'ясовано біохімічні особливості фізіологічного пріона та його ізоформ у різних структурно-функціональних відділах головного мозку великої рогатої худоби і щурів. У тканинах головного мозку великої рогатої худоби вперше виявлено ряд додаткових ізоформ фізіологічного пріона. Встановлено, що при нетиповій формі (ГАЕ ВРХ) губчастоподібної енцефалопатії великої рогатої худоби патологічний пріон накопичується в оливному ядрі довгастого мозку і має інтранейрональний тип депозитування, тоді як типова форма ГЕ ВРХ характеризується відкладенням агрегатів патологічного пріона в міжклітинному середовищі дорзального ядра довгастого мозку.

Встановлено, що препарати гепарину та пентосан полісульфату здатні знижувати рівень фізіологічного пріона у тканинах центральної нервової системи лабораторних тварин.

Досліджено механізм взаємодії фізіологічного рекомбінантного пріона та пентосан полісульфату in vitro. Виявлено, що ця взаємодія є специфічною, високоафінною та зумовлюється взаємодією сульфатних груп пентосан полісульфату з залишками аргініну 148 та 151 поліпептидного ланцюга пріона.

Ключові слова: пріон-протеїн, ізоформи пріона, гепарин, пентосан полісульфат, губчастоподібна енцефалопатія великої рогатої худоби.

АННОТАЦИЯ

Стадник В.В. Биохимические особенности прион-протеина в норме и патологии. -- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биологии животных УААН. Львов, 2008.

Диссертация посвящена изучению биохимических особенностей физиологического и патологического прион-протеинов и их изоформ в норме и при прионных инфекциях у животных.

Выяснены биохимические особенности физиологического приона и его изоформ в разных структурно-функциональных отделах головного мозга крупного рогатого скота и крыс. В тканях головного мозга крупного рогатого скота впервые выявлен ряд дополнительных изоформ физиологического приона. Показано, что при нетипичной форме (ГАЭ КРС) губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота патологический прион накапливается в оливарном ядре продолговатого мозга и имеет интранейрональный тип депозитирования, тогда как типичная форма ГЭ КРС характеризуется отложением агрегатов патологического приона в межклеточном веществе дорзального ядра продолговатого мозга.

Установлено, что препараты гепарина и пентосан полисульфата снижают уровень физиологического приона в органах центральной нервной системы лабораторных животных.

Исследован механизм взаимодействия физиологического рекомбинантного приона и пентосан полисульфата in vitro. Обнаружено, что это взаимодействие является специфическим, высокоаффинным и обеспечивается взаимодействием сульфатных групп пентосан полисульфата с остатками аргинина 148 и 151 полипептидной цепи приона.

Ключевые слова: прион-протеин, изоформы приона, гепарин, пентосан полисульфат, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота.

SUMMARY

Stadnyk V.V. The biochemical characteristics of prion-protein in normal conditions and pathology. -- Manuscript.

Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology by specialty 03.00.04 - biochemistry. - Institute of Animal Biology UAAS, Lviv, 2008.

The thesis is devoted to investigation of the biochemical particularities of cellular and pathological prions and their isoforms in normal conditions and in the animal prion infections.

The biochemical features of the cellular prion and its isoforms have been established in different structural and functional parts of cattle and laboratory rats brain. It was showed that the highest level of this protein expression is observed in medulla oblongata, olfactory tract and olfactory bulb. In other parts of cattle cerebrum, namely in epiphysis, brain hemispheres, inferior colliculus and cerebellum cellular prion protein is also expressing, but its level is lower approximately on 30-60% in comparison with medulla oblongata and parts of olfactory tract. Consequently, cellular prion is expressing not only in medulla oblongata but also in other parts of cerebrum which means that these parts of brain can also take part in the pathogenesis of prion diseases. In brain tissue of cattle were detected for the first time the additional isoforms of cellular prion which have intermediate position between di- and deglycosilated prion isoforms. It was shown, that in a case of atypical form of BSE, pathological prion accumulates in olive nucleus of brainstem in diffuse manner. Typical form of BSE was characterized by granular accumulation of prion aggregates in intercellular space of dorsal nucleus of brainstem.

It was decided to make a search of preparations which are able to decrease a level of cellular prion with out side effects, and in the same time depriving pathological prion of substrate for replication. Were chosen two compounds - heparin and pentosan polysulfate, as they are able to interact with cellular prion in vitro. Speaking about the influence of these compounds on cellular prion in vivo we must mark that there is no such reference data.

The results of our investigations show that injections of heparin and pentosan polysulphate cause decrease of cellular prion level in forebrain, brainstem and spinal cord of tested animals.

It was set that type of PrP^c isoforms expression after PPS treatment changes in forebrain, were take place decrese of deglycosylated form of cellular prion as a result of decrease of level of diglycosilated PrP^c and also in the brainstem, were PPs causes expression of monoglycosylated form of cellular prion, which could not be detected in normal condirions.

In the same time we found out that injection of PPS causes considerable increase of copper and zinc level in tested tissues when activity of Cu/Zn-SOD does not change.

Heparin in concentrations 1 and 50 mg/kg/day does not cause changes in the maintenance of copper and zinc, and in activity of Cu/Zn-SOD. Although injections with heparin in dose 300 mg/kg/day leads to the decrease of Cu/Zn-SOD activity but has no influence on levels of copper and zinc.

Molecular mechanism of interaction between cellular recombinant prion and pentosan polysulphate has been investigated. It was detected, that this interaction is specific, has high-affinity and is provided by non-covalent binding sulphate groups of pentosan polysulphate with Arg148 and Arg151 amino acid residues in prion polypeptide chain. These results can explain the inhibiting effect of pentosan polysulphate on prion protein expression in vivo.

Key words: prion protein, isoforms of prion, heparin, pentosan polysulphate, bovine spongiform encephalopathy.

Размещено на Allbest.ru