Взаємозв’язок азотфіксації і лектинової активності симбіотичної системи сої за різних рівнів її ефективності

Размещено на http://www.allbest.ru/

національна академія наук україни

інститут фізіолгії рослин і генетики

УДК 581.557:581.13:547.96:579.841.3

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Взаємозв'язок азотфіксації і лектинової активності симбіотичної системи сої за різних рівнів її ефективності

03.00.12 -- фізіологія рослин

Ситніков Денис Михайлович

Київ -- 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Коць Сергій Ярославович, інститут фізіології рослин і генетики НАН України, завідувач відділу.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, чл.-кор. НАН України Мусатенко Людмила іванівна, Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України, завідувач відділу;

доктор біологічних наук, професор Антипчук Адель Федорівна, Відкритий міжнародний університет розвитку людини “Україна”, завідувач кафедри.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться: 17.05. 2007 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 при інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, Васильківська вул., 31/17.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ, Васильківська вул., 31/17.

Автореферат розісланий 14.04.2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук є.Ю. Мордерер.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Фіксація молекулярного азоту симбіотичними системами рослин і бульбочкових бактерій - процес планетарного значення, який набуває особливої актуальності при впровадженні високопродуктивного та екологічно чистого землеробства.

Формування симбіозу - це складний багатоступеневий процес, в якому виділяють серію скоординованих етапів. На перших стадіях його становлення важливу роль відводять різним компонентам контактуючих поверхонь партнерів симбіозу, зокрема лектинам рослин. При цьому лектини розглядають не тільки як молекулярну детермінанту, яка комплементарно зв'язує рецептори мікросимбіонта на етапі розпізнавання, але і як молекулярний сигнал, який рослина-хазяїн адресує своєму партнеру.

Лектини виявлено в органах і тканинах багатьох рослинних організмів. Вважається, що білки, яким притаманна лектинова активність, беруть участь у ряді фізіологічних процесів, що відбуваються в організмі рослини, і можуть бути стресовими білками. Тим не менше, на сьогодні їхня роль в основному з'ясована у механізмах розпізнавання біологічними об'єктами один одного, зокрема на етапі становлення симбіотичних взаємовідносин; дані стосовно участі цих білків в інших фізіологічних процесах не чисельні.

Проблема “біологічного” азоту потребує всебічного дослідження та пошуку шляхів інтенсифікації роботи симбіотичного апарату. Встановлення ж закономірностей зміни активності лектинів різних органів бобових в онтогенезі необхідне для з'ясування зв'язку між азотфіксацією і лектиновою активністю симбіотичної системи, що важливо для розуміння ролі цих білків у житті рослин і функціонуванні симбіозу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках науково-дослідних тем відділу симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України на 2001-2005 рр. “Вивчити процеси взаємодії бульбочкових бактерій із рослиною-хазяїном та розробити заходи підвищення продуктивності бобових культур за рахунок максимального використання біологічного азоту” (р/№ 0101U000627), на 2002-2006 рр. “Методами генної інженерії отримати нові штами азотфіксуючих мікроорганізмів і створити високоефективні азотфіксуючі системи бобових та злакових культур” (р/№ 0102U002460) і на 2006-2010 рр. “Дослідити фізіологічні процеси функціонування бобово-ризобіального симбіозу і розробити методи його інтенсифікації” (р/№ 0106U006461).

Мета і задачі дослідження. Головною метою досліджень було вивчення ролі лектинів у процесі формування і функціонування бобово-ризобіального симбіозу, зокрема встановлення зв'язку між азотфіксуючою активністю симбіотичного апарату і лектиновою активністю різних органів сої. Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- використовуючи симбіотичні властивості активного і неактивного штамів бульбочкових бактерій, а також різні концентрації мінерального азоту в середовищі вирощування рослин створити симбіотичні системи із різними рівнями ефективності;

- встановити ступінь модуляторного впливу гомологічного лектину на зміну симбіотичних властивостей бульбочковими бактеріями за різного забезпечення мінеральним азотом;

- визначити рівень лектинової активності органів сої на різних етапах життєвого циклу в залежності від ефективності симбіозу та дослідити зв'язок між інтенсивністю азотфіксації і лектиновою активністю;

- визначити інтенсивність фотосинтезу сої в симбіотичних системах із різними рівнями ефективності;

- встановити вплив гомологічного лектину та інших білків на зміну рівня ефективності симбіотичних систем і оцінити перспективність використання бактеріальних препаратів, модифікованих гомологічним лектином.

Об'єкт дослідження - симбіотичні системи, створені за участю рослин сої Glycine max (L.) Merr. і бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum активного штаму 634б, неактивного штаму 604к, а також Tn5-мутанта штаму 646 (Т66).

Предмет дослідження - фізіологічні процеси, що відбуваються в симбіотичних системах сої з різними рівнями ефективності.

Методи дослідження - фізіологічні (визначення інтенсивності фотосинтезу і провідності листків для СО₂), біохімічні (визначення азотфіксуючої активності симбіотичних систем, виділення білкових екстрактів, визначення вмісту фотосинтетичних пігментів), імунологічні (визначення лектинової активності), мікробіологічні (вирощування мікроорганізмів, визначення їхньої кількості і життєздатності, виготовлення бактеріальних препаратів), біометричні і статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено, що за умов ефективної взаємодії макро- і мікросимбіонтів існує прямий зв'язок між азотфіксацією кореневих бульбочок сої і лектиновою активністю виділених із них білків, що вказує на важливу роль гемаглютинуючих білків у функціонуванні симбіотичного апарату. За неефективного симбіозу незначному рівню азотфіксації відповідає низька або така, що знижується в онтогенезі, лектинова активність у бульбочках. Вперше показано, що зміна показників інтенсивності фотосинтезу за умов різного забезпечення рослин сої мінеральним і біологічним азотом супроводжується зміною гемаглютинуючої активностi бiлкiв у листках.

З'ясовано, що ефективна робота симбіотичного апарату в більшій мірі стимулює інтенсивність фотосинтезу листків сої, ніж внесення в субстрат вирощування рослин повної норми мінерального азоту. Отримані дані свідчать про наявність не лише трофічних, але й регуляторних взаємозв'язків між азотфіксацією і фотосинтезом.

Вперше встановлено, що інкубація бульбочкових бактерій з гомологічним лектином позитивно впливає на симбіотичні властивості активного штаму Bradyrhizobium japonicum 634б, а також фізіологічний стан рослини-хазяїна і, навпаки, виявляє супресорну дію на симбіотичні системи, утворені за участю неактивного штаму ризобій B. japonicum 604к.

Вперше показано, що стимулюючий вплив рослинного лектину на симбіотичні властивості ризобій і ефективність симбіозу обмежується кількістю мінерального азоту в середовищі вирощування рослин.

Практичне значення отриманих результатів. Вивчено можливість практичного застосування лектинів як біологічно активних речовин при розробці нових підходів до керування продукційним процесом у бобових. Встановлено, що використання рослинного лектину при виготовленні бактеріальних препаратів для інокуляції насіння підвищує ефективність симбіотичної системи сої та збільшує її продуктивність. Викладені в роботі результати вказують на перспективність застосування бактеріальних препаратів, модифікованих рослинним лектином, і можуть бути використані для удосконалення технології їх виробництва.

Особистий внесок здобувача полягає в самостійному аналізі літератури, оволодінні необхідними методами досліджень, плануванні і проведенні експериментів, аналізі та статистичній обробці одержаних результатів, підготовці до друку наукових робіт. Результати дисертаційної роботи отримані автором самостійно або спільно з співробітниками відділу симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Планування окремих експериментів проводилось за участю к.б.н. С.М. Маліченко, із якою автор поділяє частину одержаних результатів. Частка особистої участі здобувача становить понад 75%.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені і доповідалися на IX Конференції молодих дослідників, присвяченій 100-річчю від дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНIЛ П.А. Власюка “Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і грунтових мікроорганізмів” (Київ, 2005), Всеукраїнській науково-практичній конференції, присвяченій 90-річчю від дня народження професора В.О. Михайлова “Современные проблемы физиологии и интродукции растений” (Дніпропетровськ, 2005), Міжнародній науковій конференції “Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища” (Кривий Ріг, 2005), XVII Міжнародному ботанічному конгресі (Відень, Австрія, 2005), IV Міжнародній науковій конференції “Регуляция роста, развития и продуктивности растений” (Мінськ, Білорусія, 2005), Першій Міжнародній конференції молодих учених “Сучасні проблеми екології” (Запоріжжя, 2005), Науковій конференції молодих учених “Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології” (Ужгород, 2005), 10-й Пущинській школі-конференції молодих учених, присвяченій 50-річчю Пущинського наукового центру РАН “Биология - наука XXI века” (Пущино, Росія, 2006), ХII З'їзді Українського ботанічного товариства (Одеса, 2006), а також на наукових семінарах та щорічних звітах відділу симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України (2004-2006 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи автором опубліковано 14 праць, із них 5 статей у провідних фахових виданнях і 9 тез доповідей.

Об'єм та структура роботи. Дисертація викладена на 162 сторінках машинописного тексту й містить 11 рисунків і 27 таблиць. Робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів, у яких наведено результати досліджень, висновків та списку використаної літератури (195 найменувань).

Основний зміст роботи

Огляд літератури. Перший розділ дисертації складається із трьох підрозділів, у яких викладено огляд вітчизняної та зарубіжної літератури стосовно фізіолого-біохімічних особливостей формування та функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Подано загальну характеристику лектинів, їх біологічні функції та роль у життєдіяльності рослин. Висвітлено фактори, що визначають симбіотичні взаємовідносини між партнерами симбіозу та його ефективність. На основі аналізу й узагальнення наукових першоджерел обгрунтовано актуальність проведення досліджень за темою дисертаційної роботи.

Об'єкти і методи досліджень. В експериментах використовували рослини сої Glycine max (L.) Merr. сорту Мар'яна спільної селекції інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Селекційно-генетичного інституту та Інституту землеробства УААН. Використовували також активний і неактивний штами повільнорослих бульбочкових бактерій та Tn5-мутант Bradyrhizobium japonicum. В якості активного було обрано штам 634б із музейної колекції азотфіксуючих мікроорганізмів інституту фізіології рослин і генетики НАН України, а неактивного - штам 604к, люб'язно наданий співробітником Кримського філіалу Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН к.б.н. М.З. Толкачовим. Tn5-мутант штаму 646 (Т66) отримано у відділі симбіотичної азотфіксації інституту фізіології рослин і генетики НАН України к.б.н. С.М. Маліченко. У роботі застосовували лектин насіння сої (SBA) і лектин насіння гороху (PSL), придбані в НВК “Лектинотест” (Львів, Україна), а також альбумін людини (Reanal, Будапешт, Угорщина).

Вегетаційні та мікровегетаційні дослідження проводили в умовах модельних дослідів на вегетаційному майданчику Інституту фізіології рослин і генетики НАН України при вологості субстрату 60% і природному освітленні. Рослини вирощували по 6 штук в 15-кілограмових посудинах Вагнера і пластикових посудинах на 0,7 кг піску, які стерилізували 20%-ним розчином Н₂О₂. В якості субстрату використовували промитий річковий пісок збагачений поживною сумішшю Гельрігеля, що містила 0,1, 0,25 або 1,0 норму азоту (1 норма відповідає 708 мг Са(NO₃)₂ Ч 4Н₂О на 1 кг піску). Перед посівом насіння стерилізували 70%-ним етанолом. У залежності від схеми досліду насіння сої інокулювали спеціально приготовленою суспензією відповідних штамів B. japonicum, проінкубованою із лектином насіння сої, гороху або альбуміном людини. Контролем слугували рослини, інокульовані бактеріальними суспензіями, що не містили цих білків.

Польові досліди проводили в умовах Черкаської (грунти темно-сірі, опідзолені, рН 5,4-5,7, вміст гумусу 1,6-2,0%) та Київської (грунти сірі лісові, супіщані, рН 5,9-6,0, вміст гумусу 1,2-1,5%) областей. Облікова площа дослідних ділянок 5 м², розміщення - рендомізоване. Сою висівали із розрахунку 600 тис. схожих насінин/га. Для інокуляції насіння використовували бактеріальні препарати, модифіковані гомологічним лектином. фотосинтез соя лектин симбіотичний

Азотфіксуючу (нітрогеназну) активність бульбочок визначали ацетиленовим методом [Hardy et al., 1968; Старченков и др., 1984; Крикунець, 1993] за рівнем їхньої ацетиленвідновлювальної активності. Для виділення із рослинного матеріалу фітогемаглютинінів використовували метод елюювання етанолом [Rigas, Osgood, 1955; Маличенко и др., 1994], модифікований нами. Лектинову активність отриманих зразків визначали за допомогою реакції гемаглютинації (РГА) [Луцик и др., 1981]. Визначення вмісту хлорофілів здійснювали за методикою Велбурна [Wellburn, 1994]. Інтенсивність фотосинтезу визначали у контрольованих умовах за допомогою пристрою, змонтованого на базі оптико-акустичного інфрачервоного газоаналізатора ГИАМ-5М (Росія), увімкненого за диференціальною схемою. Розрахунок параметрів газообміну виконували за загальноприйнятою методикою [Мокроносов, Ковалев, 1989]. Життєздатність і кількісну оцінку інтенсивності росту (розмноження) бульбочкових бактерій проводили за загальноприйнятими методами [Фробишер, 1965]. Всі результати обробляли статистично [Доспехов, 1985], у таблицях і на рисунках подано середні арифметичні та їхні стандартні похибки.

Ефективність симбіотичної системи соя - bradyrhizobium japonicum за дії екзогенних білків при різному забезпеченнi мінеральним азотом

Встановлено, що при поступовому збільшенні концентрації азоту в середовищі вирощування рослин, інокульованих активним штамом B. japonicum 634б, азотфіксуюча активність бульбочок закономірно знижується. Лектин сої у концентрації 20 мкг/мл бактеріальної суспензії стимулює азотфіксуючу активність бульбочок, утворених активним штамом 634б, однак при зростанні азотного фону здатність цього білка підсилювати роботу симбіотичного апарату обмежується кількістю мінерального азоту в субстраті (табл. 1).

Таким чином, збільшення дози мінерального азоту в середовищі вирощування рослин негативно впливає на формування і функціонування симбіотичного апарату, а також лімітує стимулюючу дію екзогенного гомологічного лектину на симбіотичні властивості бульбочкових бактерій.

Азотфіксуюча активність симбіотичних систем, утворених неактивним штамом B. japonicum 604к, була на три порядки нижчою, ніж при використанні активного штаму. При цьому чіткої закономірності у зміні рівня азотфіксації в залежності від доз внесеного мінерального азоту, на відміну від рослин, інокульованих активним штамом 634б, не виявлено. За попередньої ж інкубації неактивного штаму 604к із гомологічним лектином відмічено тенденцію до пригнічення і без того досить низької азотфіксуючої активності бульбочок. Отже, нами вперше виявлено неоднозначну реакцію симбіотичних систем сої, утворених за участю активного і неактивного штамів бульбочкових бактерій, на дію гомологічного лектину.

При вирощуванні рослин із внесенням у субстрат “стартової” дози азоту (0,25 норми) встановлено, що на інтенсивність азотфіксації бульбочками активного штаму 634б позитивно впливало не тільки внесення в інокуляційну суспензію гомологічного лектину, а і внесення альбуміну людини в тій же концентрації (20 мкг/мл).

Таблиця 1 Вплив попередньої інкубації B. japonicum із гомологічним лектином на азотфіксуючу активність (мкмольС₂Н₄/(рослину·год) бульбочок сої за різного забезпечення мінеральним азотом

Варіант	Норма азоту	Фаза розвитку
		Бутонізація	Цвітіння	Плодоутворення
Активний штам 634б (контроль)	0,1	2,06 ± 0,19	13,03 ± 0,27	14,89 ± 1,06
	0,25	1,22 ± 0,12	10,19 ± 0,74	11,42 ± 1,00
	1,0	0,16 ± 0,01	0,72 ±0,05	2,00 ± 0,25
Активний штам 634б + лектин	0,1	2,47 ± 0,14	18,47 ± 0,54	18,48 ± 1,84
	0,25	1,23 ± 0,11	14,02 ± 1,22	14,18 ± 1,08
	1,0	0,22 ± 0,02	0,74 ± 0,04	1,41 ± 0,19
Неактивний штам 604к (контроль)	0,1	0,005 ± 0,0005	0,006 ± 0,0004	0,003 ± 0,0002
	0,25	0,005 ± 0,0005	0,004 ± 0,0004	0,007 ± 0,0007
	1,0	0,004 ± 0,0004	0,005 ±0,0002	0,005 ± 0,0003
Неактивний штам 604к + лектин	0,1	0,003 ± 0,0003	0,005 ± 0,0003	0,003 ± 0,0003
	0,25	0,004 ± 0,0002	0,004 ± 0,0000	0,004 ± 0,0003
	1,0	0,004 ± 0,0002	0,005 ± 0,0002	0,004 ± 0,0004

Так, у фазу цвітіння їхня нітрогеназна активність порівняно до контролю достовірно збільшилася на 79,8 та 24,1% відповідно. Iнкубація ризобій з гетерологічним лектином гороху суттєво не впливала на азотфіксацію. Обробка ж ризобій штаму 604к різними білками не впливала або призводила до пригнічення і без того достатньо низької азотфіксуючої активності бульбочок (табл. 2).

Отримані дані свідчать про специфічність модулюючого впливу лектинів за відношеням до штамів бульбочкових бактерій різної активності. Отже, лектини бобових є одним із факторів формування ефективного симбіозу, який необхідно враховувати при розробці нових підходів для керування продукційним процесом у бобових рослин. Одержані дані вказують також на перспективність використання сумісної інкубації ризобій і білків нерослинного походження з метою підвищення продуктивності симбіотичних систем бобових.

Таблиця 2 Азотфіксуюча активність бульбочок сої (мкмольС₂Н₄/(рослину·год) за інокуляції штамами B. japonicum після попередньої інкубації із різними білками

Білок	Фаза розвитку
	Бутонізація	Цвітіння	Плодоутворення
Активний штам 634б
Контроль (без білка)	3,04 ± 0,30	19,27 ± 0,72	9,23 ± 0,63
Лектин сої	3,43 ± 0,34	34,64 ± 1,35	16,73 ± 1,48
Лектин гороху	3,83 ± 0,37	23,25 ± 1,60	11,23 ± 1,11
Альбумін людини	2,72 ± 0,23	23,91 ± 0,96	13,56 ± 1,39
Неактивний штам 604к
Контроль (без білка)	0,020 ± 0,0021	0,016 ± 0,0011	0,019 ± 0,0002
Лектин сої	0,014 ± 0,0011	0,010 ± 0,0008	0,017 ± 0,0007
Лектин гороху	0,018 ± 0,0010	0,007 ± 0,0006	0,008 ± 0,0001
Альбумін людини	0,017 ± 0,0017	0,011 ± 0,0010	0,011 ± 0,0009

Лектинова активність різних органів сої за умов ефективного і неефективного симбіозу

Активність лектинів органів сої на різних етапах її життєвого циклу. Встановлено, що гемаглютинуюча активність білків, виділених із коренів рослин, інокульованих активним штамом B. japonicum 634б, у варіантах із внесенням 0,1 і 0,25 норми азоту не змінювалася протягом усього періоду дослідження. Лектинова активність коренів рослин, інокульованих неактивним штамом, залежала від кількості мінерального азоту в субстраті і зменшувалась в процесі вегетації рослин за винятком варіанта із повною нормою азоту (табл. 3).

Гемаглютинуюча активність білкових екстрактів, виділених із листків за інокуляції рослин сої активним штамом B. japonicum 634б, збільшувалася в онтогенезі. Максимальні значення цього показника зафіксовані у варіантах із внесенням 0,1 і 0,25 норми азоту, де також спостерігався найвищий рівень азотфіксуючої активності бульбочок. У листках рослин, інокульованих неактивним штамом 604к, максимальні значення лектинової активності було зафіксовано у фазу бутонізації, проте у наступних фазах активність лектину зменшувалася і була значно нижчою ніж у рослин при ефективному симбіозі. Деякі дослідники припускають участь білків із лектиновою активністю у процесах фотосинтезу [Фалькович и др., 1997; Алексидзе и др., 2002; Doltchinkova, Lambreva, 2002].

Лектинова активність білкових екстрактів, виділених із бутонів і квіток рослин, інокульованих як активним, так і неактивним штамом, коливалася у межах 2-8 одиниць аглютинації (ОА). Гемаглютинуюча активність екстрактів із бобів у різних варіантах залишалася на одному рівні за винятком рослин, які вирощували на повній нормі азоту. Нами також встановлено, що внесення у бактеріальну суспензію перед інокуляцією гомологічного лектину не призводить до суттєвої зміни лектинової активності білків, виділених із різних органів сої.

Таблиця 3 Лектинова активність (ОА/50 мкл) органів сої за інокуляції штамами B. japonicum при різному забезпеченні мінеральним азотом

Варіант	Норма азоту	Фаза розвитку
		Бутонізація	Цвітіння	Плодоутворення
		корені	листки	бутони	корені	листки	квітки	корені	листки	боби
Активний штам 634б	0,1	2	8	4	2	64	8	2	128	8
	0,25	2	8	2	2	64	4	2	64	8
	1,0	0	8	2	2	32	4	0	32	4
Активний штам 634б + лектин	0,1	2	8	2	2	64	4	0	128	8
	0,25	2	8	4	2	64	4	0	128	8
	1,0	0	8	4	2	32	4	0	64	8
Неактивний штам 604к	0,1	8	16	8	4	16	8	4	8	8
	0,25	8	32	4	2	16	4	2	8	8
	1,0	0	64	2	0	32	4	2	16	2
Неактивний штам 604к + лектин	0,1	8	16	8	2	16	8	2	8	8
	0,25	8	32	4	2	16	4	2	8	8
	1,0	2	64	4	2	32	4	2	16	2

Примітка. Тут і в інших таблицях та рисунках ОА - одиниці аглютинації.

Таким чином, білки із лектиновою активністю виявлено у вегетативних і генеративних органах рослин сої на важливих етапах її життєвого циклу. Рівень активності цих білків коливається залежно від фази розвитку рослинного організму і може залежати від активності штаму-інокулянта, а також кількості мінерального азоту в середовищі вирощування рослин.

Азотфіксуюча активність бульбочок і її зв'язок із лектиновою активністю виділених із них білкових екстрактів. Як азотфіксуюча, так і лектинова активність бульбочок, утворених активним штамом 634б, знаходилися в оберненій залежності від кількості мінерального азоту, внесеного в субстрат. Дослідження симбіотичих систем, створених за участю активного штаму, показало також, що збільшення азотфіксуючої активності бульбочок в онтогенезі, включно до 61-ої доби після сходів, супроводжувалося підвищенням їхньої лектинової активності. У той же час показники лектинової активності бульбочок, індукованих неактивним штамом 604к, на фоні незначної азотфіксації в усіх фазах, навпаки, мали тенденцію до зниження в онтогенезі (табл. 4).

Аналіз динаміки азотфіксації і лектинової активності бульбочок, утворених за інокуляції штамами різної активності (рис. 1), підтвердив висунуте нами раніше припущення про існування взаємозв'язку між цими показниками в онтогенезі. У варіантах, де рослини вирощували на стартовій нормі азоту, ці показники змінювалися майже паралельно, незалежно від того, чи проводили попередню інкубацію ризобій з гомологічним лектином.

Таблиця 4 Зміна азотфіксуючої (АФ) і лектинової (ЛА) активності бульбочок сої, утворених за інокуляції штамами B. japonicum різної активності, на фоні зростаючих доз мінерального азоту

Норма азоту	Фаза розвитку
	Бутонізація, 40 доба	Цвітіння, 50 доба	Плодоутворення, 61 доба
	АФ, мкмоль С2Н4/ (рослину·год)	ЛА, ОА/50 мкл	АФ, мкмоль С2Н4/ (рослину·год)	ЛА, ОА/50 мкл	АФ, мкмоль С2Н4/ (рослину·год)	ЛА, ОА/50 мкл
Активний штам 634б
0,1	2,065±0,193	8	13,031±0,274	16	14,895±1,060	64
0,25	1,216±0,118	4	10,194±0,741	8	11,416±1,000	32
1,0	0,159±0,011	2	0,719±0,050	4	1,996±0,247	32
Неактивний штам 604к
0,1	0,005±0,0005	16	0,006±0,0004	8	0,003±0,0002	4
0,25	0,005±0,0005	8	0,004±0,0004	8	0,007±0,0007	4
1,0	0,004±0,0004	4	0,005±0,0002	8	0,005±0,0003	4

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Азотфіксуюча (мкмоль С₂Н₄/(рослину·год) і лектинова активність (ОА/50 мкл) бульбочок сої, інокульованої бактеріями B. japonicum різної активності. А - без інкубації з гомологічним лектином, Б - після попередньої інкубації з гомологічним лектином.

Викладені результати вказують на існування взаємозв'язку між азотфіксуючою активністю бульбочок і лектиновою активністю виділених із них білкових екстрактів, що дозволяє нам говорити про участь лектинів у процесах симбіотичної азотфіксації.

Залежність інтенсивності фотосинтезу і лектинової активності листків сої від активності її симбіотичного апарату

Максимальна інтенсивність фотосинтезу листків сої у фазу цвітіння була відмічена за інокуляції активним штамом B. japonicum 634б. Зі збільшенням дози мінерального азоту в субстраті інтенсивність фотосинтезу знижувалась у варіантах із інокуляцією активним штамом 634б і, навпаки, збільшувалась за інокуляції неактивним штамом 604к (рис. 2). При внесенні в суспензії цих двох штамів лектину сої їх вплив також був протилежним: у випадку використання штаму 634б ефект від інкубації мав виражену тенденцію до посилення фотосинтезу листків сої за різних рівнів живлення мінеральним азотом, тоді як при використанні штаму 604к - до його зниження.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Інтенсивність фотосинтезу листків сої, вирощеної на субстраті з різним вмістом мінерального азоту, інокульованої штамами ризобій різної активності після попередньої інкубації з гомологічним лектином: 1 - рослини, вирощені на 0,1 норми азоту, інокульовані ризобіями без попередньої інкубації з лектином; 2 - те ж саме із 0,25 норми азоту; 3 - те ж саме із 1,0 нормою азоту; 4 - рослини, вирощені на 0,1 норми азоту, інокульовані ризобіями після попередньої інкубації з лектином; 5 - те ж саме із 0,25 норми азоту; 6 - те ж саме із 1,0 нормою азоту. Стовпчики без штриховки - інокуляція активним штамом 634б, заштриховані - неактивним штамом 604к.

У варіантах із повною нормою азоту показники інтенсивності фотосинтезу майже не залежали від активності штаму ризобій чи його інкубації з лектином і були на відносно високому рівні (див. рис. 2, варіанти 3 і 6).

Таким чином, рівень інтенсивності фотосинтезу загалом визначається забезпеченістю рослин азотом, оскільки більша частина азотовмісних сполук листків представлена фотосинтетичними пігментами і білками [Мокроносов, Ковалев, 1989].

Проте, рівень активності фотосинтетичного апарату також тісно пов'язаний із ефективністю симбіозу, основною із характеристик якого є азотфіксуюча активність. Так, у рослин, вирощених на субстраті з повною нормою азоту, за інокуляції активним штамом 634б інтенсивність фотосинтезу була найменшою серед варіантів із інокуляцією активним штамом і навіть трохи нижчою за таку у рослин, інокульованих неактивним штамом (див. рис. 2, варіант 3).

Отже, ефективна робота симбіотичного апарату в більшій мірі стимулює інтенсивність фотосинтезу листків сої ніж внесення в субстрат вирощування рослин повної норми мінерального азоту. Отримані дані свідчать про наявність не лише трофічних, але й регуляторних взаємозв'язків між процесом азотфіксації і фотосинтезом.

Підтвердженням цього також є тісний зв'язок між інтенсивністю фотосинтезу листків і азотфіксуючою активністю бульбочок за інокуляції рослин активним штамом 634б (рис. 3). При цьому точки, які відповідають варіантам із повною нормою азоту, знаходяться у нижній частині графіка. Можна припустити, що одним із складників цього ефекту, крім азотного живлення, була активація роботи фотосинтетичного апарату підвищеним запитом на асиміляти з боку ефективних бульбочок [Киризий, 2005]. Варіанти з неактивним штамом у даному випадку не розглядалися, оскільки азотфіксуюча активність у них була незначною, а інтенсивність фотосинтезу, як було показано вище, цілком залежала від забезпеченості рослин мінеральним азотом.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Зв'язок між інтенсивністю фотосинтезу й азотфіксуючою активністю бульбочок (суцільна лінія), а також лектиновою активністю листків (пунктирна лінія) у фазу цвітіння.

Сірим залито символи, що відповідають варіантам із інокуляцією активним штамом, проінкубованим із лектином насіння сої.

R² - величина достовірності апроксимації.

Гемаглютинуюча активність сумарної фракції білків, виділених із листкових пластинок сої всіх варіантів, також знаходилась у тісному зв'язку зі швидкістю асиміляції СО₂ (див. рис. 3). Очевидно, лектинова активність білків у листках визначається активністю фотосинтетичного апарату, яка в свою чергу залежить від забезпечення рослин зв'язаним азотом. При цьому походження азоту - мінеральний чи біологічний - має вторинне значення.

Таким чином, зміна показників інтенсивності фотосинтезу за умов різного забезпечення рослин сої мінеральним і біологічним азотом супроводжується зміною гемаглютинуючої активностi бiлкiв у листках, що свiдчить про участь лектинiв у забезпеченні функцiонування не лише асимiляцiйної системи бульбочок, але й фотосинтетичного апарату.

Ефективність біопрепаратів бульбочкових бактерій сої, модифікованих гомологічним лектином

Відомо, що інтегральним показником впливу різних факторів на життєдіяльність рослин (у нашому випадку препаратів бульбочкових бактерій, модифікованих гомологічним лектином) є їхня продуктивність.

Як свідчать дані польових дослідів (табл. 5), препарати, що містять лектин, здатні забезпечувати достовірну прибавку урожаю, що вказує на перспективність їхнього використання з метою підвищення продуктивності симбіозу. Нами також встановлено, що концентрація гомологічного лектину 100 мкг/мл бактеріальної суспензії є оптимальною у фізіологічному і економічному відношенні дозою при виготовленні ризобіальних препаратів.

Таблиця 5 Урожай насіння сої (ц/га) при застосуванні біопрепаратів бульбочкових бактерій на твердому носії, модифікованих гомологiчним лектином (польові випробування)

Концентрація лектину, мкг/мл бактеріальної суспензії	Урожай	Приріст урожаю
	I	II	III	Середнє із трьох дослідів	ц/га	%
0	36,2 ± 0,7	33,1 ± 1,8	22,5 ± 0,7	30,6 ± 1,1	--	--
100	45,1 ± 1,4	41,2 ± 0,8	25,8 ± 1,1	37,4 ± 1,1	6,8	22,2
300	41,9 ± 1,5	38,8 ± 2,0	27,3 ± 1,0	36,0 ± 1,5	5,4	17,6
НCР 0,05	4,2	5,1	2,5

Примітка. I, II -- 2005 р., III -- 2006 р.

Розрахунок економічної доцільності застосування бактеріальних препаратів, модифікованих гомологічним лектином, показав, що при виробництві зерна сої в умовах Лісостепу України на 1 гривню витрат можна отримати приблизно 0,4 гривні чистого прибутку.

Висновки

1. Лектини рослин відіграють важливу роль не тільки на початкових етапах формування симбіозу з бульбочковими бактеріями, але й при його функціонуванні: активність цих білків тісно пов'язана з функціональною специфікою органу їх локалізації і ефективністю симбіотичної системи.

2. Рівень гемаглютинуючої активності лектинів, що містяться у бульбочках, а також інших вегетативних і генеративних органах сої, коливається в залежності від фази розвитку рослин, забезпечення їх мінеральним азотом та активності штаму-інокулянта.

3. В умовах ефективної взаємодії макро- і мікросимбіонтів встановлено прямий зв'язок між азотфіксацією бульбочок сої і лектиновою активністю виділених із них білків, що вказує на важливу роль гемаглютинуючих бiлкiв у функціонуванні симбіотичного апарату. За неефективного симбіозу незначний рівень азотфіксації супроводжується низькою або такою, що знижується в онтогенезі, лектиновою активністю в бульбочках.

4. Вперше показано, що зміна показників інтенсивності фотосинтезу за умов різного забезпечення рослин сої мінеральним і біологічним азотом супроводжується зміною гемаглютинуючої активності білків у листках.

5. Ефективна робота симбіотичного апарату в більшій мірі стимулює інтенсивність фотосинтезу листків сої ніж внесення в субстрат вирощування рослин повної норми мінерального азоту, що свідчить про існування не лише трофічних, але й регуляторних взаємозв'язків між азотфіксацією і фотосинтезом.

6. Вперше встановлено, що інкубація бульбочкових бактерій з гомологічним лектином позитивно впливає на симбіотичні властивості активного штаму Bradyrhizobium japonicum 634б, а також інтенсивність основних фізіологічних процесів рослини - азотфіксації та фотосинтезу і, навпаки, виявляє супресорну дію на симбіотичні системи, утворені за участю неактивного штаму ризобій B. japonicum 604к.

7. Збільшення дози мінерального азоту в середовищі вирощування рослин лімітує стимулюючу дію рослинного лектину на симбіотичні властивості бульбочкових бактерій і ефективність симбіозу.

8. Вперше встановлено, що ефект попередньої інкубації бульбочкових бактерій з альбуміном людини за своїм характером подібний до впливу гомологічного лектину на показники ефективності симбіозу. Отримані дані вказують на перспективність використання сумісної інкубації ризобій з білками нерослинного походження для підвищення продуктивності симбіотичних систем бобових.

9. Встановлено, що застосування бактеріальних препаратів, модифікованих рослинним лектином, підвищує ефективність симбіотичної системи сої і збільшує її продуктивність у середньому на 17-22%. При цьому концентрація гомологічного лектину 100 мкг/мл бактеріальної суспензії є дозою, оптимальною у фізіологічному та економічному відношенні.

Рекомендації

На основі результатів досліджень рекомендується застосування бактеріальних препаратів, модифікованих рослинним лектином, для інокуляції насіння з метою створення високоефективних симбіотичних систем, підвищення продуктивності симбіозу та рентабельності виробництва зерна сої.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М. Эффективность симбиотической системы соя - Bradyrhizobium japonicum при действии гомологичного лектина в условиях различного обеспечения минеральным азотом // Физиология и биохимия культ. растений. - 2005. - Т. 37, № 5. - С. 394-401.

2. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М., Киризий Д.А. Взаимосвязь интенсивности фотосинтеза и лектиновой активности листьев сои при инокуляции модифицированными лектином ризобиями // Доповіді НАН України. - 2005. ? № 12. - С. 167-172.

3. Сытников Д.М., Маличенко С.М., Якимчук Р.А., Мосендз Г.Н. Влияние концентрации лектина и продолжительности инкубирования инокуляционной суспензии ризобий на рост, нитрогеназную активность и продуктивность сои // Физиология и биохимия культ. растений. - 2006. - Т. 38, № 4. - С. 310-316.

4. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М., Киризий Д.А. Интенсивность фотосинтеза и лектиновая активность листьев сои при инокуляции ризобиями совместно с гомологичным лектином // Физиология растений. - 2006. - Т. 53, № 2. - С. 189-195.

5. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М. Лектиновая активность различных органов сои в условиях эффективного и неэффективного симбиоза // Физиология и биохимия культ. растений. - 2006. - Т. 38, № 1. - С. 53-60.

6. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М., Киризий Д.А. Интенсивность фотосинтеза и лектиновая активность листьев сои в условиях эффективного и неэффективного симбиоза // Актуальні проблеми фізіології, генетики та біотехнології рослин і мікроорганізмів: Тези доп. IX конференції молодих учених, присвяченої 100-річчю від дня народження П.А. Власюка (Київ, 24-25 лютого 2005 р.). - Київ: Логос, 2005. - С. 36.

7. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М. Формирование лектиновой активности сои в зависимости от эффективности штамма-инокулянта // Современные проблемы физиологии и интродукции растений: Материалы Всеукраинской научно-практической конференции к 90-летию со дня рождения О.Ф. Михайлова. (Днепропетровск, 5-6 апреля, 2005 г.). - Днепропетровск: ДНУ, 2005. - С. 50-51.

8. Сытников Д.М., Маличенко С.М., Даценко В.К. Эффективность симбиотической системы сои на различном азотном фоне при совместной обработке Bradyrhizobium japonicum и лектином // Проблеми збереження, відновлення та збагачення біорізноманітності в умовах антропогенно зміненого середовища: Матеріали міжнародної наукової конференції (Кривий Ріг, 16-19 травня 2005 р.). - Дніпропетровськ: Проспект, 2005. - С. 490-491.

9. Сытников Д.М., Даценко В.К., Коць С.Я. Эффективность биопрепаратов клубеньковых бактерий сои при использовании гомологичного лектина // Современные проблемы экологии: Материалы Первой международной конференции молодых ученых (28-30 сентября 2005 г.). - Запорожье: ЗНУ, 2005. - С. 131-132.

10. Сытников Д.М., Якимчук Р.А. Влияние продолжительности инкубации и концентрации лектина в инокуляционной суспензии на развитие проростков сои // Сучасні проблеми фізіології рослин і біотехнології: Тези наукової конференції молодих учених (Ужгород, 1-3 грудня 2005 р.). - Ужгород, 2005. - С. 115-116.

11. Сытников Д.М., Коць С.Я., Маличенко С.М. Лектиновая активность органов Glycine max (L.) Merrill на различных этапах жизненного цикла // Матеріали XII з'їзду Українського ботанічного товариства. Ред. кол.: Ситник К.М. (відп. ред.) та ін. - Одеса: Альянс-Юг, 2006. - С. 497-499.

12. Сытников Д.М., Маличенко С.М., Коць С.Я. Взаимосвязь азотфиксирующей и лектиновой активности клубеньков сои, инокулированной активным и неактивным штаммами ризобий // Биология - наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию ПНЦ РАН (Пущино, 17-21 апреля 2006 г.). Сб. тезисов. - Пущино, 2006. - С. 94.

13. Sytnikov D.M., Kots S.Ya., Malichenko S.M. Influence of lectin on the efficiency of symbiotic system soybean - Bradyrhizobium japonicum under different mineral nitrogen supply // XVII International Botanical Congress, Vienna, Austria, Europe, July 17-23, 2005: Abstracts. - Vienna, 2005. - P. 258.

14. Sytnikov D.M., Malichenko S.M., Kots S.Ya. Influence of symbiosis efficiency on lectin activity different organs of soybean // Регуляция роста, развития и продуктивности растений: Материалы IV Международной научной конференции (Минск, 26-28 октября 2005 г.). - Минск: Право и экономика, 2005. - С. 213.

Анотація

Ситніков Д.М. Взаємозв'язок азотфіксації і лектинової активності симбіотичної системи сої за різних рівнів її ефективності. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. - інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2007.

Дисертація присвячена дослідженню зв'язку між інтенсивністю азотфіксації і лектиновою активністю окремих органів сої за різних рівнів ефективності симбіотичного апарату, а також ролі лектинів у процесі становлення і функціонування бобово-ризобіального симбіозу. Вивчено можливість практичного застосування лектинів як біологічно активних речовин при розробці нових підходів до керування продукційним процесом у бобових.

Встановлено, що в умовах ефективної взаємодії макро- і мікросимбіонтів існує прямий зв'язок між азотфіксацією бульбочок сої і лектиновою активністю виділених із них білків, що вказує на важливу роль гемаглютинуючих білків у функціонуванні симбіотичного апарату. За неефективного симбіозу незначному рівню азотфіксації відповідає низька або така, що знижується в онтогенезі, лектинова активність у бульбочках. Вперше показано, що зміна показників інтенсивності фотосинтезу за умов різного забезпечення рослин сої мінеральним і біологічним азотом супроводжується зміною гемаглютинуючої активності білків у листках. Вперше встановлено, що інкубація бульбочкових бактерій з гомологічним лектином позитивно впливає на симбіотичні властивості активного штаму Bradyrhizobium japonicum 634б, а також фізіологічний стан рослини-хазяїна і, навпаки, виявляє супресорну дію на симбіотичні системи, утворені за участю неактивного штаму ризобій B. japonicum 604к. Вперше показано, що стимулюючий вплив гомологічного лектину на симбіотичні властивості ризобій і ефективність симбіозу обмежується кількістю мінерального азоту в середовищі вирощування рослин. Доведено можливість використання бактеріальних препаратів, модифікованих гомологічним лектином, та економічну доцільність їх практичного застосування.

Ключові слова: Glycine max, Bradyrhizobium japonicum, симбіотична азотфіксація, лектинова активність, інтенсивність фотосинтезу, гомологічний лектин, мінеральний азот, бактеріальні препарати.

Аннотация

Сытников Д.М. Взаимосвязь азотфиксации и лектиновой активности симбиотической системы сои при различных уровнях ее эффективности. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, Киев, 2007.

Диссертация посвящена исследованию связи между интенсивностью азотфиксации и лектиновой активностью отдельных органов сои при различных уровнях эффективности симбиотического аппарата, а также роли лектинов в процессе становления и функционирования бобово-ризобиального симбиоза. Изучена возможность практического применения лектинов как биологически активных веществ при разработке новых подходов к управлению продукционным процессом у бобовых.

Показано, что уровень гемагглютинирующей активности лектинов, содержащихся в клубеньках, а также других вегетативных и генеративных органах сои, колеблется в зависимости от фазы развития растений, обеспечения их минеральным азотом и активности штамма-инокулянта.

Установлена прямая связь между азотфиксацией клубеньков сои и лектиновой активностью выделенных из них белков в условиях эффективного взаимодействия макро- и микросимбионтов, что указывает на важную роль гемагглютинирующих белков в функционировании симбиотического аппарата. Установлено также, что при неэффективном симбиозе незначительный уровень азотфиксации сопряжен с низкой или снижающейся в онтогенезе лектиновой активностью в клубеньках. Впервые показано, что изменение показателей интенсивности фотосинтеза в условиях различного обеспечения растений минеральным и биологическим азотом сопровождается изменением гемагглютинирующей активности белков в листьях.

Обнаружено, что эффективная работа симбиотического аппарата в большей степени стимулирует интенсивность фотосинтеза листьев сои, чем внесение в субстрат выращивания растений полной нормы минерального азота. Полученные данные свидетельствуют о существовании не только трофических, но и регуляторных взаимосвязей между азотфиксацией и фотосинтезом.

Впервые установлено, что инкубация клубеньковых бактерий с гомологичным лектином положительно влияет на симбиотические свойства активного штамма Bradyrhizobium japonicum 634б, а также интенсивность основных физиологических процессов растения - азотфиксации и фотосинтеза и, напротив, оказывает супрессорное действие на симбиотические системы, образованные с участием неактивного штамма ризобий B. japonicum 604к.

Впервые показано, что увеличение дозы минерального азота в среде выращивания растений лимитирует стимулирующее действие гомологичного лектина на симбиотические свойства клубеньковых бактерий и эффективность симбиоза.

Впервые установлено, что эффект предынкубации клубеньковых бактерий с альбумином человека по своему характеру сходен с влиянием гомологичного лектина на показатели эффективности симбиоза. Полученные данные указывают на перспективность использования совместной инкубации ризобий с белками нерастительного происхождения для повышения продуктивности симбиотических систем бобовых.

Доказана возможность использования бактериальних препаратов, модифицированных гомологичным лектином, и экономическая целесообразность их применения.

Результаты работы расширяют представление о роли лектинов в растении, в частности при функционировании симбиотической системы и могут служить основой для разработки новых критериев оценки эффективности симбиоза. Кроме того, полученные данные указывают на перспективность применения бактериальных препаратов, модифицированных гомологичным лектином, и могут быть использованы для усовершенствования технологии их производства.

Ключевые слова: Glycine max, Bradyrhizobium japonicum, симбиотическая азотфиксация, лектиновая активность, интенсивность фотосинтеза, гомологичный лектин, минеральный азот, бактериальные препараты.

Abstract

Sytnikov D.M. Interrelation of nitrogen-fixation and lectin activity of soybean symbiotic system under different efficiency level. - Manuscript.

Dissertation for the candidate of biology sciences (Ph. D.) degree in speciality 03.00.12 - plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2007.

The dissertation covers with investigation of the relationship between nitrogen-fixing and lectin activity of particular soybean organs under different levels of symbiotic apparatus efficiency, as well as the role of lectins in legume-rhizobial symbiosis formation and functioning. The possibility of practical use of lectins as bioactive substances upon developing of alternative approaches to legumes' productivity control is studied.

The relationship between nitrogen- fixation of nodules and lectin activity of proteins isolated from the nodules was established under the efficient interaction conditions of rhizobia and plant. Furthermore under non-efficient symbiosis the slight nitrogen- fixation was accompanied with the low or decreasing lectin activity of nodule. For the first time it was shown that the changes of photosynthesis rate of soybean plants under the different supply of mineral and biological nitrogen are accompanied by the changes of gemagglutinin activity in leaves. It was also established that incubation of nodule bacteria with homologous lectin had positive effect on symbiotic properties of active-strain Bradyrhizobium japonicum 634b and physiological state of plant-host. On the contrary, homologous lectin suppresses symbiotic systems formed by non-active strain B. japonicum 604k. It was established for the first time that the stimulating effect of homologous lectin on rhizobia's symbiotic properties and symbiotic efficiency is limited by the level of mineral nitrogen in substrate. The possibility of using bacterial preparations enhanced by homologous lectin and economic expediency of their practical use are demonstrated.

Key words: Glycine max, Bradyrhizobium japonicum, symbiotic nitrogen-fixation, lectin activity, photosynthetic rate, homologous lectin, mineral nitrogen, bacterial preparations.

Размещено на Allbest.ru

...