Размещено на http://allbest.ru

ОДЕСЬКА НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

УДК [577.15:664.785.8]:602.4

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата технічних наук

ТЕХНОЛОГІЯ БАД, ЯКІ МІСТЯТЬ ІНГІБІТОРИ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

Спеціальність 03.00.20 - біотехнологія

Кушнір Надія Анатоліївна

Одеса - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Одеській національній академії харчових технологій

Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник -кандидат технічних наук, доцент, Крусір Галина Всеволодівна, Одеська національна академія харчових технологій, кафедра харчової хімії, доцент кафедри.

Офіційні опоненти:доктор технічних наук, професор Гержикова Вікторія Григорівна, Інститут винограду і вина „Магарач” УААН, відділ хімії та біотехнології вин, завідувач відділом;

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник Севастьянов Олег Всеволодович Фізико-хімічний інститут імені О.В. Богатського НАН України, лабораторія фізико-хімічних основ біотехнології відділу медичної хімії, старший науковий співробітник лабораторії.

Захист відбудеться 12 листопада 2009 р. о 10³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.088.02 в Одеській національній академії харчових технологій за адресою: 65039, м. Одеса, вул. Канатна, 112 в ауд. А-234.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Одеської національної академії харчових технологій за адресою: 65039, м. Одеса, вул. Канатна, 112.

Автореферат розісланий 12 жовтня 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради д.т.н., професорГ.М. Станкевич

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інгібітори амілолітичних ферментів здатні специфічно уповільнювати протікання реакції вуглеводного метаболізму в організмі людини, каталізуючи розрив глікозидних зв'язків у таких субстратах, як крохмаль та крохмалеподібні полісахариди.

Висока розповсюдженість цукрового діабету, ожиріння та гіперліпідемії в розвинутих країнах, в тому числі і на Україні, де кількість хворих складає більше, ніж 3 % населення, дозволяють віднести їх до захворювань цивілізації, що потребують проведення лікувально-профілактичних дій. Для профілактики прогресування цих захворювань, разом з медикаментозною терапією, населенню необхідно вживати функціональні продукти харчування (ФПХ) і біологічно активні добавки (БАД), які здатні знижувати або регулювати рівень глюкози в крові. До БАД, які володіють такою дією, відносять, зокрема, такі, що здатні уповільнювати розщеплення крохмалю у травному тракті людини.

Це обумовлює перспективність подальшого вивчення функціональних властивостей білків-інгібіторів амілаз, пошуків рослинних об'єктів, в яких вони присутні в значній кількості, розробку методів їх виділення і очищення з метою одержання БАД антидіабетичної дії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає тематиці досліджень проблемної науково-дослідної лабораторії Одеської національної академії харчових технологій 1/06-П «Розробка біотехнологічних процесів цільового спрямованого регулювання функціональних, фізіологічних і технологічних властивостей харчових продуктів і БАД» (наказ Міністерства освіти і науки України № 654 від 16.11.2005 р., № держреестрації 0106U001445); 1/09-П «Біополімери рослин як об'єкти хімічної та біотехнологічної модифікації» (наказ Міністерства освіти і науки України № 1043 від 17.11.2008 р., № держреестрації 0109U000397); та виконана згідно з держбюджетними науково-дослідними темами кафедри харчової хімії Одеської національної академії харчових технологій «Скринінг рослинної сировини на наявність антиамілолітичної та лізоцимної активностей» (2007 р.); «Характеристика антиамілолітичної активності біополімерних складових рослинної сировини» (2008 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою роботи є розробка технології БАД, що містить інгібітор панкреатичної амілази з борошенець вівса, іммобілізований на полісахаридній матриці, для лікувального та лікувально-профілактичного харчування.

Для досягнення поставленої мети було визначено основні завдання дослідження:

– провести скринінг рослинної сировини на вміст інгібітору панкреатичної амілази;

– обґрунтувати методи виділення та очищення інгібітору панкреатичної амілази;

– дати характеристику фізико-хімічних властивостей інгібітору панкреатичної амілази;

– розробити спосіб стабілізації інгібітору шляхом його іммобілізації на полісахаридній матриці;

– розробити склад та спосіб одержання БАД, що містить інгібітор амілаз і дати її характеристику;

– розробити схему переробки борошенець вівса з одержанням біологічно активної добавки інгібіторної дії;

– оптимізувати ключові параметри технології отримання біологічно активної добавки;

– здійснити промислову апробацію технології БАД і дати оцінку її економічної ефективності;

– розробити, затвердити та зареєструвати в Держспоживстандарті України нормативну документацію (ТУ й ТІ) на виробництво БАД;

– здійснити фармакологічні та санітарно-гігіенічні дослідження БАД;

– оцінити принципову можливість одержання функціональних продуктів харчування з включенням отриманої БАД.

Об'єкти дослідження - технологія отримання БАД, що містить інгібітор панкреатичної амілази.

Предмет дослідження - інгібітор панкреатичної амілази, борошенця вівса, БАД з інгібіторною активністю відносно панкреатичної амілази.

Методи дослідження - комплекс традиційних і сучасних біохімічних, фізико-хімічних, мікробіологічних і технологічних методів дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше надано всебічну характеристику інгібітору панкреатичної амілази з борошенець вівса, досліджено його амінокислотний склад, молекулярну масу, фізико-хімічні властивості. Обґрунтовано доцільність використання білкової складової борошенець вівса як речовини, котра здатна інгібувати активність панкреатичної амілази.

Вперше розроблено спосіб виділення з альбумінової та глобулінової фракцій борошенець вівса інгібітору б-амілази із використанням комплексоутворення з полісахаридами.

Наукову новизну підтверджено 4 патентами України на корисну модель «Біологічно активна добавка» (№ 35892), «Спосіб одержання інгібітора амілази» (№ 35845), «Спосіб виробництва йогурту» (№ 39690), «Спосіб отримання лікувально-профілактичного кисломолочного напою “Наріне”» (№ 39717).

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих результатів розроблено технологію комплексної переробки борошенець вівса з одержанням БАД, що містить інгібітор панкреатичної амілази, а також розроблено, затверджено та зареєстровано в Держспоживстандарті України нормативну документацію на БАД «Аміл-інг», що містить інгібітор панкреатичної амілази (ТУ, ТІ). Доведено можливість промислового виробництва розробленої біологічно активної добавки; технологія апробована на науково-виробничому підприємстві «Аріадна» (м. Одеса).

Показано можливість одержання функціональних кисломолочних продуктів харчування антидіабетичного призначення із включенням БАД, що містить інгібітор панкреатичної амілази; технологія апробована на ТОВ «Агроком» (с. Єгорівка Одеської обл.) та ВАТ «Володимирецький молокозавод» (м. Володимирець Рівненської обл.).

Особистий внесок здобувача полягає в забезпеченні методичного оформлення роботи, виконанні аналітичних і експериментальних досліджень, проведенні аналізу та узагальненні отриманих даних у вигляді висновків і рекомендацій, підготовці матеріалів досліджень до публікації, розробки та затвердженні нормативної документації, організації промислової апробації розробленої технології БАД та функціональних кисломолочних продуктів харчування. Особистий внесок здобувача підтверджується представленими документами і науковими публікаціями.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідалися і обговорювалися на 7 наукових конференціях, зокрема на ІІ всеукраїнській конференції студентів і аспірантів «Сучасні проблеми хімії» (Київ, 2007 р.); The young scientists' and students' International scientific conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Odessa, 2007); VI міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Техніка й технологія харчових виробництв» (Могильов, 2008); IX міжнародній конференції молодих учених «Харчові технології й біотехнології» (Казань, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції «Сучасні наукові досягнення - 2008» (м. Миколаїв, 2008), V Міжнародній науково-практичній конференції «Хлібопродукти-2008» (Одеса, 2008 р.), 68-й науковій конференції професорського-викладацького складу ОНАХТ (Одеса, 2008 р.) та на двох конкурсах: регіональний конкурс інноваційних проектів, що був присвячений Дню науки України (Одеса, 2009 р.) та Всеукраїнський конкурс «Инновационный прорыв - 2009» (Київ, 2009 р.).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 20 друкованих працях, з яких 11 статей у фахових виданнях, 4 деклараційні патенти України на корисну модель № 35892, № 35845, № 39690, № 39717, тези 5 доповідей у матеріалах наукових і науково-практичних конференцій.

Структура й обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел та додатків.

Дисертаційна робота викладена на 120 сторінках основного тексту, містить 31 рисунки (12,2 сторінки), 25 таблиць (15,3 сторінок), 14 додатків (123 сторінки), список літературних джерел з 340 найменувань (35 сторінок).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі викладено актуальність теми дисертаційної роботи, сформульовано мету і завдання дослідження, висвітлено наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, їх апробацію, визначено особистий внесок здобувача у проведених дослідженнях та публікаціях за темою дисертаційної роботи.

У першому розділі «Інгібітор панкреатичної амілази як інгредієнт функціонального харчування» розглянуто рослинні джерела інгібітору панкреатичної амілази, механізм інгібування панкреатичної амілази, хімічні й біотехнологічні способи його вилучення із сировини; використання рослинного інгібітору у складі біологічно активних добавок і продуктів харчування, а також застосування у медицині.

У другому розділі «Матеріали і методи досліджень» викладено відомості про об'єкти і методи досліджень та етапи переробки борошенець вівса з отриманням біологічно активної речовини і добавки. Схему напрямків досліджень наведено на рис. 1.

Основну частину досліджень було проведено в лабораторіях кафедр харчової хімії та біохімії, мікробіології і фізіології харчування Одеської національної академії харчових технологій, в лабораторіях біохімії і фізіології рослин Одеського селекційно-генетичного інституту національного центру насіннєзнавства і сортовивчення УААН, в лабораторіях фізико-хімічних основ біотехнології відділу медичної хімії Фізико-хімічного науково-дослідного інституту ім. Богатського, Центральної санітарно-епідеміологічній станції, в лабораторії біохімічної фармакології ДП «Державного національного центру лікарських засобів».

Надано характеристику методів досліджень як загальнонаукових, так і спеціальних хімічних та біохімічних. Описано методи виділення інгібітору панкреатичної амілази з борошенець вівса з використанням афінної хроматографії, характеристики фізико-хімічних властивостей, кінетичного інгібування панкреатичної амілази.

У третьому розділі «Виділення і характеристика інгібітору панкреатичної амілази» результати досліджень зі скринінгу рослинної сировини на вміст інгібітору панкреатичної амілази показали, що максимальну інгібіторну дію по відношенню до панкреатичної амілази проявляють екстракти вівса і вторинного продукту його переробки - борошенець вівса, що визначає їх потенційну перспективність як сировинних джерел вилучення інгібітору панкреатичної амілази.

Визначено, що найбільша інгібіторна активність спостерігається для водорозчинної фракції. Антиамілолітичною активністю володіє також фракція, яка отримана з використанням 0,5 М розчину NaCl.

Вплив складу буферної системи на вихід інгібіторів амілолітичних ферментів з борошенець вівса оцінювали за максимальним значенням питомої інгібіторної активності.

Найбільше значення питомої активності (0,196 ІО/мг білка) спостерігається при використанні 0,15 М NaСl в 0,1 М гідрокарбонатному буфері, рН 9,2, що свідчить про максимальний вихід інгібітору з рослинної сировини.

Стадії очищення інгібітору панкреатичної б-амілази з борошенець вівса включали фракціювання білкової складової екстракту сульфатом амоніаку і афінну хроматографію на біоспецифічному сорбенті б-амілаза-сефароза 4В.

Отриманий білок-інгібітор очищали за допомогою афінної хроматографії ( табл. 1). Хроматографічна крива виходу білка з колонки характеризується трьома максимумами, при цьому третій максимум супроводжується інгібіторною активністю.

Рис. 1. Схема напрямків досліджень.

Молекулярну масу (M_r) отриманого білка-інгібітору визначали за допомогою електрофорезу в 15 %-ому поліакриламідному гелі (ПААГ). Показано, що при використанні описаного методу очищення інгібітору панкреатичної амілази отримано білок з молекулярною масою 25,11 кДа, яку було розраховано за допомогою калібрувальної кривої.

Наведені в табл. 1 дані дозволяють констатувати, що екстракт з концентрацією білка 1,16 мг/см³ та інгібіторною активністю 0,33 ІО/см³ був очищений до концентрації білка в активній фракції елюату після афінної хроматографії 0,0035 мг/см³ та інгібіторною активністю 0,09 ІО/см³. Ступінь очищення інгібітору складає 92,7. Таким чином, розрахунки дозволяють визначити, що з 100 г борошенець вівса можна отримати 1,85 мг інгібітору панкреатичної б-амілази, питома активність якого складає 26 ІО/мг білка. Інгібітор знижує активність панкреатичної амілази на 38 % при ваговому співвідношенні інгібітор:фермент 1:1.

Визначено фізико-хімічні властивості отриманого інгібітору панкреатичної амілази. Встановлено, що інгібування панкреатичної б-амілази білковим інгібітором з борошенець вівса найефективніше в межах рН 5,5…6,0 при температурі (37±2) єС.

Таким чином, отримані фізико-хімічні показники інгібітору панкреатичної амілази з борошенець вівса свідчать, що він характеризується незначною рН- і термостабільністю, тому актуальною є його стабілізація.

Результати кінетичних досліджень інгібування панкреатичної амілази інгібітором білкової природи виділеним з використанням представлених вище методів, дозволяють стверджувати, що має місце лінійне неконкурентне інгібування ферменту.

Результати ІЧ-спектроскопії показали, що відбувається перерозподіл співвідношень типів вторинних структур білкових молекул, що може вказувати на конформаційні зміни, які відбуваються при інгібуванні.

Таблиця 1

Стадії очищення інгібітору (15 г борошенець вівса)

Найменування	Стадія очищення
	Екстракція	Фракціювання і діаліз	Афінна хроматографія
Об'єм, см3	55	100	80
ІА, ІО/см3	0,33	0,13	0,09
Білок, мг/см3	1,1600	0,0300	0,0035
Загальний білок, мг	64,00	3,09	0,28
Сумарна ІА, ІО/см3	18,00	13,00	7,24
Питома ІА, ІО/мг	0,28	4,20	26,00
Ступінь очищення	1,0	15,0	92,7
Вихід %	100,0	72,2	40,2

У четвертому розділі «Іммобілізація інгібітору панкреатичної амілази» вивчено умови комплексоутворення інгібітор панкреатичної амілази-полісахарид, фізико-хімічні показники іммобілізованого інгібітору, кінетичні параметри інгібування, дана характеристика білкових складових, як екстракту з борошенець вівса, так і іммобілізованого препарату.

Як методи іммобілізації інгібітору панкреатичної амілази з метою одержання БАД та інгредієнтів функціональних продуктів використовували фізичні методи:

– методи фізичної сорбції на матрицях природного походження;

– фізичні методи мікрокапсулювання: комплексоутворення за рахунок електростатичної взаємодії (білків та полісахаридів) або проста коацервація.

Отримані експериментальні дані показали, що найбільш ефективною матрицею для іммобілізації інгібітору панкреатичної амілази з борошенець вівса є харчові волокна пшеничних висівок (ХВПВ), іммобілізація на ХВПВ характеризується збереженням 33 % вихідної інгібіторної активності при оптимальному ваговому співвідношенні носій:інгібітор = 1:0,3.

З експериментальних даних дослідження комплексоутворення інгібітору з полісахаридними матрицями можна зробити висновок, що найбільш ефективне осадження інгібітору спостерігається в його ізоелектричній точці (ІЕТ) при використанні агару. В ізоелектричній точці (ІЕТ) білка-інгібітора (рН 4,5…5,0) найвищим зарядом володіє агар (N = 0,93 ммоль/г), таким чином можна стверджувати, що агар сприяє найбільшому осадженню інгібітору панкреатичної амілази з екстракту з борошенець вівса саме тому, що він в ІЕТ інгібітору має найбільший заряд.

Визначено, що процес комплексоутворення приводить до зсуву ІЕТ білка з рН 5,0 до рН 4,5, що свідчить про те, що структура, яка утворилася, є не механічною сумішшю, а інгібітор-агаровим комплексом.

Результати вивчення процесу осадження інгібітору панкреатичної амілази з екстракту борошенець вівса свідчать, що осадження інгібітору з екстракту залежить від концентрації полііона: при концентрації агару 0,3 % вихід інгібітору панкреатичної амілази складає 73 %. Більш значне осадження інгібітору з екстракту в порівнянні з осадженням інгібітору з його водного розчину може, зокрема, пояснюватися більшою концентрацією сумарного білка в екстракті, що сприяє полегшенню міжмолекулярних контактів між білком і поліелектролітом, а також можливим співосадженням інгібітору з іншими білками екстракту. Питома інгібіторна активність в комплексі в 43 рази перевищує її значення в екстракті, інакше кажучи, ступінь очищення інгібітору з екстракту складає 43.

Визначали рН-оптимум, термооптимум, рН-стабільність і термостабільність, та порівнювали їх з відповідними характеристиками вихідного інгібітору (очищеного афінною хроматографією). Отримані дані показали, що рН-оптимум іммобілізованого інгібітору розширений, порівняно з очищеним інгібітором і знаходиться в діапазоні значень рН від 5,0 до 6,8 при фізіологічній температурі (37±2) єС. Одержані результати вивчення термооптимуму свідчать, що термооптимум дії отриманого іммобілізованого інгібітору становить (37±2) єС.

В порівнянні з очищеним інгібітором іммобілізована форма інгібітору має більш значну рН-стабільність. Так, через 6 годин інкубації при рН 5,0 його активність зменшилась тільки на 2 %. При рН 2,0 активність різко знижується через 30 хвилин, але, на відміну від нативного інгібітору, тільки на 28 %, а далі спостерігається незначне зменшення антиамілолітичної активності до 76 % від вихідної.

З отриманих даних видно, що іммобілізований інгібітор характеризується більш значною термостабільністю в порівнянні з очищеним. Так, за 6 годин інкубації при (20±2) єС активність іммобілізованого інгібітору знизилась лише на 0,45 %, при (37±2) єС - на 2,59 %. Незначне зниження активності іммобілізованого інгібітору на 5,6 та 14 % спостерігається відповідно за температур (45±2) єС та (65±2) єС. Така висока термостабільність іммобілізованого інгібітору дозволяє прогнозувати можливість його виробництва з використанням високих температурних режимів. біологічний інгібітор амілаза

Однією з основних характеристик природних інгібіторів є специфічність їх дії. Експериментальні дані показали, що отриманий інгібітор ефективно знижує активність панкреатичної б-амілази, не значно знижують активність амілази слини людини і не впливають на активність мікробної б-амілази і протеаз, за винятком трипсину, що свідчить - інгібітор б-амілази з борошенець вівса не є біфункціональним інгібітором, тому що не впливає на активність протеолітичних ферментів.

Для визначення молекулярної маси білків, що входять до складу екстракту та іммобілізованого препарату інгібітору, використовували електрофорез в 15 %-ому поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію.

До складу обох продуктів входять білки з молекулярними масами 6 кДа, 12 кДа, 25 кДа, 48 кДа, 62 кДа. Значна білкова смуга на старті означає, що в зразках також присутні білки з молекулярними масами, які перевищують за 92,5 кДа, що визначило необхідність проведення гель-хроматографії визначило необхідність проведення гель-хроматографії, за допомогою якої можна встановити молекулярні маси і кількісний склад цих білків.

За допомогою гель-хроматографії встановлено, що в екстракті переважають білкові фракції з високими молекулярними масами (більше 70 %). Кількість інгібітору панкреатичної амілази з молекулярною масою 25 кДа складає 0,437 % від загальної кількості білку.

Результати обробки даних експерименту визначення кінетичних параметрів інгібування панкреатичної амілази іммобілізованим інгібітором з використанням методів математичного аналізу кінетичних досліджень показали відсутність змін при значеннях V_max, які зменшуються, що дозволяє віднести інгібування до лінійного неконкурентного типу (каталітичне інгібування).

Таким чином, встановлено що іммобілізація на полісахаридній матриці не впливає на тип інгібування.

Досліджено природу взаємодії між інгібітором і матрицею за допомогою калориметрії і ІЧ-спектроскопії.

Значення теплової гідратації ДH^гідр механічної суміші (4392,6 Дж/моль) значно перевищує теплоту гідратації іммобілізованого препарату (2116,4 Дж/моль). Це свідчить про те, що взаємодія інгібітору б-амілази з носієм в умовах іммобілізації супроводжується виникненням зв'язків між ними.

Результати досліджень з використанням ІЧ-спектроскопії свідчать про те, що при іммобілізації інгібітору з використанням комплексоутворення з агаром утворюються водневі зв'язки між інгібітором і матрицею.

У п'ятому розділі «Розробка технології отримання БАД, яка містить інгібітор панкреатичної амілази» доведено можливість отримання біологічно активної добавки; наведено принципову схему переробки борошенець вівса з отриманням БАД; обґрунтувані раціональні параметри ключових технологічних операцій, технологічні та апаратурні схеми.

Встановлено загальний вихід білка-інгібітору та його інгібіторну активність ІА_р від температуру екстракції (t), значення гідромодуля (ГМ) та тривалість процесу (ф). Отримано наступне рівняння регресії, що описує залежність виходу інгібітору амілази в розчин (ІА_р) від досліджуваних факторів:

IA_p = 0,19378 - 0,00002 · t² - 0,000108 ·ф + 0,0265 ·ГМ -

- 0,001923 ·ГМ² + 0,000087 · t · ГМ - 0,000003 · t · ф, (1)

Отримані оптимальні значення, що відповідають максиму ІА_р (0,286 ІО/мг білку), становлять: ф = 30 хв.; t = 13,4 єС; ГМ = 7,2.

Для визначення оптимальних параметрів процесу іммобілізації досліджували вплив температури процесу комплексоутворення (t), концентрації агару (С) та тривалості процесу (ф) на інгібіторну активність БАД.

Отримано рівняння регресії, що описує залежність іммобілізації інгібітору амілази на агарі (ІА) від досліджуваних факторів:

IA_p = 102,0435 - 0,0102 · t² - 0,5639 ·ф + 46,6663 ·С -

- 55,1067 ·С² + 0,3014 · t · С + 0,4290 · ф ·С , (2)

Оптимальні значення, що відповідають максимуму питомої інгібіторної активності (107 ІО/мг білка), становлять: ф = 15 хв.; t = 13,5 єС; С = 0,3 %.

Розроблено схему отримання БАД на основі борошенець вівса, що передбачає отримання БАД, здатної регулювати та знижувати рівень цукру в крові.

Реальність розробленої технології виробництва БАД підтверджено результатами промислової апробації на науково-виробничому підприємстві «Аріадна», м. Одеса. Отримана БАД відповідає необхідним санітарно-гігієнічним, токсикологічним, мікробіологічним, фізико-хімічним та органолептичним нормам.

Розроблено, затверджено та зареєстровано в Держспоживстандарті України нормативну документацію (ТУ, ТІ) на виробництво розробленої БАД. Совокупність даних мікробіологічних досліджень та вивчення динаміки зміни інгібіторної активності БАД дозволяє рекомендувати її зберігання впродовж 12 місяців за температури (4±2) єС.

Результати фармакологічних досліджень БАД свідчать про можливість її використання як ефективної біологічно активної добавки, яка здатна знижувати та регулювати рівень глюкози у крові людини. Встановлено, що доза 180 мг/кг є достатньо ефективною і може бути рекомендована для прийому людиною. При перерахунку вказаної дози з використанням коефіцієнтів перерахунку для різних видів тварин та людини доза для людини повинна складати біля 1,8 г на добу.

Проведені дегустація і промислова апробація (ВАТ «Володимирецький молочний завод», м. Володимирець, Рівненської обл. та ТОВ «Агроком», Одеська обл.) показали можливість введення БАД до складу кисломолочних напоїв (йогурт та “Наріне”). Використання розробленої БАД дозволяє зменшити час виробництва, покращити органолептичні та фізико-хімічні показники напоїв.

Розраховано собівартість БАД на основі інгібітору панкреатичної амілази та агару. Собівартість 50 г БАД складає 22,34 грн.

ВИСНОВКИ

1. На основі теоретичних та експериментальних досліджень розроблено технологію виробництва БАД з інгібіторною активністю відносно панкреатичної амілази. Показано, що борошенця вівса - перспективне сировинне джерело сполук рослинного походження, що гальмують активність панкреатичної б-амілази.

2. Визначено, що інгібітор амілази з борошенець вівса має білкову природу; найвища ступінь його вилучення здійснюється за умов екстракції 0,15 М NaCl в 0,1 М гідрокарбонатному буфері, рН 9,2.

3. Очищений за допомогою афінної хроматографії інгібітор є мономерним, його питома інгібіторна активність складає 26 ІО/мг білка, молекулярна маса - 25,11 кДа, рН оптимум - 5,5 при температурі (37±2) єС, термооптимум - (37±2) єС. Найбільш стабільним він є за температури (20±2) єС, рН 5,0. Показано, що білкова глобула інгібітору рослинного походження є сферичною і за амінокислотним складом інгібітор борошенець вівса подібний до інгібіторів з зерна пшениці, проса та ячменю і містить необхідну кількість аргініну, лізину і триптофану для прояву інгібіторної активності. Результати експериментальних досліджень показали, що інгібування амілази інгібітором з борошенець вівса здійснюється за лінійним неконкурентним типом (каталітичне інгібування). Дослідження ІЧ-спектроскопії показали, що інгібітор з борошенець вівса характеризується переважанням в-конформації (47 %) у вторинній структурі.

4. Доцільне концентрування інгібітору панкреатичної амілази шляхом комплексоутворення з полісахаридними поліелектролітами. В якості комплексоутворювача доцільно використання 0,3 %-ого розчину агару при значенні рН, яке обумовлює максимальну величину його заряду і, відповідно, найбільше концентрування інгібітору.

5. Встановлено, що іммобілізація сприяє розширенню рН і термооптимуму інгібітору, підвищенню його термостабільності. Максимальна активність інгібітору відповідає фізіологічним значенням температури ((37±2) єС). Інгібування панкреатичної амілази іммобілізованим інгібітором здійснюється за лінійним неконкурентним типом.

6. При іммобілізації між інгібітором і агаровою матрицею утворюються іонні та водневі зв'язки. У складі іммобілізованого інгібітору переважають низькомолекулярні білки (93 %).

7. Встановлено раціональні параметри екстракції (температура - 13,2єС, час - 30 хв., ГМ - 6,34) та процесу іммобілізації (температура - 11єС, час - 15 хв., концентрація агару - 0,3 %).

8. Показано, що впродовж 12 місяців зберігання в розробленій біологічно активній добавці не змінюються показники якості, викладені в нормативній документації.

9. Проведено фармакологічні та санітарно-гігіенічні дослідження БАД. Розроблено та затверджено нормативну документацію на виробництво БАД в Держспоживстандарті України.

10. Розроблена технологія виробництва БАД економічно обґрунтована і включає такі основні етапи: екстракція інгібітору, його осадження розчином агару, висушування. Розроблену технологію реалізовано у виробництві на ВАТ НПО „Аріадна” (м. Одеса).

11. Показана можливість одержання функціональних кисломолочних напоїв лікувально-профілактичного напряму з включенням отриманої БАД. Вироблено дослідні партії йогурту та „Наріне” за розробленою схемою на ВАТ „Володимирецький молочний завод”, м. Володимирець (Рівненська обл.) та на ТОВ „Агроком” (Одеська обл.). Собівартість 1 упаковки (50 г БАД) складає 22,34 грн.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Крусір Г.В. Рослинна сировина як джерело інгібіторів амілолітичних ферментів [Текст] / Крусір Г.В., Севастьянова О.В., Кушнір Н.А. // Прогресивні техніка та технології харчових виробництв ресторанного господарства і торгівлі: Зб. наук. праць / Редкол.: О. І. Черевко (відпов. ред.) та ін.; Харк. держ. ун-т харчування та торгівлі.- Харків, 2007.- Вип. 1 (5).- С. 203-207.

2. Крусір Г.В. Вплив екстрагентів на одержання інгібіторів амілолітичних ферментів з борошенець вівса [Текст] / Крусір Г.В., Севастьянова О.В., Кушнір Н.А. // Прогресивні техніка та технології харчових виробництв ресторанного господарства і торгівлі: Зб. наук. праць / Редкол.: О. І. Черевко (відпов. ред.) та ін.; Харк. держ. ун-т харчування та торгівлі.- Харків, 2007.- Вип. 2 (6).- С. 34-39.

3. Крусір Г.В. Фізико-хімічні властивості рослинного інгібітору б-амілази [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. // Прогресивні техніка та технології харчових виробництв ресторанного господарства і торгівлі: Зб. наук. праць / Редкол.: О.І. Черевко (відпов. ред.) та ін.; Харк. держ. ун-т харчування та торгівлі.- Харків, 2008.- Вип. 1 (7).- С. 427-433.

4. Крусір Г.В. Біотехнологія отримання БАД, що містить інгібітор панкреатичної б-амілази борошенець вівса [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. // Наукові праці Національного університету харчових технологій - Київ НУХТ, 2008.- № 25, Ч. 2.- С. 32-34.

5. Крусір Г.В. Біохімічна характеристика інгібітору б-амілаз з борошенець вівса [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. // Наук. пр. ОНАХТ.- Вип. 34.- Т. 1.- Одеса: ОНАХТ, 2008.- С. 252-257.

6. Крусир Г.В. Применение ингибитора панкреатической б-амилазы в производстве йогурта [Текст] / Крусир Г.В., Кушнир Н.А. // Наук. пр. ОНАХТ.- Вип. 33.- Одеса: ОНАХТ, 2008.- С. 158-162.

7. Крусір Г.В. Порівняльна характеристика фізико-хімічних властивостей рослинного інгібітору б-амілази та БАД на його основі [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. // Прогресивні техніка та технології харчових виробництв ресторанного господарства і торгівлі: Зб. наук. праць / Редкол.: О. І. Черевко (відпов. ред.) та ін.; Харк. держ. ун-т харчування та торгівлі.- Харків, 2008.- Вип. 2 (8).- С. 521-527.

8. Крусир Г.В. Использование БАД «Амил-инг» в производстве кисломолочных напитков функционального назначения [Текст] / Крусир Г.В., Кушнир Н.А. // Молочна пром-ть.- 2009.- № 3.- С. 42-46.

9. Крусир Г.В. Распространенность ингибиторов амилаз в зерновых культурах [Текст] / Крусир Г. В., Кушнир Н.А. // Зернові продукти і комбікорми.- 2009.- № 4.- С. 28-32.

10. Крусир Г.В. Ингибиторы амилолитических ферментов из зерновых. Физико-химические свойства [Текст] / Крусир Г.В., Кушнир Н.А. // Харчова наука і технологія.- 2008.- № 4 (5).- С. 15-20.

11. Крусір Г.В. Основи комплексоутворення інгібітор панкреатичної амілази-полісахарид [Текст] / Крусір Г.В., Севастьянова О.В., Кушнір Н.А. // Зернові продукти і комбікорми.- 2009.- № 1. - С. 16-19.

12. ПАТ. 35845. Україна МПК (2006) А61К 38/00, А61К 38/43 Спосіб одержання інгібітора амілази [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А.- № 35845; заявл. 14.04.2008; опубл. 10.10.2008, Бюл. № 19.

13. ПАТ. 35892. Україна МПК (2006) А61К 38/00 Біологічно активна добавка [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. - № 35892; заявл. 24.04.2008; опубл. 10.10.2008, Бюл. № 19.

14. ПАТ. 39690. Україна МПК (2006) А23С 9/12 Спосіб виробництва йогурту [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. - № 39690; заявл. 15.09.2008; опубл. 10.03.2009, Бюл. № 5.

15. ПАТ. 39717. Україна МПК (2006) А23С 9/123 Спосіб виробництва лікувально-профілактичного кисломолочного напою Наріне [Текст] / Крусір Г.В., Кушнір Н.А. - № 39717; заявл. 30.09.2008; опубл. 10.03.2009, Бюл. № 5.

16. Кушнір Н.А. Біологічно активні добавки, які містять рослинні інгібітори амілолітичних ферментів [Текст] / Кушнір Н. А., Порожнюк Д. А. // Збірка тез доповідей ІІ Всеукраїнської науково-практичної конференції з хімії та хімічної технології студентів, аспірантів та молодих вчених (26-28 квітня 2007 р., м. Київ)/ Укладач Жук Т.С.- К.: 2007.- С. 237.

17. Kushnir N.A. Biologically active additives which plant inhibitors of amylolytic enzymes [Теkst]// Book of abstracts. The young scientists' and students' international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology” (28-31 May 2007, Odessa)/ editor-in-chief V. O. Ivanytsya; Mechnikov Odessa National University.- Odessa 2007.- Р. 143.

18. Кушнир Н.А. Получение ингибитора б-амилазы [Текст] // Техника и технология пищевых производств: тез. докл. VI Междунар. науч. конф. студентов и аспирантов, 24-25 апреля 2008 г., Могилёв / УО «Могилёвский государственный университет продовольствия»; редкол.: А.В. Акулич (отв. ред.) [и др.]. - Могилёв: УО МГУП, 2008.- С. 34-35.

19. Кушнир Н.А. Характеристика ингибитора панкреатической б-амилазы из мучки овса [Текст] // IX Международная конференция молодых учёных «Пищевые технологии и биотехнологии» (г. Казань, 3-5 июня 2008 г.). сборник тезисов докладов - Казань: Издательство «Отечество», 2008.- С. 307.

20. Кушнір Н.А. Фізико-хімічні властивості рослинних інгібіторів гідролітичних ферментів [Текст] / Кушнір Н.А., Русєва Я.П. // Сучасні наукові досягнення - 2008: Збірник матеріалів всеукраїнської науково-практичної конференції. - В 3-х т. - Т. ІІ. - м. Миколаїв: НУК, 2008.- С. 292-294.

Особистий внесок:

1. Аналіз даних літератури, проведення експериментальних досліджень щодо всебічної характеристики інгібіторів панкреатичної амілази, виділених з рослинної сировини, обробка та узагальнення отриманих результатів, підготовка до друку (поз. 1-12, 16-20).

2. Вивчення фізико-хімічних властивостей нативного інгібітору та його іммобілізованої форми, обробка отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку (поз. 3, 7, 20).

3. Проведення дослідження щодо іммобілізації інгібітору панкреатичної амілази на полісахаридних матрицях, обробка отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку (поз. 11, 13).

4. Проведення досліджень щодо можливості використання розробленої БАД при виробництві функціональних продуктів харчування, обробка та узагальнення отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку (поз. 8, 14, 15).

5. Проведення експериментальних досліджень, узагальнення отриманих результатів, проведення патентного пошуку та оформлення патентів на винахід та подання заявок на винахід (поз. 12-15).

АНОТАЦІЯ

Кушнір Н.А. Технологія БАД, які містять інгібітори амілолітичних ферментів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. - Одеська національна академія харчових технологій Міністерства освіти і науки України, Одеса, 2009.

Дисертація присвячена розробці технології отримання біологічно активної добавки з антиамілолітичною активністю.

Значна увага в роботі приділяється всебічній характеристиці інгібітора панкреатичної амілази, виділеного з борошенець вівса: виділення білкової складової з інгібіторною активністю по відношенню до панкреатичної амілази, визначення кінетичних параметрів реакції інгібування амілази білковим інгібітором, типу взаємодії ферменту з інгібітором та інгібітору з полісахаридною матрицею в результаті іммобілізації.

Доведено доцільність використання білкової складової борошенець вівса як ефективного інгібітору панкреатичної амілази в складі БАД і функціональних продуктів харчування.

Білковий інгібітор виділено зі з знежирених борошенець вівса методом екстракції 0,15 М NaСl в 0,1 М гідрокарбонатному буфері, рН 9,2.

З метою визначення складу інгібітору і антиамілолітичної активності окремих білкових компонентів борошенець вівса проведено фракціювання білкової складової за допомогою сульфата амоніака. Визначено, що активними по відношенню до панкреатичної амілази є альбумінова та глобулінова фракції білкової складової борошенець вівса.

Розроблена та економічно обґрунтована технологія отримання БАД, яка містить інгібітор панкреатичної амілази.

Технологія виробництва БАД включає такі основні етапи: виділення білкового інгібітору з екстракту борошенець вівса та його іммобілізація шляхом комплексоутворення з полісахаридною матрицею, сушку БАД.

Реальність технології підтверджено результатами промислової апробації на біотехнологічному підприємстві, розроблено та затверджено в Держспоживстандарті нормативну документацію на БАД. Показано можливість використання БАД у складі функціональних продуктів харчування на основі молочної сировини.

Ключові слова: рослинний інгібітор панкреатичної амілази, панкреатична амілаза, інгібування, іммобілізація.

АННОТАЦИЯ

Кушнир Н.А. Технология БАД, содержащих ингибиторы амилолитических ферментов - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата технических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Одесская национальная академия пищевых технологий Министерства образования и науки Украины, Одесса, 2009.

Диссертация направлена на разработку технологии получения биологически активной добавки с антиамилолитическим действием.

Широкое распространение сахарного диабета, ожирения и гиперлипидемии и других заболеваний связанных с нарушением углеводного обмена в организме человека требует проведения профилактических мероприятий, таких как употребление функциональных продуктов питания и биологически активных добавок.

Многообразие физиологических эффектов, проявляемых ингибиторами ферментов, обусловливает их значимость в профилактике и лечении ряда тяжелых заболеваний связанных с нарушением ферментативной активности организма.

Одним из путей решения проблемы, связанной с нарушением углеводного обмена, является использование ингибиторов панкреатической амилазы растительного происхождения.

Среди веществ, способных подавлять активность пищеварительных ферментов, наименее изучены ингибиторы панкреатической амилазы. В то же время потребность в них как компонентах пищи чрезвычайно высока, поскольку их потребление позволяет уменьшать уровень глюкозы в крови.

Совокупность вышеизложенного определило актуальность работы, посвященной выделению, характеристике и разработке технологии производства ингибитора панкреатической амилазы - отечественного препарата, предназначенного для введения в состав БАД и функциональных продуктов антиамилолитического действия.

В качестве источника ингибитора амилазы исследовали мучку овса. Компонентом ответственным за антиамилолитическую активность является белковая составляющая.

Скрининг растительного сырья на содержание ингибиторов панкреатической амилазы показал, что максимальное присутствие ингибитора наблюдается в зерне овса и вторичного продукта его переработки - мучки овса.

Ингибиторная активность белковой составляющей мучки овса определяется присутствием альбуминов и глобулинов. Белок-ингибитор по величине антиамилолитической активности сопоставим с коммерческим препаратом «Ремоглюкол» (фирма Santegra) и снижает активность панкреатической амилазы на 38 % при весовом соотношении ингибитор:амилаза 1:1.

Результаты обработки данных эксперимента определения кинетических параметров ингибирования панкреатической амилазы нативным и иммобилизованным ингибитором с использованием методов математического анализа показали отсутствие изменений значения К_m при уменьшающихся значениях V_max, что позволяет отнести ингибирование к линейному неконкурентному типу (каталитическое ингибирование).

С помощью ИК-спектроскопии показано, что при взаимодействии ингибитора белковой природы с панкреатической амилазой происходит изменение активного центра фермента, сопровождающиеся увеличением доли в-конформаций.

Изучены физико-химические свойства свободного ингибитора. Полученные данные показали, что он обладает низкой рН- и термостабильностью, что определяет целесообразность его стабилизации.

Показано, что наиболее эффективным методом стабилизации биологически активных веществ является их иммобилизация на биополимерной матрице. Иммобилизация сопровождается увеличением рН- и термостабильности ингибитора, возрастанием его устойчивости к инактивирующему воздействию желудочного сока и компонентов желчи.

Впервые показано, что одним из наиболее эффективных методов иммобилизации является комплексообразование ингибитора белковой природы с матрицами полисахаридной природы. Наиболее эффективно проводить комплексообразование ингибитора панкреатической амилазы с 0,3 % раствором агара.

С помощью математических методов определены оптимальные параметры ключевых процессов производства биологически активной добавки. Оптимальные параметры экстракции ингибитора из мучки овса составляют: температура 13,4 °С, продолжительность 30 мин, гидромодуль - 7,2; а иммобилизации - температура 13,5 °С, продолжительность 15 мин, концентрация агара 0,3 %.

Исследования показателей качества БАД в течение 12 месяцев хранения не изменяются и соответствуют требованиям нормативной документации.

Разработана принципиальная технологическая схема получения БАД, включающая этапы выделения ингибитора, его иммобилизацию на полисахаридной матрице и сушку. Технология производства БАД апробирована в производственных условиях а на НПО “Ариадна” (г. Одесса); показатели качества полученной продукции соответствуют требованиям, изложенным в разработанном и утвержденном Госстандартом Украины ТУ.

Фармакологические исследования, проведенные в лаборатории биохимической фармакологии ГП «Госсударственного национального центра лекарственных препаратов» (г. Харков), на лабораторных животных показали, что БАД достоверно ингибирует действие панкреатической амилазы, чем приводит к снижению уровня глюкозы в крови. Суточная доза БАД для человека составляет 1,8 г.

Показана принципиальная возможность получения функциональных пищевых продуктов на молочной основе с введением ингибитора. На ОАО «Владимирецкий молочный завод» (г. Владимирец, Ровенская обл.) и ООО «Агроком» (с. Егоровка, Одесской обл.) выработаны партии «Йогурта диетического» и «Нарине» с содержанием разработанной биологически активной добавки.

Ключевые слова: растительный ингибитор панкреатической амилазы, фенольные соединения, панкреатическая амилаза, ингибирование, иммобилизация.

ANNOTATION

Kushnir N.А. Technology of BAA, which contains inhibitors of amylolytic enzymes. - Manuscript.

Dissertation on the receiption of PhD of Engineering Sciences scientific degree by speciality 03.00.20 - biotechnology. - Odessa national academy of food technologies of Department of education and science of Ukraine, Odessa, 2009.

Dissertation is devoted to receiption technology development of biologically active additive (BAA) with antiamylolytic activity.

Considerable attention in the work is spared to comprehensive description of pancreatic amylase inhibitor, that abstracted from husk of oat: selection of albuminous constituent with inhibitory activity in relation to pancreatic amylase, determination of amylase inhibition reaction kinetic parameters by albuminous inhibitor, type of enzyme-inhibitor and inhibitor-polysaccharide matrix co-operation as a result of immobilization.

Expedience of use of the albuminous constituent of husk of oat is led to as effective pancreatic inhibitor in the BAA composition and functional food stuffs. Albuminous inhibitor is selected from fat-free husk of oat by the method of extraction 0,15 М NaСl in 0,1 М hydrocarbonate buffer, рН 9,2.

With the purpose of determination of inhibitor composition and antiamylolytic activity of separate albuminous components of husk of oat fractionality albuminous constituent by ammonium sulfate is conducted. It is certain that active in relation to pancreatic amylase are albumen and globulen factions of albuminous constituent of husk of oat.

The BAA receipt technology, which contains pancreatic amylase inhibitor, is developed and economic grounded. The BAA production technology includes such basic stages: selection of albuminous inhibitor from the extract of husk of oat and its immobilization by complexforming with a polysaccharide matrix, the BAA drying.

Reality of technology is confirmed by the results of industrial approbation on a biotechnological enterprise, developed and ratified in the State Consumer Standard normative document for BAA. Possibility of the BAA use in functional food stuffs composition on the basis of milk raw material is shown.

Keywords: plant pancreatic amylase inhibitor, pancreatic amylase , inhibition, immobilization.

Размещено на Allbest.ru

...