Вплив кріопротекторів та заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку собак

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

УДК: 57.086.13:636.7:611.018.46

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив кріопротекторів та заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку собак

03.00.19 - кріобіологія

Водоп`янова Лариса Анатоліївна

Харків 2008

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Трансплантація гемопоетичної тканини - це ефективний спосіб відновлення кровотворення при його порушенні, що зумовлює її широке застосування з терапевтичною метою [Цуцаева А.А. и др., 1983; Zhong F. et al., 2002; Carvallo C. et al., 2004; Гольцев А.Н. и др., 2005].

Трансплантація кісткового мозку застосовується для відновлення дефіциту імунної системи та корекції гомеостазу організму після хіміо- і радіотерапії онкологічних хворих [Bruno B. et al., 1999; Childs R.W. et al., 2000; Rozhdestvensky L. et al., 2004; Гольцев А. Н. и др., 2005], а також при терапії різних захворювань кровотворної системи людини [Sharples F.E., Pellmar T.C., 2002; Priddle H. et al., 2006].

Подібний метод терапії є новим для ветеринарії, проте в останні роки він вже показав свою ефективність у дослідах на лабораторних тваринах-ссавцях [Hartuett B.J. et al., 2002; Fermin M.L. et al., 2004]. Одержані результати зумовлюють необхідність створення банків кісткового мозку та проведення подальших досліджень у даній області.

Найбільш ефективним способом зберігання кісткового мозку єз'являтися,являтися низькотемпературне консервування [Останков М.В. 2001; Гольцев А.Н. и др., 2005; Sumida S. 2005; Грищенко В.И. и др. 2006, Galms A. et al., 2007]. Численні дослідження факторів заморожування-відігріву та механізмів дії кріопротекторів показали, що для різного виду клітин або тканин необхідно розробляти власні режими кріоконсервування. На сьогодні вже розроблено методи довгострокового зберігання кісткового мозку людини в умовах низькотемпературного банку, що дозволяє тривалий час зберігати клітини в життєздатному стані до виникнення необхідності в трансплантації [Quah T.C. et al., 1997; Гольцев А.Н. и др., 2005; Priddle H. et al., 2006].

Проте для зберігання кісткового мозку домашніх тварин, зокрема собак, таких технологій поки що не існує. А застосування у ветеринарії методів кріоконсервування, розроблених для зберігання кісткового мозку людини, неможливе, тому що кістковий мозок тварин має свої морфологічні і функціональні особливості (характеристики мієлограм, антигенний склад, біохімічні параметри), що характеризуються видовою приналежністю тварини [Даштаянц Г.А. 1978; Западнюк И.П. и др., 1983] і визначають специфічність їх реакції на дію факторів кріоконсервування. Цим зумовлена необхідність дослідження впливу кріопротекторів і заморожування-відігріву на кістковий мозок найбільш поширених домашніх тварин - собак, а також розробка технології довгострокового зберігання кісткового мозку цього виду тварин.

Актуальним є дослідження механізмів кріозахисту та кріопошкодження кісткового мозку собак, а також особливостей біохімічних процесів на різних етапах його кріоконсервування. Це має важливе значення для визначення збереження і прогнозування життєздатності кісткового мозку тварин після кріоконсервування, що є основою для створення технології довгострокового зберігання кісткового мозку собак і використання його у ветеринарній практиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи кафедри хімії і біохімії Харківської державної зооветеринарної академії за темою: «Експериментальне обґрунтування і розробка методів кріоконсервування клітин та тканин домашніх і сільськогосподарських тварин» (№ держреєстрації 0104U009818).

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначення впливу кріопротекторів і заморожування-відігріву на структурно-функціональний стан кісткового мозку собак.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Оцінити ступінь збереження кісткового мозку собак після заморожування-відігріву без кріопротектору та під захистом ДМСО, ПЕО-400 і гліцерину.

2. Вивчити показники мієлограми кісткового мозку собак до та після кріоконсервування.

3. Дослідити вміст фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування.

4. Визначити рівень основних субстратів та метаболітів внутрішньоклітинних енергетичних процесів (глікоген, аденозин-3-фосфат (АТФ), глюкозо-6-фосфат (Г-6-Ф), піруват (ПВК), молочна кислота) в клітинах кісткового мозку собак після дії кріопротекторів і заморожування-відігріву.

Об'єкт дослідження - кріоконсервування кісткового мозку собак.

Предмет дослідження - клітини кісткового мозку собак, їх морфологія та основні показники внутрішньоклітинних енергетичних процесів після кріоконсервування.

Методи дослідження - морфологічний, цитохімічний, спектрофотометричний.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження впливу кріопротекторів і заморожування-відігріву на кістковий мозок собак, при цьому виявлено відмінності в збереженні клітин деконсервованого кісткового мозку собак.

Встановлено, що ДМСО в 7% концентрації в забезпечує найвищий рівень захисту гетерогенної популяції кісткового мозку собак в процесі кріоконсервування. Усі досліджені концентрації ПЕО-400 і гліцерину мають чинити протективну дію, але при цьому в кістковому мозку собак значно зменшується кількість зрілих клітин, зокрема гранулоцитівлава, низка.

Вперше отримано результати щодо зміни вмісту мембранних фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування. Мінімальні зміни у фосфоліпідному біслої клітин кісткового мозку собак відмічені після кріоконсервування з ДМСО в 7% концентрації.

Встановлено, що після кріоконсервування кісткового мозку собак з ДМСО в 7% та 10% концентрації показники субстратів енергетичного обміну (глікоген, АТФ), що визначають основні функціональні показники клітин, суттєво не відрізняються від аналогічних в інтактних клітинах. При цьому показано підвищення рівня глюкозо-6-фосфату в деконсервованих клітинах кісткового мозку собак незалежно від типу кріопротектора і його концентрації.

Показано, що експозиція кісткового мозку собак з ДМСО 7% не призводить до зміни рівня пірувату та молочної кислоти. Після заморожування-відігріву кісткового мозку собак показано підвищення рівня даних метаболітів незалежно від використаного кріопротектора.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті внаслідок дослідження отримано дані, які дозволяють розробити нові ефективні технології кріоконсервування кісткового мозку собак, що дозволить створити банк гемопоетичних клітин цього виду тварин.

Отримані результати можуть бути враховані при аналізі режимів кріоконсервування та механізмів кріопошкодження клітин кісткового мозку.

Крім того, результати дослідження мієлограм і метаболізму кісткового мозку собак можуть бути рекомендовані для використання в навчальному процесі при вивченні біохімії, гістології й фізіології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація являється самостійним дослідженням здобувача. Разом з науковим керівником дисертант сформулював мету та визначив задачі дослідження. Здобувачем самостійно проведено аналіз літератури за темою дослідження, отримано експериментальні дані, проведено їх статистичну обробку. Автором роботи проаналізовано отримані результати і сформульовано висновки. Спільні публікації відображають результати експериментів і проведеного аналізу. В опублікованих спільно із співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [2, 7, 13, 14] - у вивченні дії кріоконсервування і кріопротекторів на зміну показників мієлограми собак;

- у роботах [5, 8] - у вивченні дії кріоконсервування і кріопротекторів на збереження кісткового мозку собак;

- у роботах [1, 9, 10] - у вивченні дії кріоконсервування і кріопротекторів на рівень фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак;

- у роботах [3, 6] - у вивченні дії кріоконсервування і кріопротекторів на рівень глікогену в клітинах кісткового мозку собак;

- у роботі [4] - у визначенні рівня пірувату і молочної кислоти в клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування;

- у роботах [11, 12] - у визначенні рівня АТФ і глюкозо-6-фосфату в клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування.

Апробація результатів. Результати проведених досліджень доповідались на конференціях: молодих вчених ІПКіК НАН України «Холод в биологии и медицине» (Харків, 2006); «Молодь та поступ в біології» (Львів, 2006); молодих вчених «Биология - наука XXI столетия» (Пущино, 2006); «Сryo 2006» (Hamburg, 2006); IX з'їзді Українського біохімічного товариства (Харків, 2006); молодих вчених «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2007); молодих вчених, аспірантів і студентів по молекулярній біології і генетиці (Київ, 2007); на Міжнародному симпозіумі «Актуальні проблеми біофізичної медицини» (Київ, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 14 робіт, з них в спеціалізованих наукових журналах - 6.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень,укладення,ув'язнення аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку цитованої літератури (263 джерел на 26 сторінках). Робота ілюстрована 24 рисунками та 13 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріалом дослідження був кістковий мозок, отриманий методом кістковомозкової пункції [Kushida T. et al., 2000; Kushida T. et al., 2002] із стегнових кісток статевозрілих собак (самців 3 - 4 років). Концентрацію клітин в суспензії наводити до значення (1Ч107/мл) шляхом розведення робочим середовищем, що складається з середовища 199, розчину цитрату натрію, ембріональної телячої сироватки [Гольцев А.Н. и др., 2005].

Обробка кісткового мозку кріопротекторами, заморожування-відігрів та видалення кріопротекторів. До кісткового мозку собак додавали розчини кріопротекторів: диметилсульфоксиду (ДМСО), полиетиленоксиду з М. м. 400 (ПЕО-400), гліцерину. Заморожування кісткового мозку проводили в стандартних пластикових контейнерах до температури -196 оС двоетапно: на першому етапі охолодження здійснювалося зі швидкістю 2-3 оС/хвилин до температури - 80 оС, на другому етапі - шляхом швидкого занурення в рідкий азот [Пушкарь Н.С. и др., 1972, 1984; Berthier R. et al., 1983; Гольцев А.Н., 1978, 1988; Kawano Y. et al., 2004]. Розморожування проводили на водяній бані при температурі 41°С. Кріопротектор з суспензії кісткового мозку видаляли шляхом додавання робочого середовища з подальшим центрифугуванням.

Морфологічні дослідження. Морфологічні дослідження проводили методом світлової мікроскопії на мікроскопах Biolux (Німеччина) та К. ZEISS (Німеччина) з фотографічною реєстрацією.

Підрахунок ядровмістних клітин кісткового мозку проводили в камері Горяєва [Альпаузен А.Я., 1953].

Визначення збереження клітин кісткового мозку. Визначали за допомогою суправітального фарбування клітин трипановим синім [Пушкарь Н.С. и др., 1984; Preti R.A. et al., 1994]. Порівнюючи цей показник з початковою кількістю клітин в суспензії, розраховували кількість клітин, що збереглися після заморожування-відігріву.

Оцінка мієлограми. Для морфологічної оцінки клітин використовували загальноприйняту класифікацію, наведену в [Хем А., 1983; Sharples F.E. et al., 2002]. Аналіз мієлограм проводили на мазках суспензії клітин кісткового мозку, фіксованих і забарвлених азур ІІ - еозином згідно з методикою Романовського-Гимза [Бейер В.А., 1973], в світловому мікроскопі (об'єктив - 100, окуляр - 10) оцінювали якісний склад кісткового мозку.

Цитохімічні дослідження. При цитохімічних дослідженнях в світловому мікроскопі підраховували по 100 клітин кожної групи клітин кісткового мозку собак і в кожній з клітин визначали інтенсивність забарвлення. При всіх цитохімічних реакціях ядра клітин дофарбовували гематоксиліном [Бейер В.А., 1973].

Визначення фосфоліпідів. Рівень фосфоліпідів оцінювали на мазках, підготовлених з суспензії клітин кісткового мозку собак, фіксованих і забарвлених розчином судану чорного В за методикою, наведеною в [Обозная Э.И. и др., 1989].

Визначення глікогену. Як методичну основу для визначення глікогену застосовували PAS реакцію за Мак - Манусом [Цитохимия и электронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов, 1974].

Визначення рівню субстратів та метаболітів внутрішньоклітинних енергетичних процесів (АТФ, глюкозо-6-фосфат, піруват, молочна кислота) проводили спектрофотометрично в безбілковому екстракті на СФ-46 (ЛОМО, Росія) згідно з методом, наведеним в [Методи биохимических исследований, 1982].

Визначення концентрації білка проводили за методом Бредфорд [Bredford M.M., 1976]. Після появи забарвлення вимірювали оптичну щільність на СФ-46 (ЛОМО, Росія) при довжині хвилі 595 нм. Розраховували концентрацію білка за калібрувальною кривою, побудованою за БСА.

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів проводили за методом Ст'юдента-Фішера, наведеного в [Зубрич А.С. и др., 1974].

Результати досліджень та їх обговорення. Вплив кріопротекторів та кріоконсервування на клітинний склад КМ собак. Відомо [Останкова Л.В., 1973; Willhite D.H., Katz P.I., 1984; Fuller B.J., 2004], що кріопротектори, які використовуються для зниження негативних ефектів заморожування-відігріву, самі можуть впливати на клітини при експозиції до заморожування. Всі досліджені кріопротектори на етапі експозиції дещо знижують кількість клітин кісткового мозку собак. Можливо, це пов'язано з присутністю в суспензії клітин, пошкоджених під час отримання кісткового мозку, а також чутливих до дії самих кріопротекторів.

Заморожування кісткового мозку собак без кріопротектора негативно позначається на життєздатності клітин і робить такий біоматеріал непридатним для трансплантації.

Доведено, що гліцерин був недостатньо ефективним засобом захисту кісткового мозку собак при кріоконсурвуванні. Використання ПЕО-400 як кріопротектора показало, що його 10% та 15% концентрація забезпечує більш високий рівень збереження клітин, ніж гліцерин, а найбільш виражені кріопротекторні властивості має ДМСО в 7% та 10% концентрації.

З метою успішної мієлотрансплантації важливо зберегти не тільки не лише клітини, здатні до проліферації і диференціювання, але і весь клітинний спектр кісткового мозку на стабільному рівні. У зв'язку з цим реєстрація мієлограми при кріоконсервуванні клітин кісткового мозку набуває важливого практичного значення.

Використання кріопротекторів при заморожуванні кісткового мозку собак дозволяє зберегти клітинний склад після відігріву. При цьому мінімальні його зміни виявлено після заморожування-відігріву кісткового мозку собак у присутності ДМСО 7% і 10%.

Вплив кріопротекторів та кріоконсервування на вміст,утримання фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак. Зміни в рівні фосфоліпідів потім дії криопротекторів і заморожування-відігріву відображають зміни фізико-хімічних властивостей мембран клітин [Владимиров Ю.А., 1980; Белоус А.М. и др., 1982].

Встановлено, що незначні зміни фосфоліпідного матриксу клітинних мембран відбуваються вже на етапі підготовки кісткового мозку собак до кріоконсервування. Зниження вмісту фосфоліпідів після експозиції з кріопротекторами найбільш виражено в клітинах еритроцитарного ряду, що насамперед характеризуються невисоким вмістом фосфоліпідів [Абрамов М.Г., 1985]. Зміни також відбуваються на етапі експозиції клітин з розчинами ДМСО і ПЕО-400, але після заморожування-відігріву дані кріопротектори проявили кращий захист ФЛ порівняно з розчинами гліцерину.

Вплив кріопротекторів та кріоконсервування на вміст,утримання глікогену в клітинах кісткового мозку собак. На етапі підготовки кісткового мозку до кріоконсервування всі процеси протікають in vitro, де загальна кількість енергії залежить від внутрішніх запасів глікогену [Вaust J. G., 2007]. Таким чином, наявність запасів глікогену є одним з найважливіших критеріїв оцінки функціональної активності і життєздатності клітини на всіх етапах кріоконсервування.

Експозиція клітин в середовищі отримання при 4 0С упродовж 30 хвилин не наводити до зміни кількості глікогену.

На наступному етапі роботи проводили оцінку вмісту глікогену в клітинах кісткового мозку собак після дії кріопротекторів і заморожування-відігріву. Встановлено, що процес заморожування-відігріву без використання кріопротектора спричиняє повне зникнення запасу глікогену в клітинах кісткового мозку собак, що збереглися. Його вміст після кріоконсервування з ДМСО і ПЕО-400 відрізняється від показників в інтактних клітинах незначно, що може свідчити про їх структурно-функціональну повноцінність. Значне зменшення рівня глікогену відбувається після кріоконсервування з гліцерином. Це свідчить про те, що гліцерин є менш ефективним кріопротектором для цього типу клітин.

Враховуючи показники збереження клітин кісткового мозку собак і даних гістохімічних досліджень, для детальнішого аналізу клітинних параметрів надалі порівнювали ефективність розчинів ПЕО-400 і ДМСО.

Вплив кріопротекторів та кріоконсервування на метаболіти енергетичного обміну. Взаємодія процесів утворення та споживання енергії може порушуватися в умовах дії на клітини несприятливих чинників (дія холоду, гіпоксія). При цьому потреба в АТФ може зростати в десятки разів [Уайт А., Хендлер Ф., 1981; Leist M.et al., 1997]. Ці вимоги до деякої міри задовольняються завдяки окисленню в мітохондріях, але мітохондріальна активність обмежена кількістю кисню і глюкози до моменту мієлотрансплантації. При цьому основним компенсаторним механізмом для підтримки енергетичного балансу є анаеробний шлях отримання енергії. Але збільшення швидкості розщеплювання глікогену і глюкози веде до збільшення рівня молочної кислоти [Reisbach G. et al., 1990; Murray R.K. et al., 1993; Pithon-Curi T.C., et al., 2004]. Найпростіший спосіб боротьби з надмірним ацидозом - це зведення до мінімуму інтенсивності метаболізму при гіпоксії. Кріоконсервування дозволяє знизити до мінімуму потребу в глюкозі, зменшити інтенсивність метаболізму, а тим самим - і потребу в АТФ. кріопротектор заморожування відігрів мозок

Для характеристики інтенсивності гліколізу в циклі заморожування-відігріву ККМ собак під захистом ДМСО і ПЕО-400 використовували визначення концентрацій: глюкозо-6-фосфату, АТФ, пірувату та молочної кислоти.

Отримані результати свідчать про те, що вміст глюкозо-6-фосфату в кістковому мозку собак після експозиції при 4 0С без кріопротектора знижено, а після експозиції з кріозахистному середовищі, що містить ДМСО або ПЕО-400, дещо підвищено по відношенню до контролю. Це, ймовірно,певно,мабуть пов'язано з тим, що завдяки дії кріопротектора та температури до 0 0С, можливе підвищення функціональної активності клітин, зокрема підвищення їх енергетичних потреб, що відображається на швидкості і узгодженості біохімічних процесів [Грищенко В.И. и др.,1995; Ващенко В.И и др., 2005].

Після кріоконсервування клітин кісткового мозку з ДМСО і ПЕО-400 спостерігається подальше збільшення рівня глюкозо-6-фосфату. Можливо це пов'язано з відновленням функціональної активності клітин кісткового мозку і їх компенсаторною відповіддю на підвищення витрат енергетичного матеріалу, що йдуть на відновлення структури і функцій. Зокрема підвищення рівня глюкозо-6-фосфату вказує на зростання функціональної активності клітин кісткового мозку собак після заморожування-відігріву.

При цьому рівень АТФ в клітинах кісткового мозку собак після експозиції в кріозахистних середовищах, що містять ДМСО та ПЕО-400, достовірно не відрізняється від вмісту цього метаболіту в клітинах після експозиції без кріопротектора. Імовірно на даному етапі незначне пониження рівня АТФ пов'язане із зміною інтенсивності метаболізму при 40С, що можливо призводить до зменшення потреб клітин кісткового мозку в макроергах.

На етапі кріоконсервування з ДМСО не відбувається інтенсивних витрат АТФ і втрат метаболіту через мембрану. Хоча рівень АТФ в клітинах кісткового мозку собак, що кріоконсенвували в присутності обраних концентрацій ПЕО-400 і ДМСО, дещо зменшується, ці зміни можна пояснити інтенсифікацією та відновленням метаболічних процесів в клітинах після відігріву, зокрема відновленням гліколізу, який пов'язано зі споживанням глюкози та утворенням АТФ.

Зниження кількості АТФ, можливо, викликане дефіцитом його синтезу в мітохондріях і збільшенням швидкості ферментативного розщеплювання в результаті інтенсифікації витрат енергії різними транспортними системами, а також ферментами, що регулюють структуру і функції клітини. У результаті макроергичні сполуки витрачаються в значно більшій кількості, ніж в інтактних клітинах за аналогічних умов [Цуцаєва А.А. и др., 1991; Ващенко В.И. и др., 2005].

Для клітин in vitro характерне зменшення окислювального декарбоксилювання пірувату та підвищення утворення молочної кислоти. В період експозиції клітин до заморожування з кріопротектором і без кріопротектора в клітинах кісткового мозку собак не відбувається достовірних змін вмісту пірувату.

В клітинах кісткового мозку собак, кріоконсервированих у присутності ПЕО-400 і ДМСО, рівень пірувату підвищується щодо показників контролю незалежно від концентрації обраного кріопротектора. Можливо, підвищення рівня даного метаболіту пов'язано з інтенсифікацією обмінних процесів в клітках після відігріву. При цьому відмічено, що кріопротектори перешкоджають втраті даного метаболіту через мембрани кріоконсервованих клітин.

Рівень молочної кислоти в клітинах після експозиції без кріопротектора, достовірно не підвищується щодо контролю.

Підвищення рівня молочної кислоти після експозиції клітин кісткового мозку собак з кріопротектором, імовірно пов'язано з тим, що у їх присутності потреба клітин в енергетичному матеріалі зростає, клітини змінюють механізми отримання АТФ і в присутності ПЕО-400 та ДМСО в 10% концентрації ці процеси проходять більш інтенсивно. Таким чином, негативна дія молочної кислоти, що найчастіше проявляється у зниженні рівня рН та внутрішньоклітинному ацидозі, не відбувається тільки під час експозиції клітин кісткового мозку собак з ДМСО у 7% концентрації. Це пояснює менш виражені пошкодження в фосфоліпідному біслої і більшу збереженість клітин кісткового мозку собак, кріоконсервованих з ДМСО у 7% концентрації.

Підвищення рівня молочної кислоти в клітинах кісткового мозку собак, кріоконсервированого з ПЕО-400 і ДМСО, відбувається незалежно від концентрації обраних кріопротекторів. Накопичення цього метаболіту в клітинах можна пояснити інтенсифікацією гліколізу після відігріву. Враховуючи наявність в клітинах кісткового мозку системи білків-транспортерів лактату (МСТ-1 -2, -4), здатних позбавити клітини ацидозу, таке накопичення молочної кислоти можна вважати зворотним [Koho N.M. et al., 2002; Merezhinskaya N. et al., 2004].

Висновки

Вивчення дії заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку і їх біохімічний потенціал є актуальним, зважаючи на необхідність розвитку методів кріоконсервування кісткового мозку і застосування його у ветеринарній практиці. У дисертаційній роботі досліджено дію різних концентрацій кріопротекторів і низькотемпературної консервації на збереження, морфологічні й біохімічні показники клітин, що дає змогу визначити підходи для розробки технології довгострокового зберігання кісткового мозку собак.

1. Показано, що після заморожування-відігріву кісткового мозку собак без кріопротектора зберігається лише незначна кількість бластів, лімфоцитів та гранулоцитів, що становить менш ніж 6% від показників контролю.

2. Встановлено, що ДМСО в 7%, 10% концентрації та ПЕО-400 в 10% і 15% концентрації забезпечують збереження близько 80% всіх видів клітин кісткового мозку собак після заморожування-відігріву. Гліцерин надає недостатньо високий рівень захисту клітин кісткового мозку собак при кріоконсервуванні, що складає від 50% до 60% від показників контролю.

3. Найбільш стійкими до кріоконсервування у присутності кріопротекторів (ДМСО, ПЕО-400, гліцерину) є клітини кісткового мозку, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку. Найбільш чутливі - зрілі клітини, а з них гранулоцити та мегакаріоцити.

4. Заморожування-відігрів клітин кісткового мозку собак призводить до зменшення рівня фосфоліпідів мембран. Використання кріопротектора ДМСО перешкоджає цім змінам та зберігає показники на рівні контроля, ПЕО-400 та гліцерин були менш ефективними. виказані,висловлені

5. Заморожування-відігрів без кріопротектора призводить до зменшення рівня енергетичних субстратів в клітинах кісткового мозку собак. Кріоконсервування клітин кісткового мозку собак з ДМСО 7% концентрації зберігає запас глікогену, рівень АТФ, глюкозо-6-фосфату і пірувату на значеннях, близьких до контрольних.

Перелік опублікованих робіт

1. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Цитохимическое выявление фосфолипидов в гематопоэтических клетках костного мозга собак после замораживания в жидком азоте // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №3.- С. 581-586.

2. Водоп'янова Л.А., Жегунов Г. Ф. Зміни показників мієлограми собак до та після кріоконсервування у рідкому азоті // Біологія тварин - 2005. - Т.7, № 1-2.- С. 245-250.

3. Водопьянова Л.А., Жегунов Г. Ф. Сохранность клеток костного мозга собак после экспозиции с криопротекторами и замораживания в жидком азоте // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16, №2. - С. 207-210.

4. Водопьянова Л.А. Содержание ПВК и лактата в клетках костного мозга собак при криоконсервировании // Вісник проблем біології і медицини. - 2006. - Вип. 4. - С. 10-14.

5. Водоп'янова Л.А., Жегунов Г. Ф. Цитохімічне дослідження глікогену в клітинах кісткового мозку собак після заморозки у рідкому азоті // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету: Зб. наук. праць. - Біла Церква, 2006. - Вид. 36. - С. 226-233.

6. Водоп'янова Л.А., Жегунов Г. Ф. Цитохімічне виявлення глікогену у клітинах кісткового мозку собак після кріоконсервування у рідкому азоті // Матеріали II Міжнародної наукової конференції „Молодь та поступ біології”. - Львів. - 2006. - С.414.

7. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Криоконсервирование клеток костного мозга собак под защитой проникающих и непроникающих криопротекторов // Материалы ежегодной конференции молодых ученых «Холод в биологии и медицине -2006» - Харьков.- 2006. - С. 26.

8. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Влияние криопротекторов и замораживания в жидком азоте на сохранность клеток костного мозга собак // Матеріали 10ой Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Россия, г. Пущино. - 2006 г. - С.71.

9.Gennadiy F. Zhegunov, Larisa A. Vodopyanova Сytochemical revealing of phospholipids in canine bone marrow cells after cryopreservation in liquid nitrogen // Материалы конференции «Сryo 2006» - Hamburg. - 2006. - Р. 99.

10. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Цитохимическое выявление фосфолипидов в клетках костного мозга собак после криоконсервирования в жидком азоте // Материалы IX съезда Украинского биохимического общества. - Харьков. - 2006. - С. 169-170.

11. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Содержание АТФ и глюкозо-6-фосфата в клетках костного мозга собак после криоконсервирования // Український біохімічний журнал. - 2007. - Т. 79, №3. - С. 101-104.

12. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Влияние криоконсервирования на содержание АТФ в клетках костного мозга собак // Материалы V Международного симпозиума «Актуальные проблемы биофизической медицины». Институт физиологии им. А.А. Богомольца. - Киев. - 2007. - С. 40.

13. Водопьянова Л.А., Жегунов Г.Ф. Кріоконсервування клітин кісткового мозку собак під захистом кріопротекторів // Матеріали міжнародної научно-практичній конференції молодих вчених и спеціалістів «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики». Львівська національна академія ветеринарної медицини ім.. С.З. Гжицького. - Львів. - 2007. - С. 21-24.

14. Larisa Vodopyanova, Olga Denysova. Research of dogs` bone marrow cell safety after cryopreservation in liquid nitrogen // Матеріали конференції молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики присвячена 120-річчю М.І. Вавилова. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України. - Київ. - 2007. - С. 114.

Анотація

Водоп'янова Л.А. Вплив кріопротекторів та заморожування-відігріву на клітини кісткового мозку собак. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу кріопротекторів і заморожування-відігріву на структурно-функціональний стан кісткового мозку собак.

Одержані в роботі результати свідчать про те, що найбільш ефективним кріопротектором для кріоконсервування клітин кісткового мозку собак є ДМСО у 7% концентрації. ПЕО-400 і гліцерин також мають протективну дію на клітини кісткового мозку собак, але при цьому в суспензії значно зменшується кількість зрілих гранулоцитів, мегакаріоцитів. Після кріоконсервування з 7%-м ДМСО, на відміну від ПЕО-400 та гліцерину, зміни вмісту мембранних фосфоліпідів в клітинах кісткового мозку собак були мінімальні.

Встановлено, що після кріоконсервування клітин кісткового мозку собак з ДМСО 7%, 10%, показники субстратів енергетичного обміну (глікоген, АТФ, піруват), що визначають основні функціональні показники клітин, значно не відрізнялися від таких у контролі. При цьому відмічено підвищення рівня глюкозо-6-фосфату та молочної кислоти в клітинах після кріоконсервування, що свідчить про інтенсифікацію обмінних процесів в клітинах після відігріву.

Ключові слова: кріоконсервування, клітини кісткового мозку собак, кріопротектори, глікоген, АТФ, глюкозо-6-фосфат, піруват, молочна кислота.

Аннотация

Водопянова Л.А. Влияние криопротекторов и замораживания-отогрева на клетки костного мозга собак. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицини НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния криопротекторов и замораживания-отогрева на структурно-функциональное состояние костного мозга собак.

Костный мозг криоконсервировали в присутствии глицерина, ДМСО и ПЭО-400. После замораживания-отогрева методом световой микроскопии оценивали сохранность клеток и показатели миелограммы. Цитохимическими методами исследовали содержание мембранных фосфолипидов и внутриклеточного гликогена. Модификацию метаболической стабильности клеток костного мозга собак определяли по изменению концентрации АТФ, пирувата, глюкозо-6-фосфата и молочной кислоты.

Установлено, что глицерин недостаточно эффективен для защиты большинства видов клеток, представленных в гетерогенной популяции костного мозга собак при выбранном режиме криоконсервирования. При исследовании свойств ДМСО было показно, что в концентрации 7% он сохраняет до 83,5±2% ККМ собак. При этом сохраняется гетерогенная популяция костного мозга. После криоконсервирования с ПЭО-400 сохранность клеток составляла от 63±1,6% до 73±1,7%, за счет сокращения количества зрелых гранулоцитов.

Цитохимические исследования, показали, что степень изменений в фосфолипидном бислое мембран клеток костного мозга собак после замораживания-отогрева зависит от применяемого криопротектора. Характер развития изменений в ФЛ слое мембран ККМ собак, замороженных в присутствии глицерина, может свидетельствовать о происходящем нарушении барьерных, механо-эластических и других свойств мембран данных клеток, в то время как при криоконсервированнии с ДМСО и ПЭО-400 наблюдалась стабильность в данных показателях.

В то же время, содержание гликогена в клетках костного мозга собак при криоконсервировании с ДМСО значительно не отличается от показателей контроля, что может свидетельствовать об их структурно-функциональной полноценности. Значительное уменьшение уровня гликогена в клетках костного мозга собак происходит при криоконсервировании с глицерином, что характеризует его как менее эффективный криопротектор для данного объекта.

Не менее важными показателями метаболизма клеток костного мозга является уровень глюкозо-6-фосфата и АТФ. После экспозиции и замораживания-отогрева в криозащитных средах, содержащих ДМСО и ПЭО-400, уровень глюкозо-6-фосфата в клетках костного мозга собак несколько повышается в сравнении с контрольними показателями, что отражает рост функциональной активности в клетках костного мозга собак после замораживания-отогрева. В то же время уровень АТФ после экспозиции в криозащитной среде, содержащей ДМСО в 7% концентрации, достоверно не отличается от содержания данного метаболита в интактных клетках костного мозга собак.

Известно, что на интенсивность большинства процессов, происходящих в клетках, может влиять изменение рН внутриклеточной среды, вызванное накоплением конечных продуктов гликолиза. В работе приведены результаты исследования уровня пирувата и молочной кислоты. Так по представленным в работе данным видно, что в период экспозиции до замораживания как без криопротектора, так и с ДМСО и ПЭО-400 до замораживания, в клетках костного мозга собак не происходит достоверных изменений в содержании пирувата. При этом уровень молочной кислоты в клетках костного мозга собак после экспозиции без криопротектора, достоверно не повышается относительно показателей контроля, а в клетках после экспозиции с криопротекторами уровень молочной кислоты повышается незначительно. Вероятно, это связано с тем, что в присутствии криопротекторов потребность клеток в энергетическом материале возрастает, ККМ собак меняют механизмы получения АТФ и в присутствие растворов ПЭО-400 и ДМСО 10% концентрации эти процессы протекают интенсивнее.

После замораживания-отогрева в клетках костного мозга собак в присутствии растворов криопротектора уровень пирувата повышается относительно контроля, что, по всей видимости, связано с интенсификацией обменных процессов.

Полученные результаты свидетельствуют, что уровень молочной кислоты в ККМ собак, криоконсервированных под защитой криопротекторов, хотя и повышается в сравнении с показателями контроля, но такое повышение незначительно отличается от показателей в ККМ после экспозиции с криопротектором до замораживания.

Ключевые слова: криоконсервирование, клетки костного мозга собак, криопротекторы, гликоген, АТФ, глюкозо-6-фосфат, пируват, молочная кислота.

Summary

Vodopyanova L.A. Influence of cryoprotectants and froze-thaw on the bone marrow cells of dogs. - A manuscript.

Thesis for the candidate of biological science degree in specialty 03.00.19. - Cryobiology. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, - 2008.

Thesis covers study of influence of cryoprotectants and froze-thaw on structural and functional state of the bone marrow of dogs.

The results obtained in the work testify to the fact, that 7% DMSO is the efficient cryoprotectant during cryopreservation for bone marrow cells of dogs. PEO-400 and glycerol are capable to preserve cells during cryopreservation, but suspension of cells considerably lost the number of cells on the finish study of development клітин.

After cryopreservation with 7% DMSO in contrast to PEO-400 and glycerol the changes of phospholipids bilayer of dogs bone marrow cells were least.

After cryopreservation of dogs bone marrow cells with 7%, 10% DMSO indexes of metabolites of power exchange (glycogen, ATP, pyruvate), which determine the basic functional indexes of cells, considerably did not differ from such in control level keep. The increase of level of glucose-6-phosphate and lactic acid is thus marked in cells after cryopreservation.

Key words: cryopreservation, bone marrow cells of dogs, cryoprotectants, glycogen, ATP, glucose-6-phosphate, pyruvate, lactic acid.

Размещено на Allbest.ru

...