Ідентифікація генотипів соняшника за допомогою ДНК-маркерів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 575.11.113:854.78

03.00.22 - молекулярна генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ІДЕНТИФІКАЦІЯ ГЕНОтипів СОНЯШНИКА ЗА ДОПОМОГОЮ ДНК-МАРКЕРІВ

ТРОЯНОВСЬКА

АЛІНА В'ЯЧЕСЛАВІВНА

КИЇВ

2008



ДИСЕРТАЦІЄЮ Є РУКОПИС

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (м. Одеса).

Науковий доктор біологічних наук, професор, академік УААН

керівник Сиволап Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр в рослинництві УААН, директор.

Офіційні доктор біологічних наук

опоненти Тищенко Олена Миколаївна,

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України,

в.о. завідувача відділу генетичної інженерії;

кандидат біологічних наук, с.н.с.

Спірідонова Катерина Василівна

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу генетики клітинних популяцій.

Захист дисертації відбудеться "25" червня 2008 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано " 23 " травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О. В. Підпала



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження організації та мінливості геному має важливе теоретичне та практичне значення. Останнім часом геном рослин завдяки бурхливому розвитку молекулярної біології та молекулярної генетики, а також важливості для забезпечення людини продуктами харчування та сировини для промисловості став популярним об'єктом вивчення. Різним етапам розвитку технології виявлення варіабельності геному притаманна різна роздільна здатність у диференціації та аналізі структури геному.

Особливе значення в дослідженні геному рослин мають маркерні системи, засновані на аналізі високоваріабельних ділянок ДНК. Полімеразна ланцюгова реакція, що дозволяє ампліфікувати фрагменти ДНК в мільйон разів, зробила аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму ефективним засобом диференціації видів та сортів рослин.

Серед різних методів ПЛР-аналізу привертає увагу кодомінантна система SSR-маркерів, що дозволяє вивчати поліморфізм мікросателітів. Мікросателіти розподілені на всіх хромосомах і становлять значну частину геному рослин, а їхній поліморфізм відображає генетичні особливості генотипу. Кодомінантні мікросателітні маркери дозволяють досліджувати на молекулярному рівні генетичну однорідність та гетерогенність сорту, типовість гібриду, виявити алельний склад визначених локусів та зробити "прозорою" структуру сорту, лінії, гібриду. SSRР-аналіз є одним із найінформативніших у молекулярно-генетичному дослідженні видів рослин, які широко використовують у сільському господарстві.

Інтенсивне дослідження соняшника в генетичному та молекулярно-генетичному аспекті розпочато не так давно у зв'язку із селекцією гібридів цієї культури. В Україні селекційну роботу на культурі соняшника проводять ряд селекційних центрів, також використовують гібриди закордонної селекції. Виникла необхідність диференціації та ідентифікації комерційних генотипів, встановлення їхньої типовості та генетичної чистоти. Генотип у сучасному розумінні молекулярної генетики характеризується набором унікальних алелей. У зв'язку з тим, що SSRР-аналіз дозволяє виявити поліморфізм (алелізм) певного локусу, на даний момент, оптимальним для характеристики та ідентифікації генотипів є аналіз мікросателітних повторів. У зв'язку з цим, теоретичний та практичний інтерес становить розробка ідентифікаційної системи мікросателітних маркерів та їхнє використання для характеристики генотипів ліній і гібридів соняшника. На особливу увагу в цьому плані заслуговує матеріал української селекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру в рослинництві УААН (ПБЦ) у межах науково-технічної програми УААН "Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр." (№ державної реєстрації 318/92 від 24.10.2001 р.), Підпрограми 1 "Новітні біотехнології в рослинництві" (№ державної реєстрації 0104U003557, від 19.03.2004 р.), за Напрямом 3 "Використання молекулярно-біологічних методів в генетико-селекційній роботі", за Проблемою 3.1. „Створення вихідного селекційного матеріалу основних сільськогосподарських культур з використанням молекулярних маркерів" (№ державної реєстрації 0104U003555, від 19.03.2004 р.), завданням 3.1.2.3. "Вивчення молекулярно-генетичного поліморфізму соняшника" (№ державної реєстрації 0104U002696, від 31.03.2004 р.).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи - вивчення молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів соняшника, алельного складу високоваріабельних мікросателітних локусів, а також розробка технології ідентифікації та створення інформаційної бази даних ДНК- типування досліджених ліній та гібридів.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Оцінка інформативності та відбір високополіморфних мікросателітних локусів соняшника для досліджуваних генотипов.

2. Дослідження молекулярно - генетичного поліморфізму генотипів соняшника української селекції за допомогою мікросателітного аналізу.

3. Вивчення частотних характеристик алелів та індексу поліморфності досліджених локусів.

4. Створення тест-системи для встановлення типовості та гібридності генотипів.

5. Формування бази даних ДНК-типування мікросателітних локусів ліній і гібридів соняшника. Створення ідентифікаційних генетичних формул.

Об'єкт дослідження: молекулярно-генетичний поліморфізм мікросателітних локусів геному соняшника (Helianthus annuus L.).

Предмет дослідження: геном соняшника (Helianthus annuus L.).

Методи дослідження: виділення ДНК, ПЛР-аналіз (SSRР), електрофорез в поліакриламідних гелях, визначення генетичних дистанцій, кластерний аналіз, обробка даних за допомогою комп'ютерних програм.

Наукова новизна одержаних результатів. Характеристика генотипічної мінливості мікросателітних локусів геному соняшника, оцінка частотних характеристик алелів досліджених локусів, розробка ДНК технології диференціації, ідентифікації, визначення гібридності простих гібридів F1 і реєстрації генотипів за допомогою високоваріабельних мікросателітних маркерів, а також створення бази даних ДНК-типування.

Практичне значення одержаних результатів полягає у визначенні найполіморфніших мікросателітних локусів геному соняшника, оцінці їхньої інформативності; встановленні генетичних взаємовідносин між досліджуваними генотипами соняшника; запропонуванні тест-системи для визначення типовості та гібридності селекційних форм, а також створенні ідентифікаційних формул генотипів інбредних ліній і гібридів соняшника.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом д.б.н., професора, академіка УААН Ю.М. Сиволапа. Здобувачем особисто проаналізовано літературні джерела за темою дисертаційної роботи, виділено ДНК досліджуваних зразків (20 інбредних ліній і 14 простих гібридів F₁) соняшника. Підібрано праймери, що виявляють поліморфізм у досліджуваних зразках, детектовано молекулярно-генетичний поліморфізм 34 генотипів соняшника, вивчені частотні характеристики алелів відібраних мікросателітних локусів. Створені тест-системи за мікросателітними локусами для визначення типовості та гібридності генотипу, а також генетичні формули для проаналізованих гібридів та ліній соняшника.

Здобувач висловлює щиру подяку науковому керівнику, директору ПБЦ академіку УААН Ю. М. Сиволапу за цінні поради при проведенні дослідів; к.б.н., с.н.с. відділу молекулярної генетики ПБЦ А.Є. Солоденко; доктору С. Дж. Кнапу з Орегонського державного університету (м. Корваліс, Орегон, США) за люб'язно надану інформацію про мікросателітні локуси геному соняшника; співробітникам відділу молекулярної генетики (ПБЦ), а також професору В. В. Бурлову (Селекційно-генетичний інститут - Національний центр насіннєзнавства та сортовивчення), професору В. В. Кириченко (Інститут рослинництва ім. В. Я. Юр'єва), к.б.н. В. В. Толмачову (Інститут олійних культур) за люб'язно наданий матеріал для дослідження.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були презентовані на 2-й Міжнародній конференції молодих вчених "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений" (Харків, 2003); на 4-й Міжнародній конференції "Геном растений" (Одеса, 2003); на Міжнародній конференції молодих вчених з молекулярної біології та генетики (Київ, 2003); на Міжнародній науковій конференції "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Мінськ, Білорусь, 2004); на Міжнародній конференції "Генетические ресурсы для адаптивного растениеводства" (Львів, 2004); на Міжнародній науковій конференції "Современные проблемы генетики" (Мінськ, Білорусь, 2005); на Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей" (Одеса, 2007).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у двох статтях, Деклараційному патенті України на винахід і тезах шести доповідей на міжнародних конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, яка має два розділи, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних літературних джерел, що налічує 160 найменувань. Матеріал дисертації викладено на 115 сторінках машинописного тексту, містить 19 таблиць і 16 рисунків.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі використано 34 генотипи соняшника (Helianthus annuus L.) 20 інбредних батьківських ліній, отриманих із трьох основних центрів селекції даної сільськогосподарської культури в Україні: Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення (СГІ, м. Одеса), Інституту рослинництва імені В. Я. Юр'єва (ІР, м. Харків), Інституту олійних культур (ІОК, м. Запоріжжя), а також 14 простих гібридів F₁.

Всі лінії занесено до Державного реєстру сортів рослин України.

Центри селекції представлено такими генотипами:

СГІ - 12 генотипів: інбредні лінії - 1036 А, 3369 А, 1750 А, 42 А, 7 В, 4 В, RHA; гібриди - Одеський 149, Одеський 504, Одеський 122, Одеський 123, Згода.

ІОК - 9 генотипів: інбредні лінії - ЗЛ 102, Сх 1002, ЗЛ 95, ЗЛ 678, Х 712, ЗЛ 7/8229; гібриди - Запорізький 26, Зустріч, Запорізький 14.

ІР - 13 генотипів: інбредні лінії - Сх 1006, Сх 2111, Сх 908, Х 526, Х 711, Х 782, Х 762, гібриди - Еней, Погляд, Світоч, Красень, Кий, Харківський 49.

Виділення ДНК. ДНК виділяли з етиольованих паростків. Паростки розтирали в епендорфі з 0,5 мл лізуючого буфера (1,4 M NaCl; 20 mM Na₃EDTA; 100 mM трис-HCl pH 8,0 (25 ⁰C), 2 % CTAB). Інкубували на водяній бані протягом 50-60 хв при 60 ⁰С. Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформу та ізоамілового спирту (24:1). Центрифугували протягом 4 хв у центрифузі "Eppendorf 5415" при 12000 об/хв, водну фазу (не зачіпаючи інтерфази) переносили у новий епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом 5 хв при 14000 об/хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали двічі 0,3 мл та додатково 0,2 мл 70 % етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 300 мкл розчину ТЕ (10 мM трис-HCl, pH 8,0; 1 мM Na₃EDTA).

Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-100 у розчині 1 х TNE (10 мM трис-HCl, pH 7,4 (25 С); 100 мM NaCl; 1 мM Na₃ЕDTA) з 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258 та 4 мкл зразка ДНК.

Ампліфікація мікросателітної ДНК за допомогою ПЛР. Реакційна суміш ПЛР об'ємом 20 мкл містила: 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCl (рН 8,4 при 25 ⁰С); 1-3 мМ MgCl₂ (залежно від праймерів); 0,01 % Tween-20; 0,15 мМ кожного dNTP; 0,2 мкМ праймера; 10-20 нг ДНК; 0,8-1 од. Taq-полімерази. Для ампліфікації використовували прилад "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Умови ПЛР для SSR-праймерів: початкова денатурація - 94 ⁰С 2 хв, далі 30 с, гібридизація - 55-60 ⁰С (залежно від праймерів) 30 с, елонгація - 72 ⁰С 1 хв, повторення цих етапів 35 разів, остання елонгація - 5 хв.

Електрофорез та візуалізація продуктів ампліфікації ДНК. Для електрофоретичного розподілення продуктів ампліфікації використовували 10 % поліакриламідні гелі (10 % акриламід, 1 x TBE, 8 М сечовина). Для нанесення зразків використовували буфер: 0,25 % бромфеноловий синій; 0,25 % ксиленціанол. Електрофорез проводили на обладнанні Helicon (Росія) при напрузі 2 В/см при 55 ⁰С. Забарвлювали продукти ампліфікації у ПАА-гелях за допомогою 0,012 М AgNO₃. Документували отримані електрофореграми за допомогою відеосистеми VDS (Amersham Pharmacia Biotech). Для визначення розміру фрагмента ампліфікації ДНК (в п.н.) використовували маркери молекулярної маси - pUC19/MspI (501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 110, 67, 34, 26 п.н.) та pBlue/MspI (501, 489, 404, 331, 242, 190, 157, 147, 110, 67, 34, 26 п.н.) за допомогою комп'ютерної програми "Image Master 1D Elite".

Визначення рівня поліморфізму та генетичних дистанцій. Рівень поліморфізму для кожного проаналізованого SSR-локусу розраховано за формулою для визначення індексу поліморфності (PIC):

n

PIC = 1-? Р_іj²,

_i = 1

де Р_іj - фенотипічна частота кожного _j-ого фрагмента для кожного _і-ого мікросателітного локусу.

Для оцінки генетичних дистанцій (ГД) фрагменти, отримані в результаті ампліфікації SSR-локусів, позначали як присутні (А) або відсутні (С). Для побудови схем, що відображають подібність між досліджуваними зразками на базі електрофоретичних спектрів, використовували комп'ютерну програму TREES, яка включає визначення генетичних дистанцій та кластерний аналіз.

Генетичні дистанції оцінені, виходячи із співвідношення:

D_xy = -ln F,

де D_xy - генетична дистанція між зразками x і y , F - коефіцієнт подібності (міра подібності).

У даному випадку використовували коефіцієнт подібності Nei і Li (Nl_xy),

F(Nl_xy) = 2n_xy/(n_x+n_y),

де F(Nl_xy) - коефіцієнт подібності Nei і Li, n_xy - сума загальних для двох зразків смуг, n_x і n_y - кількість смуг у зразках x і y.

Nl_xy може бути представлений як число нуклеотидних замін на сайт рестрикції або на сайт праймування при ампліфікації.

Кластерний аналіз проводили, використовуючи незважений парногруповий метод із арифметичним усередненням UPGMA. Даний підхід дозволяє будувати дендрограми, послідовно поєднуючи зразки (групи зразків) у порядку зростання генетичних дистанцій між ними. При цьому отримані значення узагальнюються при кожному циклі підрахунків.

Результати дослідження та їх обговорення. Добір мікросателітних праймерів для детекції поліморфізму. На першому етапі даного дослідження проводили добір умов ампліфікації для мікросателітних праймерів, які детектують міжлінійний поліморфізм. Згідно з літературними даними (Tang et al., 2002; Paniego et al., 2002) 32 пари SSR-праймерів виявляли поліморфізм у генотипів соняшника світової селекції.

Продукти ампліфікації за деякими SSR-локусами (На 1209, На 1327, На 1626) були складними "багатосмугастими" електрофоретичними спектрами. В більшості випадків такий тип спектрів неможливо пояснити гетерозиготністю або гетерогенністю матеріалу. Як зазначено в роботі (Paniego et al, 2002), причиною виникнення таких спектрів можуть бути дуплікації мікросателітних локусів та фланкуючих їх послідовностей в геномі соняшника. Подібні локуси неможливо використовувати для ДНК - типування.

З використаних в роботі 32 пар мікросателітних праймерів п'ять виявились неполіморфними (ORS 1, ORS 2, ORS 5, ORS 16, ORS 32) і детектували один алель, а у випадку з праймером ORS 1030 - два алелі, характерних для всієї вибірки генотипів; 10 пар праймерів (ORS 656, ORS 687, ORS 1144, ORS1238, Ha 1209, Ha 1327, Ha 1442, Ha 1287, Ha 1354, Ha 1626) давали складні спектри ампліфікації. При заміні умов полімеразної ланцюгової реакції з даними праймерами продукти ампліфікації взагалі були відсутні. З подальшої роботи такі праймери вилучались, так як не мали інформаційної цінності.

Із загальної кількості мікросателітних праймерів нами добрано 16 пар, кожна з яких виявляла поліморфізм (рис.1). Деякі праймери були поліморфними для генотипів одного центру, але, в той же час, могли детектувати один алель на матеріалі, отриманому з іншого центру створення даної культури в Україні.

1 2 3 К М 4 5 6 7 8 9

SSRP-аналіз генотипів соняшника української селекції. Згідно даним (Knapp et al., 2002) досліджені SSR-локуси локалізовані на 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16 групах зчеплення (з представлених 17).

Поліморфізм SSR-ділянки виявляється за рахунок відмінності у кількості коротких тандемних повторів, тому гетерозиготність за даним типом звичайна, отже, дані локуси можуть бути використані як кодомінантні генетичні маркери для ідентифікації генотипів.

Досліджені генотипи соняшника перевірені на наявність міжлінійного поліморфізму за 16 мікросателітними локусами (табл.1).

На підставі отриманих даних розподілення алелів 16 мікросателітних локусів за допомогою кластерного аналізу UPGMA побудовано дендрограму, яка відображає феногенетичні взаємовідносини між дослідженими інбредними лініями соняшника (рис. 2).

Дана дендрограма складається з двох кластерів, в перший кластер увійшли всі генотипи СГІ та ІОК, які в свою чергу формують два субкластери. Можливо, це пояснюється використанням селекціонерами генетично споріднених вихідних форм.

Другий кластер сформовано винятково генотипами ІР.

Таблиця 1

Характеристика досліджених SSR-локусів соняшника

Локус	Повтор	Всього алелів	PIC
Ha 1796	(ATT)	3	0,62
Ha 1608	(ATT)	8	0,84
ORS 3	(AGT)	5	0,72
ORS 4	(AGG)	3	0,64
ORS 78	(AAG)	5	0,74
ORS 509	(AT)(GT)	8	0,78
ORS 595	(AG)	7	0,8
ORS 815	(CTT)	5	0,75
ORS 307	(AT)(GT)	3	0,5
ORS 599	(AG)	8	0,77
ORS 533	(CT)	3	0,4
ORS 1024	(AG)	5	0,69
ORS 409	(AC)	4	0,67
ORS 546	(CT)	5	0,7
ORS 364	(AC)	3	0,47
ORS 602	(CT)	2	0,1

Створено інформаційну базу даних, що включає молекулярно-генетичну характеристику алельного стану 16 МС локусів для 34 генотипів соняшника української селекції.

Алельне різноманіття досліджених ліній соняшника за найполіморфнішими мікросателітними локусами. На вибірці досліджених генотипів виявлено чотири найполіморфніших локуси (На 1608, ORS 509, ORS 599, ORS 595), три з яких детектували вісім алелів і один - сім алелів.

За локусом На 1609 інбредні лінії селекції ІМК та СГІ представлені двома алельними варіантами. У генотипів ІМК п'ять із шести батьківських форм представлено алелем 164 п.н., і одна - 173 п.н; алель 228 п.н., характерний для чотирьох інбредних ліній, і 263 п.н. - для трьох ліній селекції СГІ; генотипи ІР представлено чотирма алельними варіантами - 217, 235, 247, 253 п.н., рівною мірою, таким чином, даний локус є найполіморфнішим для генотипів ІР.

Локус ORS 509 виявив вісім алельних варіантів. Генотипи СГІ представлені одним алелем - 204 п.н., представники селекції ІР виявили три алельних форми - 212, 234, 259 п.н., генотипи ІОК за даним локусом є найполіморфнішими - 183, 186, 195, 208 п.н.

Мікросателітний локус ORS 599 на досліджених генотипах також детектував вісім алельних варіантів. Батьківські лінії селекції ІР представлено трьома алельними варіантами - 199, 203, 210 п.н. У інбредних ліній селекції СГІ виявлено чотири алелі - 179, 186, 190, 193 п.н. У представників селекції ІМК - два алелі; алель 184 п.н. присутній у однієї батьківської форми, у інших ліній виявлено алель розміром 190 п.н.

Всього за локусом ORS 595 виявлено сім алельних варіантів. У представників селекції ІОК детектовано два алельних варіанти. У однієї батьківської форми виявлено алель розміром 143 п.н, у інших - 179 п.н. Для батьківських ліній селекції СГІ характерними є три алелі - 140, 179, 185 п.н. Для інбредних ліній селекції ІР характерними є алельні варіанти - 127, 168, 173 п.н.

На підставі отриманих результатів можна зробити висновок, що за алельним складом чотирьох найполіморфніших мікросателітних локусів інбредні лінії соняшника різного походження відрізняються, що, в свою чергу, спрощує завдання ідентифікації даних генотипів.

Частотні характеристики алелів мікросателітних локусів у досліджених генотипів. На проаналізованій вибірці генотипів за 16 мікросателітними локусами всього виявлено 77 алельних варіантів, від двох до восьми алелів у локусі, що в середньому складає 4,81 алеля на мікросателітний маркер. Для оцінки інформативності кожного SSR-локусу визначали частоти зустрічальності алелів та індекс поліморфності (РІС). Чим більше виявлених алелів у локусі та менше частоти їхньої зустрічальності, тим ціннішим він є для визначення поліморфізму та диференціації генотипів. Локуси з такими показниками - оптимальне джерело ДНК-маркерів для проведення ідентифікації та паспортизації.

Середнє число виявлених алелів можна розглядати як показник генетичного різноманіття. На вибірці генотипів ІОК середня кількість алелів у локусі склала 2,38 алелів/локус, для представників селекції ІР дане значення склало - 2,31; для селекційних форм СГІ - 2,13 алелів у локусі. Таким чином, найполіморфніший матеріал - генотипи ІОК, найменш поліморфний - селекційні форми СГІ.

Найполіморфнішими з досліджених 16 МС-локусів були Ha 1608, ORS 509, ORS 599 (детектовано вісім алелів), та ORS 595 (детектовано сім алелів).

Для найменш поліморфного локусу - ORS 602, на всій вибірці генотипів детектовано два алелі.

Для кожного проаналізованого локусу підраховано значення індексу поліморфності (РІС), яке варіювало від 0,1 до 0,84.

Середнє значення РІС для досліджених мікросателітних локусів склало 0,64, а середня кількість виявлених алелів у локусі - 4,8, що, в цілому, відповідає літературним джерелам.

Найполіморфнішими були динуклеотидні складні повтори, які в середньому виявляли 5,5 алелів у локусі, тринуклеотидні маркери в середньому виявляли 4,83 алелів/локус, динуклеотидні прості повтори - 4,62.

Значення індексу поліморфності у динуклеотидних складних маркерів варіювало від 0,5 до 0,78, що в середньому склало 0,64; для тринуклеотидних - від 0,64 до 0,84, середнє значення РІС - 0,72; динуклеотидні маркери показували значення РІС від 0,1 до 0,8, середнє значення склало 0,575.

За допомогою SSRР-аналізу диференційовані всі досліджені генотипи соняшника, розподілення інбредних ліній на дендрограмі відповідає їхньому походженню. Охарактеризовано найполіморфніші МС локуси геному соняшника; виявлено специфічні для окремих генотипів алелі; встановлено середнє значення РІС для кожного локусу, класу мікросателітного повтору, а також для генотипів, отриманих із певних центрів селекції.

Диференціювальна здатність SSR-аналізу. Система ідентифікації генотипів повинна включати оптимальну кількість поліморфних локусів, що виявляють найбільшу кількість алелів, а маркерні спектри повинні бути чіткими. Обов'язковим етапом у роботі із створення системи ідентифікації є визначення якісних характеристик маркерів і дослідження алельного різноманіття за кожним із локусів.

За низкою локусів виявлено алелі, характерні для генотипів певного селекційного центру, що диференцюють генетичний матеріал, створений в СГІ, ІОК та ІР.

Деякі мікросателітні маркери дозволили чітко відокремити материнські форми від батьківських, так, наприклад, за локусом ORS 78 на харківському матеріалі виявлено два алелі, алель 204 п.н., характерний винятково батьківським формам ( Х526, Х711, Х762, Х782 ), алель 212 п. н. - материнським (Сх1006, Сх2111, Сх908).

Для одеських генотипів таким маркером був локус На1608, із двох виявлених алелів,

алель 228 п.н. спостерігали в усіх материнських інбредних ліній, алель 263 п.н. - у батьківських.

Отримані результати свідчать про те, що поліморфні маркери, за якими виявлено алелі, характерні для генотипів певного центру створення, тобто, характерні алелі, є найціннішими для ідентифікації генотипів. За допомогою проаналізованих 6 мікросателітних локусів (ORS 78, На 1608, ORS 3, ORS 509, ORS 595, ORS 599) можна диференціювати весь досліджений матеріал соняшника.

Досліджені генотипи соняшника української селекції за 16 SSR-локусами мають унікальні поєднання алелів.

ДНК-типування при ідентифікації та реєстрації генотипів. За допомогою SSRP-аналізу вдалося ідентифікувати досліджені генотипи соняшника, а також, на підставі отриманих даних, виконати реєстрацію представлених селекційних форм.

Реєстрували генотипи таким чином: мікросателітний локус кодували буквою латинського алфавіту (табл. 2), в нижньому індексі наводили розмір алеля, характерного даному генотипу за конкретним локусом.

Таблиця 2

Кодування мікросателітних локусів

Локус	Код локусу	Локус	Код локусу	Локус	Код локусу
На 1796 На 1608 ORS 3 ORS 4 ORS 78 ORS 509	A B C D E F	ORS 595 ORS 815 ORS 599 ORS 307 ORS 533 ORS 1024	G H I J K L	ORS 409 ORS 546 ORS 364 ORS 602	M N O P

В табл. 3 подано генетичні формули генотипів ІР. Наведені дані відображають генетичне різноманіття батьківських інбредних ліній, а також показують гетерозиготність гібридів соняшника за локусами, які є поліморфними для вихідних форм.

У гібриду Еней, згідно розподіленню алелів за шістьма локусами На 1608, ORS 78, ORS 509, ORS 599, ORS 307, ORS 533 виявлено гетерозиготний стан, за іншими десятьма локусами - гомозиготний.

Для гібриду Світоч гетерозиготний стан показують нижченаведені вісім локусів - На 1796, На 1608, ORS 78, ORS 595, ORS 307, ORS 533, ORS 546, ORS 364.

Гетерозиготний стан за дев'ятьма локусами - На 1608, ORS 3, ORS 78, ORS 595, ORS 599, ORS 533, ORS 1024, ORS 546, ORS 364, характерний для гібриду Погляд.

Гетерозиготи за вісьмома локусами На 1796, На 1608, ORS 78, ORS 509, ORS 815, ORS 1024, ORS 546, ORS 364, характерні для гібриду Кий.

Для гібриду Харківський 49 гетерозиготний стан виявлено за сімома локусами - На 1608, ORS 78, ORS 595, ORS 599, ORS 533, ORS 1024, ORS 364.

Гібрид Красень гетерозиготний тільки за двома локусами - ORS 78, ORS 364, за іншими 14 локусами даний генотип - гомозиготний (табл.3).

Таблиця 3

Генетичні формули генотипів ІР

Генотип	Формула генотипу
X 526	A235B217C226D157E204F212G168H183I199J153K150L232M135N166O231P253
Еней	A235B217,235C226D157E204,212F212,259G168H183I199,203J149,153K150,153L232 M135N166O231P253
Cx 1006	A235B235C226D157E212F259G168H183I203J149K153L232M135N166O231P253
Світоч	A165,235B247,235C226D157E204,212F259G127,168H183I203J153,149K150,153L232 M135N161,166O228,231P253
X 711	A165B247C226D157E204F259G127H183I203J153K150L232M135N161O228P253
Погляд	A165B235,247C230,226D157E212,204F259G127,168H183I203,210J153K150,153 L224,232M135N161,169O225,228P253
Cx 2111	A165B235C230D157E212F259G168H183I210J153K153L224M135N169O225P253
Cx 908	A165B253C226D157E212F259G173H183I210J153K153L235M135N161O231P253
Кий	A165,235B253,247C226D157E204,212F234,259G173H180,183I210J153K153L235,224 M135N161,169O225,231P253
X 762	A235B247C226D157E204F234G173H180I210J153K153L224M135N169O225P253
X782	A165B253C226D157E204F259G173H183I210J153K153L235M135N161O225P253
Красень	A165B253C226D157E204,212F259G173H183I210J153K153L235M135N161 O225,231P253
Харківський 49	A165B253,247C226D157E204,212F259G127,173H183I210,203J153K150,153L232,235 M135N161O228,231P253

У гібриду Запорізький 26 гетерозиготний стан спостерігали за чотирма локусами - ORS 509, ORS 595, ORS 815, ORS 1024.

Гібрид Зустріч гетерозиготний за п'ятьма локусами - ORS 78, ORS 509, ORS 815, ORS 409, ORS 546.

Для гібриду Запорізький 14 виявлено гетерозиготи за дев'ятьма локусами - На 1796, На 1608, ORS 3, ORS 78, ORS 815, ORS 599, ORS 546, ORS 364, ORS 602 (табл.4).

Для гібриду селекції СГІ - Одеський 149 - гетерозиготними є чотири локуси - На 1608, ORS 78, ORS 1024, ORS 364.

Для гібриду Одеський 504 показано наявність гетерозигот за сімома локусами - На 1796, На 1608, ORS 595, ORS 815, ORS 599, ORS 533, ORS 409.

У гібриду Одеський 122 виявлено гетерозиготи за вісьмома локусами - На 1796, На 1608, ORS 78, ORS 595, ORS 815, ORS 599, ORS 533, ORS 409.

Гібрид Одеський 123 гетерозиготний за вісьмома локусами - На 1796, На1608, ORS 78, ORS 595, ORS 815, ORS 599, ORS 533, ORS 409.

Для гібриду Згода гетерозиготи характерні за шістьма локусами - На 1608, ORS 78, ORS 595, ORS 815, ORS 533, ORS 1024 (табл.5).



Таблиця 4

Генетичні формули генотипів ІОК

Генотип	Формула генотипу
ЗЛ 102	A235B164C232D157E155F208G179H180I190J153K153L232M138N159O225P253
Запорізький 26	A235B164C232D157E155F186,208G143,179H180,190I190J153K153L229,232M138 N159 O225P253
ЗЛ 678	A235B164C232D157E155F186G143H190I190J153K153L229M138N159O225P253
Сх 1002	A235B164C232D160E161F195G179H186I190J149K153L229M138N169O225P253
Зустріч	A235B164C232D160E155,161F183,195G179H180,186I190J149K153L229M138,142 N161,169O225P253
Х712	A235B164C232D160E155F183G179H180I190J149K153L229M142N161O225P253
ЗЛ 95	A235B164C228D160E161F195G179H183I190J149K153L229M132N161O225P247
Запорізький 14	A165,235B164,173C228,232D160E161,155F195G179H183,186I184,190J149K153L229 M132N161,164O225,228P247,253
ЗЛ 7/8229	A165B173C232D160E155F195G179H186I184J149K153L229M132N164O228P253

Тест-система для визначення типовості та гібридності. Для визначення типовості батьківських ліній тестується ДНК 50 індивідуальних паростків кожної лінії за допомогою 10-15 пар мікросателітних праймерів, визначається внутрішньолінійна чистота генотипу. У випадках, коли профілі ДНК зразків однієї лінії за одним мікросателітним локусом відрізняються, вважається, що лінія гетерогенна.

Для встановлення гібридності тестується ДНК гібриду та його батьківських форм. У цьому випадку для даного аналізу використовують мікросателітні локуси, за якими батьківські лінії представлено алелями різної молекулярної маси. При поєднанні у гібриду профілів батьківських форм вважається, що гібридність становить 100 %.

Таблиця 5

Генетичні формули генотипів СГІ

Генотип	Формула генотипу
42 А	A252B228C223D172E204F204G185H180I179J181K153L229M132N166O225P253
Одеський 149	A252B228,263C223D172E204,216F204G185H180I179J181K153L229,232M132N166 O225,228P253
7 В	A252B263C223D172E216F204G185H180I179J181K153L232M132N166O228P253
1750 А	A165B228C223D172E204F204G179H180I186J153K150L232M132N166O225P253
Одеський 504	A165,252B228,263C223D172E204F204G140,179H180,190I186,193J153K150,165L232 M132,138N166O225P253
4 В	A252B263C223D172E204F204G140H190I193J153K165L232M138N166O225P253
Одеський 122	A165,252B228,263C223D172E204,216F204G140,179H175,190I190,193J153K153,165 L232M132,138N166O225P253
1036 А	A165B228C223D172E216F204G179H175I190J153K153L232M132N166O225P253
Одеський 123	A165,252B228,263C223D172E204,216F204G140,185H175,190I190,193J153K153,165 L232M132,138N166O225P253
3369 А	A165B228C223D172E216F204G185H175I190J153K153L232M132N166O225P253
Згода	A165B228,263C223D172E204,216F204G140,185H175,186I190J153K153,165L232, 236M132N166O225P253
RHA	A165B263C223D172E204F204G140H186I190J153K165L236M132N166O225P253

На базі отриманих даних для досліджених генотипів соняшника запропоновано тест-систему, що містить каталог інбредних ліній і простих гібридів соняшника для зберігання відповідної інформації, а також для постійного доповнення результатами аналізу нових генотипів та нових мікросателітних локусів. Наявність даної тест-системи, що містить оптимальний набір SSR-локусів, за допомогою яких вдалось встановити типовість та гібридність дослідженого матеріалу, полегшить типування та реєстрацію нових генотипів із метою захисту авторських прав селекціонерів.



ВИСНОВКИ

Вивчено молекулярно-генетичний поліморфізм генотипів соняшника (Helianthus annuus L.) української селекції за допомогою мікросателітних маркерів.

1. Проаналізовано інформаційну цінність мікросателітних локусів геному соняшника, виявлено унікальні алелі.

2. Досліджені генотипи за ступенем генетичної близькості диференційовані на окремі групи, згідно їхнього походження.

3. Визначені частотні характеристики алелів та індекси поліморфності за вивченими локусами.

4. Запропоновано тест-систему для визначення типовості інбредних ліній та гібридності простих гібридів соняшника.

5. Сформовано базу даних алельних характеристик поліморфних мікросателітних локусів для інбредних ліній і гібридів соняшника. Створено ідентифікаційні формули, які відображають специфічність кожного дослідженого генотипу.



ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для визначення типовості інбредних ліній та гібридності простих гібридів соняшника рекомендується використовувати тест-систему, засновану на ДНК-типуванні генотипів за мікросателітними локусами.

2. Для ідентифікації і реєстрації інбредних ліній та гібридів соняшника рекомендується використовувати запропоновану технологію, засновану на виявленні алелів за 16 мікросателітними локусами, та запису у вигляді ідентифікаційних формул.



ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Солоденко А.Е., Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателлитных маркеров // Цитология и генетика. - 2004. - Т. 38, № 2. - С.15-19.

Особистий внесок здобувача - досліджено поліморфізм ряду мікросателітних послідовностей ДНК. Виявлено унікальний алельний склад за 8 SSR-локусами, а також алелі, специфічні для генетичного матеріалу, створеного в певному селекційному центрі.

2. Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника украинской селекции при помощи SSRP-анализа // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 4. - С.31-37.

Особистий внесок здобувача - досліджено 16 поліморфних мікросателітних локусів геному соняшника, виконано порівняльний SSR-аналіз інбредних ліній, виявлено набори алелів, специфічні до 20 батьківських ліній. Визначено індекс поліморфності (РІС) для кожного проаналізованого локусу. Сформовано генетичні формули (паспорти) для всіх досліджених генотипів.

3. Сиволап Ю.М., Солоденко А.Е., Саналатій А.В. (Трояновська А.В.) Спосіб ідентифікації генотипів соняшника // Деклараційний патент України № 68813 А опубл.16.08.2004 Бюл.№ 8.

Особистий внесок здобувача - проведено ідентифікацію генотипів соняшника за допомогою ПЛР-аналізу мікросателітної ДНК, запропоновано спосіб реєстрації інбредних ліній та гібридів у вигляді генетичних формул.

4. Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Выявление полиморфизма микросателлитной ДНК у генотипов подсолнечника методом SSR-ПЦР // Сборник тезисов 2-й Международной конференции молодых ученых "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений" (19-23 мая 2003 г.) Харьков, Украина. - 2003. - 84

Особистий внесок здобувача - проведено аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму інбредних ліній та гібридів соняшника за допомогою 5 мікросателітних маркерів.

5. Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М., Толмачев В.В. ДНК-маркеры в селекции и семеноводстве подсолнечника // Сборник тезисов IV Международной конференции "Геном растений" (10-13 июня 2003 г.) Одесса, Украина. - 2003. - 35

Особистий внесок здобувача - проведено оцінку генетичного різноманіття інбредних ліній соняшника трьох основних центрів селекції цієї культури в Україні за допомогою аналізу мікросателітної ДНК.

6. Sanalati A.V.(Troyanovskaya A.V.), Solodenko A.E., Sivolap Yu. M. SSRP-analysis of sunflower // Международная научная конференция молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (25-27 сентября 2004 г.) Киев, Украина.- 2003.- 205

Особистий внесок здобувача - протестовано 11 пар мікросателітних праймерів на генотипах української селекції.

7. Солоденко А.Е, Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Сиволап Ю.М. Микросателлитные маркеры в семеноводстве подсолнечника // Международная научная конференция "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (24-26 ноября 2004 г.) Минск, Беларусь. - 2004. - С. 111-113.

Особистий внесок здобувача - проведено оцінку генетичного різноманіття досліджуваного матеріалу, встановлено молекулярно-генетичний поліморфізм за 14 локусами геному соняшника.

8. Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов и определение "гибридности" простых гибридов подсолнечника методом SSR-ПЦР" // Міжнародна науково-практична конференція "Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання" (29 червня - 1 липня 2005 р.) Оброшино, Україна. - 2005. - С. 252-253.

Особистий внесок здобувача - проведено SSR-ПЛР для ідентифікації генотипів та визначення гібридності простих гібридів F₁ соняшника за допомогою 15 мікросателітних локусів.

9. Саналатий А.В. (Трояновская А.В.), Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Полиморфизм микросателлитной ДНК подсолнечника и создание ДНК-паспорта с помощью метода SSR-ПЦР // Международная научная конференция "Современные проблемы генетики" (21-23 ноября 2005 г.) Минск, Беларусь. -2005. - С. 186-187.

Особистий внесок здобувача - проаналізовано 32 SSR-локуси геному соняшника, з яких 16 виявились поліморфними, встановлено наявність від двох до восьми алелів у локусі.



АНОТАЦІЯ

Трояновська А.В. Ідентифікація генотипів соняшника за допомогою ДНК-маркерів - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.

Дисертація містить теоретичний та експериментальний матеріал із ідентифікації генотипів за допомогою ДНК-маркерів, зокрема SSR-локусів геному соняшника (Helianthus annuus L).

За допомогою маркерів до мікросателітних локусів геному соняшника вперше визначені особливості алельного складу для кожного генотипу, а також для кожного центру створення цієї культури в Україні.

SSRР-аналіз дозволив диференціювати досліджені генотипи, виявити наявність унікальних алелів, встановити генетичні взаємовідносини між досліджуваними генотипами соняшника, запропонувати тест-систему для визначення типовості та гібридності селекційних форм, а також створити ідентифікаційні формули генотипів інбредних ліній та гібридів соняшника.

Ключові слова: соняшник, Helianthus annuus, SSR-аналіз, мікросателіти, ідентифікація.



АННОТАЦИЯ

Трояновская А. В. Идентификация генотипов подсолнечника с помощью ДНК-маркеров - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.

Диссертация содержит теоретический и экспериментальный материал по идентификации генотипов с помощью ДНК-маркеров, в частности SSR-локусов генома подсолнечника (Helianthus annuus L).

С помощью маркеров к микросателлитным локусам генома подсолнечника впервые определены особенности аллельного состояния для каждого проанализированного генотипа, а также для каждого центра создания данной культуры в Украине. SSRР-анализ позволил дифференцировать исследованные генотипы, выявить наличие уникальных аллелей, установить генетическое взаимоотношение между исследуемыми генотипами подсолнечника, предложить тест-систему для определения типичности и гибридности селекционных форм, а также создать идентификационные формулы генотипов инбредных линий и гибридов подсолнечника.

На выборке исследованных генотипов из представленных 32 пар микросателлитных праймеров полиморфными оказались 16 (На 1796, На 1608, ORS 3, ORS 4, ORS 78, ORS 509, ORS 815, ORS 595, ORS 599, ORS 307, ORS 533, ORS 364, ORS 1024, ORS 409, ORS 546, ORS 602). Несколько пар праймеров давали сложночитаемые спектры амплификации (ORS 5, ORS 16, ORS 32, ORS 656, ORS 687, ORS 1144, ORS 1238, На 1209, На 1327, На 1442, На 1287, На 1354, На 1626), некоторые праймеры являлись неполиморфными для данных генотипов (ORS 1, ORS 2, ORS 1030). Некоторые локусы были полиморфными для генотипов двух центров создания, и в то же время детектировали всего один аллель у представителей третьего центра селекции. Данное распределение аллелей у генотипов, полученных из разных селекционных центров, позволяет судить о возможном адаптационном значении некоторых выявленных аллелей.

Для молекулярных маркеров, использованных в работе, установлен уровень полиморфности. Наиболее полиморфными оказались маркеры, содержащие динуклеотидные сложные повторы, выявляющие 5,5 аллелей на локус, тринуклеотидные повторы выявляли 4,83 аллелей/локус, динуклеотидные - 4,62 аллелей/локус.

Индекс полиморфности у динуклеотидных сложных маркеров в среднем составил 0,64; для тринуклеотидных повторов значение РІС равнялось 0,72; для динуклеотидных маркеров среднее значение составило 0,575. маркер геном локус соняшник

Из 17 использованных микросателлитных повторов - ((AG)_n, (AC)_n, (CT)_n , (GA)_n, (TA)_n, (AT)_n, (CTT)_n, (AGG)_n, (ATT)_n, (AAC)_n, (AAT)_n, (GGT)_n, (AGT)_n, (AAG)_n, (AT)(GT)_n, (CT)(CA)_n, (AG)(TG)(ATT)_n) 8 оказались неполиморфными. Наиболее полиморфным был динуклеотидный повтор (AG) _n, уровень полиморфности которого составил 25,9 %, наименее - тринуклеотидный (AGG) _n - 3 %.

Из общего количества локусов, детектирующих полиморфизм, установлены наиболее полиморфные - Ha 1608, ORS 509, ORS 599 и ORS 595, выявляющие 8 и 7 аллелей, соответственно.

Для исследованных генотипов определили среднее число выявленных аллелей. Для родительских линий Института масличных культур среднее количество аллелей в локусе составило 2,38 аллелей/локус, для селекционных форм Института растениеводства среднее значение составило - 2,31 аллелей/локус, для инбредных линий Селекционно-генетического института - 2,13 аллелей/локус; соответственно наиболее полиморфным материалом являются генотипы Института масличных культур.

Для исследованных микросателлитных локусов подсчитано значение PIC (индекс полиморфности), оно варьировало от 0,1 до 0,84. Наименьшее значение PIC характерно для локуса ORS 602, наибольшее - для локуса На 1608.

Среднее значение PIC для всех проанализированных полиморфных локусов составило - 0,64, а среднее количество выявляемых аллелей на локус - 4,8.

По данным микросателлитного анализа построена дендрограмма с помощью кластерного анализа UPGMA, отражающая феногенетическое взаимоотношение исследуемых генотипов подсолнечника. Распределение генотипов подсолнечника на полученной дендрограмме соответствует их происхождению.

Некоторые микросателлитные маркеры позволили четко дифференцировать материнские формы от отцовских, например, локус ORS 78 на селекционном материале ИР выявлял два аллеля, аллель 204 п.н. присутствовал у отцовских форм (Х526, Х711, Х762, Х782), а аллель 212 п.н. - у материнских (Сх1006, Сх2111, Сх908). На одесском материале таким маркером служил локус На1608, из двух выявленных аллелей, аллель 228 п.н. наблюдался во всех материнских инбредных линиях (1036А, 3369А, 1750А, 42А), а аллель 263 п.н. - у всех отцовских (7В, 4В, RHA).

...