Участь антиоксидантних ферментів у модифікації відповіді дріжджів Saccharomyces Cerevisiae на нітрозитивний стрес

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Участь антиоксидантних ферментів у модифікації відповіді дріжджів Saccharomyces Cerevisiae на нітрозитивний стрес

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Оксид азоту (NO) бере участь у регуляції багатьох процесів у вищих організмах. Детально досліджені процеси участі NO у передачі сигналів у нервовій системі, функціонуванні серцево-судинної і імунної систем (Dawson, 1995; Ziolo, 2008; Lodoen, 2006). У низьких концентраціях NO забезпечує регуляцію фізіологічних процесів, тоді як підвищення його концентрації призводить до утворення токсичних для організму продуктів (Calabrese, 2007; Allen, 2009). Концентрація NO контролюється як на рівні його синтезу відповідними синтазами, так і на рівні його детоксифікації. Молекула NO має неспарений електрон тому може взаємодіяти з радикалами, металами активних центрів ферментів та сполуками з тіоловими групами (Radi, 2004). Протікання переважної більшості цих реакцій призводить до зниження концентрації NO у середовищі. Деякі утворені нітрозосполуки можуть вивільняти NO, а тому вважають, що у такій формі може відбуватись стабілізація і транспорт оксиду азоту до клітин-мішеней (Vanin, 1998). Оксид азоту характеризується широким спектром властивостей, які сильно залежать від клітинного оточення. Логічно постає питання про вивчення можливої участі ферментів суперооксиддисмутази і каталази, які у активному центрі містять іони металів і знижують рівень активованих форм кисню, у перебігу реакцій за участю оксиду азоту і його похідних.

Дріжджі Saccharomyces cerevisiae вдало використовуються як модель для вивчення основних шляхів і механізмів задіяних у функціонуванні живої системи, а також відповіді системи на зміну умов навколишнього середовища. До вагомих переваг використання дріжджів як модельної системи можна віднести: 1) високий ступінь подібності з тваринними клітинами у протіканні основних метаболічних шляхів, механізмах реалізації генетичного матеріалу і апоптозу, шляхів відповіді на зміни у навколишньому середовищі; 2) можливість отримання штамів, дефектних за певними генами, дає можливість дослідити роль продуктів цих генів.

Зв'язок даної роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 2005 по 2008 рік на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету ім. В. Стефаника і є частиною наукової тематики кафедри «Вивчення оксидативного стресу у тварин і мікроорганізмів з метою мінімізації його шкідливої дії» (№ д/р 0106U002245). У вказаній науково-дослідній роботі автором виконані дослідження по вивченню ролі антиоксидантних ферментів у захисті дріжджів від стресу, індукованого окисдом азоту.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було оцінити можливу роль антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази і каталази у модифікації відповіді дріжджів S. cerevisiae на нітрозитивний стрес; з'ясувати можливу участь транскрипційного фактору Yap1p у регуляції активностей супероксиддисмутази і каталази.

Для реалізації мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити вплив оксиду азоту на життєздатність клітин і показники оксидативного стресу;

2. Дослідити місце супероксиддисмутази і каталази у протіканні вільнорадикальних процесів за участю оксиду азоту;

3. Вивчити можливу участь транскрипційного фактору Yap1 у регуляції активностей антиоксидантних ферментів за дії нітрозитивного стресу.

Об'єкт дослідження - участь антиоксидантних ферментів у модифікації відповіді дріжджів S. cerevisiae на стрес, індукований донорами оксиду азоту.

Предмет дослідження - виживання клітин, активності антиоксидантних та чутливих до окислення ферментів, вміст продуктів окислення білків і рівень окисленого та відновленого глютатіону у S. cerevisiae за дії нітрозитивного стресу.

Методи дослідження. У роботі використовували мікробіологічні методи - культивування і оцінка життєздатності клітин; біохімічні методи - визначення активностей супероксиддисмутази, каталази, аконітази, нітрозоглютатіонредуктази, глютатіонредуктази, вмісту карбонільних груп білків, визначення концентрацій відновленого і окисленого глютатіону; методи конфокальної мікроскопії та математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що антиоксидантні ферменти каталаза і супероксиддисмутаза беруть участь у модифікації відповіді дріжджів S. cerevisiae на дію стресу, індукованого донорами оксиду азоту. Виявлена відмінність у чутливості до стресу, індукованого S-нітрозоглютатіоном, різних штамів S. cerevisiae, які характеризуються відсутністю одної або двох ізоформ каталази або супероксиддисмутази. Показано, що обробка клітин дикого типу донорами оксиду азоту призводить до підвищення активності каталази і СОД, а ефекти залежать від концентрації стресора. Встановлено, що досліджуваний стрес призводить до зниження активності аконітази внаслідок її інактивації, і зміни глютатіонового статусу, що свідчить про модифікацію у окисно-відновному статусі клітин. Вперше показано, що транскрипційний фактор Yap1 р бере участь у підвищенні активностей каталази і СОД за умов стресу, викликаного донорами оксиду азоту.

Практичне значення одержаних результатів. Представлені в роботі результати поглиблюють знання про функціональну роль антиоксидантних ферментів S. cerevisiae за дії стресу, що викликається донорами оксиду азоту. Отримані дані можна використовувати при розробці нових антимікробних препаратів і технологій промислового культивування дріжджів. Результати роботи використовуються при читанні лекцій та проведенні практичних занять з мікробіології, біохімії та молекулярної біології на кафедрі біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведений аналіз наукової літератури, виконана експериментальна частина роботи і статистична обробка даних. Планування роботи, аналіз та обговорення отриманого матеріалу, підготовка рукописів статей проводилося спільно з науковим керівником. Технічну допомогу при виконанні експериментів здійснювали студенти інституту природничих наук Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати, положення, висновки дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на міжнародній школі з вільних радикалів «Biomarkers of oxidative stress» (Спетцес, Греція, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, Україна, 2006), ІІІ міжнародній конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, Україна, 2007), IV Парнасівській конференції (Краків, Польща, 2007), міжнародній школі з фізіології «Molecular Physiology of Membrane Transport and Cell Excitability» (Яремче, Україна, 2007), 12-ому дріжджовому конгресі «Yeast for Human Progress» (Київ, Україна, 2008), звітно-наукових конференціях та засіданнях кафедри біохімії Прикарпатського національного університету імені Василя Стефаника (Івано-Франківськ, 2005-2008).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 5 статей у провідних фахових вітчизняних і закордонних журналах, а також 6 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних і міжнародних наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, анілізу рузультатів, висновків та списку використаних джерел, який містить 180 найменувань. Робота викладена на 123 сторінках друкованого тексту, містить 9 таблиць і 30 рисунків.

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовували штами дріжджів Saccharomyces cerevisiae вихідного (YPH250) і його ізогенних похідних дефектних за генами цитозольної (YTT7), пероксисомальної (YIT2), обох каталаз (YWT1), Cu, Zn-вмісної (SOD1?), Mn-вмісної (SOD2?), обох суперксиддисмутаз (SOD1?SOD2?), регуляторного білка Yap1 (YAP1?), г-глутамілцистеїнсинтази (GSH1?) і штам дріжджів з генетичною плазмідною конструкцією химерного білка Yap1-GFP. Частина штамів дріжджів були люб'язно надані доктором Йошіхару Іное (Кіотський інститут сільського господарства, Японія). Штами SOD2? і SOD1?SOD2? були сконструйовані спеціально для цієї роботи.

Клітини дріжджів культивували в рідкому напівсинтетичному живильному середовищі YPD, яке містило 1% дріжджового екстракту, 2% пептону і 2% глюкози. Проте для попередження втрати плазміди, що кодує химерний білок, клітини культивували у синтетичному середовищі SD яке містило 0,69% дріжджових азотистих основ, 0,192% суміші аміноксислот без триптофану і 2% глюкози. Культури дріжджів вирощували в умовах аерації на шейкері (175 об/хв) при 28єС до досягнення стаціонарної фази росту (72 год). В експериментах, в яких оцінювали виживання клітин, посів дріжджів здійснювали на чашки Петрі з сусло-агаровим середовищем (2% агару) після відповідних розведень.

Для індукції нітрозитивного стресу в S. cerevisiae інкубували у присутності донорів оксиду азоту таких, як нітропрусид натрію (НПН) або S-нітрозоглютатіон (GSNO) в аеробних або анаеробних умовах. Для блокування синтезу білка в клітинах дріжджів використали циклогексимід (Grollman, 1966). Суспензію дріжджів попередньо інкубували у присутності циклогексиміду (250 мкг/мл) протягом 30 хв, після чого обробляли донорами оксиду азоту.

Для проведення біохімічного аналізу з клітин дріжджів отримували безклітинні екстракти (Lushchak, 2005). В отриманих екстрактах визначали активності ферментів: каталази, супероксиддисмутази, аконітази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, малатдегідрогенази, глютатіонредуктази, ізоцитратдегідрогенази, нітрозоглютатіонредуктази (Lushchak, 2005). За одиницю активності ферментів брали таку кількість білку екстракту, яка каталізувала перетворення одного мікромоля субстрату, або утворення такої кількості продукту за одну хвилину. Серед показників оксидативного стресу визначали концентрацію карбонільних груп білків (Лущак, 2003), вміст високо- і низькомолекулярних тіолових груп, вміст окисленого і відновленого глютатіону, пероксидних груп ліпідів.

Для визначення локалізації білка Yap1 використовували штам дріжджів з плазмідою, що кодувала химерний білок Yap1-GFP. Локалізацію білка Yap1 визначали за розміщенням зеленого флуоресцентного білка на конфокальному мікроскопі Nikon 300 (емісія 488 нм, флуорисценсія 540 нм). Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд (Bradford, 1976) який ґрунтується на здатності білка зв'язувати барвник Кумасі яскраво-синій G-250 і утворювати забарвлені сполуки.

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали за допомогою комп'ютерної програми «Mynova» (Brooks, 1992). В якості статистичних показників брали середнє арифметичне (М) та похибку середнього арифметичного - S, або m. Порівняння середніх арифметичних і визначення достовірності між ними проводили за допомогою тесту Даннета.

Основний зміст роботи

оксидативний стрес каталаза вільнорадикальний

В даній роботі ми намагалися з'ясувати можливу участь антиоксидантних ферментів, зокрема супероксиддисмутази і каталази, у модуляції відповіді дріжджів на стрес, викликаний оксидом азоту. Для цього клітини дріжджів, дефектних за генами антиоксидантних ферментів, обробляли донорами оксиду азоту нітропрусидом натрію або S-нітрозоглютатіоном і визначали виживання, активності антиоксидантних і пов'язаних з ними ферментів, а також активність аконітази і рівень окисленого і відновленого глютатіону. Оскільки виявили, що донори оксиду азоту викликали збільшення активностей ферментів супероксиддисмутази і каталази, то вивчали і можливий шлях активації через регуляторний білок Yap1.

Супероксиддисмутаза. Дослідження впливу донора оксиду азоту S-нітрозоглютатіону на клітини дріжджів дикого і дефектних за геном цитозольної Cu, Zn-вмісної, Mn-вмісної або обох супероксиддисмутаз показали, що відсутність однієї або двох ізоформ ферменту призводить до зміни чутливості дріжджів до даного стресового агенту. Так, за дії донора оксиду азоту у концентраціях 10 і 20 мМ виживало приблизно 70% клітин

Подібною чутливістю характеризувались і дріжджі штаму SOD1?, дефектні за геном, що кодує цитозольну Cu, Zn-вмісну супероксиддисмутазу (Cu, Zn-СОД). Цікаво, що дріжджі штаму SOD2?, дефектні за геном Mn-вмісної мітохондріальної супероксиддисмутази (Mn-СОД), виявились стійкішими до дії S-нітрозоглютатіону, оскільки за дії стресора у концентраціях 10 і 20 мМ виживало понад 90% клітин. За тих же умов виживання клітин штаму SOD1?SOD2?, дефектного за генами обох СОД, характеризувались високою чутливістю до стресу, індукованого S-нітрозоглютатіоном. Так, обробка клітин даного штаму S-нітрозоглютатіоном у концентраціях 1 і 2,5 мМ знижувала виживання клітин на 9 і 11%, а після обробки S-нітрозоглютатіоном у концентрації 20 мМ виживало лише 67% клітин. Таку значну різницю у виживанні клітин різних штамів можна пояснити участю різних ізоформ СОД у зміні напрямку протікання реакцій за участю NO і його похідних, які залежно від конкретних умов можуть бути як анти - так і прооксидантами.

Звичайно, найімовірніше, роль СОД у модифікації процесів за участю оксиду азоту і його похідних може полягати у зниженні рівня супероксидного аніону. Зниження інтенсивності детоксикації супероксидного аніону може призводити до стимуляції утворення пероксинітриту. Було показано, що пероксинітрит пошкоджує компоненти дихального ланцюга мітохондрій, інактивує аконітазу, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу та багато інших ферментів (Castro, 1994; Souza, 1998; Lee, 2003). З огляду на це, високу смертність клітин штаму SOD1?SOD2? можна пояснити тим, що відсутність СОД може підвищувати рівень супероксидного аніону.

Активність СОД зростала при обробці дріжджів дикого штаму YPH250 як нітропрусидом натрію (НПН), так і S-нітрозоглютатіоном (GSNO) (рис. 2). Порівняння ефектів двох донорів показало, що ступінь активації СОД відрізнявся при обробці дріжджів НПН і GSNO. Так, обробка НПН у концентрації 1,0 мМ призводила до зростання активності СОД на 37% (рис. 2A), тоді як обробка GSNO у такій самій концентрації викликала зростання активності на 74% порівняно з необробленими клітинами (рис. 2Б).

Різний ступінь зростання активності СОД можна пояснити швидкістю вивільнення оксиду азоту з двох донорів, а також природою самих донорів.

З рис. 2Б також видно, що при збільшенні концентрації GSNO до 10 і 20 мМ активність СОД не відрізнялась від такої у необроблених клітинах. Подібні результати були отримані у нашій лабораторії в дослідах по обробці дріжджів пероксидом водню у різних концентраціях (Байляк, 2006). В роботі спостерігали зростання активності СОД після обробки дріжджів низькими концентраціями пероксиду водню, тоді як за умов обробки клітин вищими концентраціями активність ферменту знижувалась. Це може свідчити про те що низькі концентрації стресора викликають підвищення активності СОД, а при збільшенні концентрації, наряду з процесом активації, відбувається процес інактивації СОД пероксидом водню.

Цікаво, що інгібітор синтезу білка циклогексимід не блокував зростання активності СОД під дією донорів. Як при обробці НПН, так і GSNO, у клітинах із заблокованим синтезом білка, активність СОД була вищою порівняно з такою у необроблених клітинах. Зростання активності СОД у обох випадках можна пояснити наявністю в клітині неактивних ізоформ СОД за нормальних умов. Можна припустити, що стрес, викликаний донорами оксиду азоту, інтенсифікував, наприклад, процеси вмонтовування іонів міді у молекули неактивного апоферменту. Для ідентифікації збільшення якої з ізоформ СОД призводить до зростання загальної активності СОД використали штами дріжджів, дефектних за геном Cu, Zn-СОД (SOD1?) або Mn-СОД (SOD2?). Обробка дріжджів штамів SOD1? і SOD2? S-нітрозоглютатіоном показала, що за таких умов збільшення активності Cu, Zn-СОД або Mn-СОД не відбувалось. З наших результатів можна припустити, що зростання загальної активності СОД у клітині за дії стресу, викликане зростанням кількості Cu, Zn-СОД, частка якої залежно від умов може становити 85-90% від загальної активності СОД. Проте, підвищення активності Cu, Zn-СОД може залежати від процесів за участю Mn-СОД через активацію альтернативних регуляторних шляхів.

З даних представлених на рис. 3 можна зробити висновок, що жодна з ізоформ каталази не задіяна у процесах активації СОД за умов стресу, генерованого GSNO, тоді як за дії стресу, генерованого НПН, каталаза є необхідною у регуляції активності СОД. Це свідчить про те, що існують певні відмінності у механізмі відповіді дріжджів на стрес, індукований GSNO або НПН. Швидше за все, мова може йти про перерозподіл стаціонарних концентрацій активованих форм кисню. Обробка дріжджів штамів YIT2, YTT7 і YWT1 S-нітрозоглютатіоном показала, що за даних умов відбувалось зростання активності СОД у дріжджів трьох штамів (рис. 3). Водночас при обробці НПН клітин штамів YIT2 і YTT7 збільшення активності СОД не виявили.

У дріжджів S. cerevisiae існує ціла низка білків-регуляторів, за допомогою яких відбувається регуляція транскрипції генів антиоксидантних і пов'язаних з захистом від оксидативного стресу ферментів. Одним з таких білків є транскрипційний фактор Yap1, який є гомологом тваринного білка АР1. Даний білок містить чутливі до окислення сульфгідрильні групи (Лущак, 2008).

Оскільки з одного боку білок Yap1 чутливий до оксидантів, а з іншого здійснює транскрипційний контроль генів СОД, постало питання про можливу участь даного білка у регуляції активності СОД за умов стресу, генерованого донорами оксиду азоту. Для цього дріжджі штаму, дефектного за синтезом білка Yap1, обробляли НПН і GSNO і визначали активність СОД. Проте, жодних змін у активності СОД у дріжджів штаму, дефектного за білком Yap1, не було. Одночасно відбувалось накопичення білка Yap1 у ядрі (рис. 4).

Ці факти дозволяють з високою імовірністю стверджувати, що білок Yap1 задіяний у регуляції активності СОД за дії нітрозитивного стресу.

Каталаза. Каталізуючи реакцію дисмутації пероксиду водню, каталаза відіграє важливу роль у захисті клітини дріжджів від негативної дії цього агенту. Детоксикацію пероксиду водню у цитозолі здійснює каталаза Т, а в пероксисомах її забезпечує пероксисомна каталаза А. Пероксисомна каталаза метаболізує пероксид водню, утворений у пероксисомах в результаті процесів окислення. Пероксид водню, що утворюється, зокрема, внаслідок функціонування СОД, у інших компартментах метаболізується цитозольною каталазою.

В даній роботі вивчали можливу участь окремих ізоформ каталази у модифікації відповіді дріжджів на стрес, генерований НПН або GSNO. При обробці НПН дріжджів, дефектних за генами каталаз, зниження виживання не спостерігали. Проте, обробка клітин дріжджів штамів YPН250, YIT2, YTT7 і YWT1 GSNO протягом 1 год показала, що дріжджі різних штамів відрізняються чутливістю до даного стресу (рис. 5). Дріжджі штаму YIT2 виживали подібно до дріжджів дикого штаму. Клітини штаму YTT7 були дещо чутливішими до дії GSNO, оскільки за умов стресу, індукованого 20 мМ GSNO, виживало лишень 88% клітин порівняно з клітинами дикого штаму. Несподівано, клітини, дефектні за генами обох каталаз, були менш чутливими до дії стресу індукованого GSNO, адже за дії стресора у концентраціях 10 і 20 мМ виживало на 16 і 30% більше клітин, ніж клітин дикого штаму за таких самих умов. Різниця у чутливості дріжджів, дефектних за генами каталаз, може свідчити про те, що залежно від умов, наявність чи відсутність певної ізоформи каталази визначає напрямок протікання реакцій за участю оксиду азоту і його похідних. Іншими словами, залежно від умов і від типу стресу каталаза може виконувати як анти - так і прооксидантну роль.

Антиоксидантна роль каталази може проявлятись у зниженні рівня вільного оксиду азоту через взаємодію з гемовим атомом заліза, і в такий спосіб знижувати імовірність утворення пероксинітриту. Утворення пероксинітриту також може відбуватись при взаємодії залізо-нітрозильного комплексу з пероксидом водню, тобто зниження рівня останнього знижує ймовірність протікання даної реакції.

Проте, менша чутливість безкаталазних клітин може свідчити про те, що відсутність каталази сприяє кращому виживанню клітин за умов стресу, генерованого донорами оксиду азоту. Зокрема прооксидантна роль каталази може проявлятись в утворенні залізо-нітрозильного комплексу.

Активність каталази зростала при обробці дріжджів дикого штаму НПН і S-нітрозоглютатіоном (рис. 6). Причому як НПН, так і GSNO, активували каталазу подібним чином - активність ферменту зростала на 20-40%. Тому постало питання ідентифікації ізоформи каталази за рахунок збільшення кількості якої відбувалось зростання загальної каталазної активності. Активність каталази зростала у дріжджів штаму YTT7, які мають тільки пероксисомну ізоформу, за дії стресу, індукованого НПН (рис. 3.3). За цих самих умов жодних змін у активності каталази у дріжджів штаму YIT2 не спостерігали. Зростання активності каталази не відбувалось у дріжджів штамів YIT2 і YTT7 за умов стресу, індукованого S-нітрозоглютатіоном.

Різниця між відповіддю дріжджів дефектних штамів на дію НПН або S-нітрозоглютатіону може бути викликана генерацією різної кількості оксиду азоту. Проте, не можна виключити і можливість збільшення активності каталази через синтез нових молекул, оскільки супероксидний аніон, утворений у результаті відновлення молекули кисню НПН, активує шлях за участю білка Yap1.

Щодо активності каталази у дріжджів, дефектних за генами Cu, Zn-СОД, Mn-СОД або обох СОД, то можна сказати, що за умов стресу, індукованого GSNO, динаміка активності відрізнялась. Так, у дріжджів, дефектних за геном цитозольної СОД, змін у активності каталази при обробці GSNO не спостерігали. Проте, втрата мітохондріальної або обох супероксиддисмутаз призводила до протилежних ефектів. При обробці дріжджів штаму SOD2? спостерігалось зниження активності каталази, при збільшенні концентрації донора, ймовірно через її інактивацію (рис. 7А) (Wink, 1996). На відміну від клітин штаму SOD2?, у дріжджів штаму SOD1?SOD2? активність каталази зростала при збільшенні концентрації GSNO (рис. 7Б).

У роботі ми намагались не тільки з'ясувати поведінку різних ізоформ каталази за дії нітрозитивного стресу, але й ідентифікувати механізми регуляції активності даного ферменту. Так, інгібування синтезу білка циклогексимідом показало, що у дріжджів із заблокованим синтезом білка активації каталази не відбувається, як після обробки НПН, так і після обробки GSNO. Отже - збільшення активності каталази, є результатом синтезу нових молекул ферменту.

Оскільки збільшення активності каталази було викликане синтезом нових молекул, не можна виключати тої можливості, що саме завдяки регуляторному шляху за участю транскрипційного фактору Yap1p відбувалось зростання кількості даного ферменту. Активність каталази не змінювалась після обробки дріжджів штаму Yap1? після обробки НПН і GSNO. Цей факт може свідчити про те, що зростання активності каталази є результатом як підвищення інтенсивності синтезу мРНК, так й інтенсифікації синтезу нових молекул білка. Звичайно, підтвердженням зростання кількості молекул каталази через інтенсифікацію процесів транскрипції і трансляції підтверджує накопичення білка Yap1 у ядрі (рис. 4).

Аконітаза. Зазвичай для отримання більш повної картини впливу певного стресового фактору визначають не тільки компоненти системи, які можуть бути задіяні у захисті, а й певні маркери стресу. Саме за цими показниками і можна оцінити, наскільки інтенсивно впливав досліджуваний чинник на систему, що вивчається. Наприклад, як маркери оцінки розвитку оксидативного стресу використовують такі показники, як кількість карбонільних груп білків, продукти перекисного окислення ліпідів, модифікації і розриви у молекулах ДНК. Проте, є ще одна група маркерів, за допомогою яких можна оцінити інтенсивність дії стресового фактору. До цієї групи відносять ферменти, активні центри яких чутливі до окисної модифікації.

Вивільнення іону заліза з активного центру може призводити до збільшення внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів заліза. Відновлений іон заліза, наприклад аскорбатом, може виступати донором електронів для відновлення пероксиду водню. В результаті відбувається утворення надзвичайно реакційноздатного гідроксильного радикалу. З іншого боку, неактивна цитозольна форма анонітази, тобто та, яка характеризується наявністю [3Fe-4S] кластера, перетворюється на білок, який бере участь у регуляції обміну заліза у клітинах дріжджів (Brown, 2002).

В даній роботі ми визначали активність аконітази за дії стресу, індукованого нітропрусидом натрію і S-нітрозоглютатіоном. Так, при обробці дріжджів дикого штаму НПН відбувалось зниження активності аконітази (рис. 8).

Зниження активності аконітази могло відбуватись з декількох причин. По-перше, це звичайно інактивація самим оксидом азоту (Lancaster, 1990; Stadler, 1993). По-друге, інактивація пероксинітритом, що імовірно міг утворюватись при взаємодії утвореного оксиду азоту з внутрішньоклітинним супероксидним аніоном (Castro, 1994). Як випливає з даних, представлених на рис. 8, блокування синтезу білка не змінювало інтенсивності зниження активності ферменту.

Клітини дикого штаму зазнавали стресу при обробці S-нітрозоглютатіоном, про що свідчить зниження активності аконітази у клітинах дріжджів після обробки GSNO. Хоча за даних умов і відбувалось зниження активності аконітази, активність ферменту після обробки донором у концентрації 20 мМ не сильно відрізнялась від такої у клітин, оброблених донором у концентрації 1 мМ. Даний феномен можна пояснити наявністю у дріжджів двох ізоформ аконітази Aco1 i Aco2. Одна з ізоформ надзвичайно чутлива до окислення і швидко інактивується навіть при низьких концентраціях окисників. Друга ізоформа достатньо стійка до дії стресорів, можливо, через певні структурні особливості.

Подібно до клітин дикого штаму відбувалось зниження активності аконітази у дріжджів штаму YTT7, дефектного за синтезом цитозольної каталази. Активність аконітази різко знижувалась після обробки клітин GSNO у концентрації 1 мМ, а подальше збільшення концентрації GSNO суттєво не пливало на активність аконітази у клітинах цього штаму (рис. 9Б). Чітка залежність активності аконітази від концентрації GSNO спостерігалась у дріжджів, дефектних за генами обох каталаз (рис. 9В).

Отже, при обробці клітин даного штаму спостерігалась зниження активності ферменту при збільшенні концентрації донора. Неочікувано, обробка дріжджів штаму YIT2, дефектного за геном пероксисомної каталази, не призводила до зниження активності аконітази (рис. 9А).

Цікаво, що активність аконітази у дріжджів, дефектних за білком Yap1 за дії стресу, індукованого НПН не змінювалась. Проте, порівнюючи з активністю аконітази у клітинах дикого штаму, інкубованих з НПН у тих самих концентраціях можна побачити, що активність ферменту знижувалась до такої, яка була характерна для дріжджів, дефектних за білком Yap1. Оскільки, у дріжджів, дефектних за синтезом білка Yap1, не відбувалась збільшення активності каталази, то можна навіть припустити, що збільшення активності каталази якимось чином пов'язане з процесом зниження активності аконітази, а також, що у дріжджів дефектного штаму наявна тільки стійка до інактивації ізоформа аконітази.

Звичайно досить важко визначити роль кожної з ізоформ каталази у процесах за участю оксиду азоту і його похідних, проте однозначно можна стверджувати, що каталаза бере участь у модифікації відповіді дріжджів на дію донорів оксиду азоту.

Глютатіоновий статус. Як глютатіон, так й інші тіолвмісні сполуки, можуть брати участь у багатьох процесах перетворення оксиду азоту і його похідних у біологічних системах. Дані сполуки можуть безпосередньо взаємодіяти з оксидом азоту і таким чином знижувати ризик утворення пероксинітриту. Інший механізм за участю тіолвмісних сполук - це відновлення залізо-нітрозильних комплексів, утворення яких призводить до порушення функціонування металопротеїдів. При взаємодії з молекулами-окисниками або окисленими тіоловими групами відбувається окислення глютатіону. У зв'язку з цим рівень окисленого глютатіону може слугувати показником стресового стану клітини. Проте ще чіткіше зміни у окисно-відновному статусі клітини визначаються з використанням, так званого, глютатіонового статусу, який характеризує відношення кількості окисленого до кількості відновленого глютатіону ([GSSG]/[GSH]).

У даній роботі відношення окисленого до відновленого глютатіону використовували для оцінки інтенсивності дії оксиду азоту, генерованого нітропрусидом натрію і S-нітрозоглютатіоном.

Відношення [GSSG]/[GSH] свідчить про окисно-відновний стан клітини, а його збільшення при стресі свідчить про інтенсифікацію процесів окислення. Порівнюючи даний показник у клітинах дикого і дефектних за генами каталаз штамів, варто зауважити, що найнижчим цей показник був у клітин дикого штаму (рис. 10), дещо вищим у клітин дефектних за геном однієї чи іншої каталази. Проте, у клітин штаму, дефектного за генами обох каталаз, даний показник був у 10 разів вищим порівняно з клітинами дикого штаму.

Обробка GSNO збільшувала відношення [GSSG]/[GSH] у дріжджів дикого і дефектних за геном цитозольної каталази або генами обох каталаз (рис. 10). Збільшення відношення між двома формами глютатіону свідчить про те, що клітини даних штамів зазнавали стресу, причому даний стрес був пов'язаний зі змінами окисно-відновного стану клітин. Окислення тіолів, зокрема глютатіону, за участю оксиду азоту, відбувається переважно, через утворення нітрозотіолів. Останні можуть утворюватись в результаті взаємодії тіолвмісних сполук з молекулами N₂O₂ (димер NO) або залізо-нітрозильними комплексами. Утворення дисульфідів може відбуватись при взаємодії нітрозотіолів з іншими тіолвмісними сполуками. Так, взаємодія S-нітрозоглютатіону з відновленим глютатіоном призводить до утворення окисленої форми глютатіону, при цьому відбувається виділення оксиду азоту. В результаті взаємодії S-нітрозоглютатіону з цистеїновими залишками білків утворюється аддукт білок-глютатіон, у якому молекула глютатіону ковалентно зв'язана з білком через дисульфідний місток (West, 2006).

Збільшення відношення концентрації окисленого та відновленого глютатіону також відбувалось при обробці дріжджів, дефектних за генами супероксиддисмутаз, донором оксиду азоту. З рис. 11 видно, що відношення [GSSG]/[GSH] найбільше зростало у дріжджів штаму, дефектного за генами обох СОД (рис. 11В). Різке збільшення відношення [GSSG]/[GSH] у клітин дефектного штаму і може пояснювати високу чутливість клітин даного штаму до стресу, генерованого GSNO (рис. 1). Оскільки клітини дріжджів, дефектних за генами обох СОД, виживали значно гірше у порівнянні з клітинами дикого штаму, можна припустити, що відсутність обох ізоформ СОД призводить до інтенсифікації процесів окислення глютатіону, найімовірніше, через підвищену генерацію пероксинітриту.

Відношення [GSSG]/[GSH] не змінювалось при обробці дріжджів, дефектних за білком Yap1, за дії стресу, індукованого нітропрусидом натрію. Оскільки відношення [GSSG]/[GSH] у клітин дріжджів штаму було таким, як у дріжджів дикого штаму за дії НПН у концентраціях 1,0 і 2,5 мМ, можна припустити, що клітини дефектного штаму зазнають постійного стресу через порушення регуляції активностей СОД і каталази.

Узагальнення

Вплив оксиду азоту на дріжджі, як і на вищі еукаріотичні організми, залежить від його концентрації. За низьких концентрацій виконує NO регуляторну роль, тоді як за високих призводить до пошкодження цілісності клітин і тканин. У даній роботі ми показали, що вплив NO на клітини дріжджів залежить від його концентрації. Проте деякі клітинні білки можуть як інтенсифікувати, так і гальмувати процеси за участю NO і його похідних. До цих білків можна віднести антиоксидантні ферменти супероксиддисмутазу і каталазу. Ці ферменти можуть бути безпосередньо або опосередковано залучені у метаболізм активованих форм азоту (рис. 12.). Зниження активності супероксиддисмутази, ймовірно, відбувається за участю пероксинітриту. Інактивація каталази може відбуватись через утворення залізо-нітрозильного комплексу або безпосереднє окислення пероксинітритом. Оксид азоту і пероксинітрит інактивують аконітазу. Взаємодія з пероксинітритом призводить до руйнування активного центру ферменту і зміни структури білка. Токсичність пероксинітриту також проявляється у процесах окислення глютатіону, що призводить до порушення окисно-відновного стану клітини.

Ферменти супероксиддисмутаза і каталаза можуть виступати активними учасниками обміну АФА у клітині дріжджів. Знижуючи рівень супероксидного аніону, СОД може запобігати утворенню пероксинітриту. Водночас СОД може відновлювати оксид азоту до менш токсичного нітронільного аніону. Утворення залізо-нітрозильного комплексу при взаємодії каталази і оксиду азоту знижує внутрішньоклітинну концентрацію останнього, а зниження концентрації пероксиду водню перешкоджає утворенню пероксинітриту.

Отже, супероксиддисмутаза і каталаза можуть впливати на протікання реакцій за участю АФА. Дані ферменти не тільки знижують концентрацію оксиду азоту, а й унеможливлюють його взаємодію з активованими формами кисню, внаслідок чого не відбувається утворення вторинних метаболітів. Тому досить логічним є той факт, що при дії стресу, індукованого оксидом азоту, відбувається зростання активності як СОД так і каталази.

Висновки

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і вирішення окремих аспектів можливої участі антиоксидантних ферментів каталази і супероксиддисмутази у протіканні реакцій за участю оксиду азоту і його похідних. Виявлено, що клітини дріжджів, дефектних за синтезом антиоксидантних ферментів, по-різному реагують на стрес, індукований оксидом азоту.

1. Виявлено, що нітрозитивний стрес, індукований нітропрусидом натрію і S-нітрозоглютатіоном, призводить до підвищення активності супероксиддисмутази у клітинах дріжджів S. cerevisiae. Зокрема активність ферменту була вищою у дріжджів, оброблених натропрусидом натрію у концентрації 5 мМ на 39%, а у оброблених S-нітрозоглютатіоном у концентрації 1 мМ на 74%. Активніcть супероксиддисмутази була вищою у клітин, оброблених донорами оксиду азоту, у випадку інгібування синтезу білка циклогексимідом, що може свідчити про можливість активації наявного апоферменту.

2. Нітрозитивний стрес, викликаний нітропрусидом натрію і S-нітрозоглютатіоном, викликає підвищення активності каталази у клітинах дріжджів S. cerevisiae. Зокрема активність ферменту була вищою у дріжджів оброблених натропрусидом натрію у концентрації 5 мМ на 36%, а у оброблених S-нітрозоглютатіоном у концентрації 20 мМ на 43%. Активація каталази блокувалась циклогексимідом, що свідчить про синтез ферменту de novo.

3. Клітини дріжджів, дефектних за генами каталази і супероксиддисмутази, відрізняються за чутливістю до нітрозитивного стресу.

4. У клітинах дріжджів S. cerevisiae відбувається підвищення інтенсивності окислення глютатіону за умов нітрозитивного стресу і знижується активність чутливого до окислення ферменту аконітази. Дані зміни свідчать про розвиток оксидативого стресу. Найімовірніше у цих процесах задіяний пероксинітрит, який утворюється у результаті взаємодії оксиду азоту і супероксидного аніону.

5. Вперше показано, що білок Yap1 задіяний у активації супероксиддисмутази і каталази у клітинах дріжджів при нітрозитивному стресі.

6. Ізоформи каталази і супероксиддисмутази задіяні у модифікації відповіді клітин дріжджів на нітрозитивний стрес.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Lushchak O. Possible pathways involved in activation of catalase and superoxide dismutase in yeast S. сerevisiae treated with sodium nitroprusside / O. Lushchak., V. Lushchak // Український біохімічний журнал - 2009. - Т. 81, №2. - С. 26-31.

(Планування, експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

2. Lushchak O. Nitrosative stress, induced by sodium nitroprusside, activates primary antioxidant enzymes and inactivates aconitase in Saccharomyces cerevisiae cells / O. Lushchak., V. Lushchak // Redox Report - 2008. - Vol. 13, №4. - P. 144-152. (Планування, експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

3. Лущак О. S-Нітрозоглютатіон індукує нітрозитивний стрес у дріжджів: модифікуюча роль каталаз / О. Лущак, О. Лозінський, Т. Назарчук, В. Лущак // Український біохімічний журнал - 2008. - Т. 80, №2. - С. 84-91. (Планування, експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

4. Lushchak O. Catalase modifies yeast Saccharomyces cerevisiae response toward S-nitrosoglutathione induced stress / O. Lushchak., V. Lushchak // Redox Report - 2008. - Vol. 13, №6. - P. 283-291. (Планування, експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

5. Лущак О. Инактивация генов супероксиддисмутазы модифицирует ответ дрожжей на стресс, индуцированный S-нитрозоглютатионом / О. Лущак, T. Охдат, Й. Инуи, В. Лущак // Биохимия (Москва) - 2009. - Vol. 74, №2. - P. 272-279. (Планування, експериментальна частина роботи, статистична обробка даних та написання рукопису статті здійснені дисертантом).

6. Lushchak O. Superoxide dismutase and catalase modulate yeast cell response to nitric oxide-induced stress. / O. Lushchak, V. Lushchak // Матеріали 12-го дріжджового конгресу (Київ, 11-15 серп. 2008).

7. Lushchak O. Nitrosative stress activates antioxidant enzymes and inactivates aconitase in yeast S. cerevisiae. / O. Lushchak, V. Lushchak // зб. тез міжнародної школи по фізіології [«Molecular Physiology of Membrane Transport and Cell Excitability»], (Яремче, 19 - 23 вер. 2007).

8. Lushchak O. Nitrosative stress activates antioxidant enzymes and inactivates aconitase in yeast S. cerevisiae. / O. Lushchak // зб. тез доповідей ІІІ Міжнар. наук. конф. студентів та аспірантів [«Молодь та поступ біології»], (Львів, 23 - 27 квіт. 2007 р.). - Л.: ЛНУ ім. І. Франка, 2007. - С. 44.

9. Lushchak V. Yap1 mediates an adaptive response of S. cerevisiae cells to nitrosative stress. / V. Lushchak, O. Lushchak // Матеріали 6-го Парнасівського з'їзду, 30 трав. - 2 чер. 2007 р., Краків - C. 37.

10. Lushchak O. Nitrosative stress, induced by sodium nitroprusside, activates primary antioxidant enzymes and inactivate aconitase in S. cerevisiae. / O. Lushchak, V. Lushchak // зб. тез міжнародної школи по вільних радикалах [«Biomarkers of oxidative stress and responses»], (Спетцес, 30 вер. - 6 жовт. 2006 р.).

11. Lushchak O. Nitrosative stress, induced by sodium nitroprusside, activates primary antioxidant enzymes and inactivates aconitase in S. cerevisiae. / O. Lushchak, V. Lushchak // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду, 24-27 квіт. 2006 р., Харків. Т. 1. - Х: ХНУ ім. Каразіна, 2005. - С. 120.

Размещено на Allbest.ru