Розробка технології інтерферонів І типу з використанням конструкційно оформленої індукторної системи багаторазової дії

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Технології отримання препаратів інтерферону (ІФН) І типу природного походження, прийняті на вітчизняних фармацевтичних підприємствах, передбачають використання в якості індукторів деяких вірусів, умовно патогенних для людини - вірусу Сендай, вірусу хвороби Ньюкасла тощо. Використання вірусів робить процес отримання ІФН досить небезпечним як для працівників, так і для довкілля в цілому. Тому в даному випадку виникає необхідність знезараження вірусу та додаткова очистка кінцевого препарату, що призводить до значних втрат активності ІФН і збільшення його собівартості. Очевидна і неможливість повторного використання індуктору. Внаслідок перелічених факторів існує нагальна необхідність розробки принципово нової технології отримання препаратів ІФН І типу, що дозволила б суттєво знизити вартість кінцевого продукту, спростити процес його отримання, а також забезпечити багаторазове використання індуктору, позбавити при цьому ризику вірусного зараження виробничий персонал, а також запобігти вірусної контамінації отриманого препарату.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є розробка нової технології отримання препаратів ІФН І типу з використанням комплексної індукторної системи дріжджова РНК-гідрохлорид тилорону, іммобілізованої на нерозчинному носії. Для досягнення заданої мети були поставленні такі завдання:

Сконструювати штучні конструкції для здійснення процесу індукції ІФН І типу (б/в-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону;

Дослідно визначити кількісні та часові параметри синтезу ІФН клітинами-продуцентами під дією контактів з гранулами іммобілізованого молекулярного комплексу (ІММК) в середовищі культивування;

Розробити та конструювати установку для одержання ІФН в умовах in vitro з використанням моношарових та суспензійних клітинних культур, індукованого за допомогою ІММК;

Експериментально оцінити ефективність інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК за різних технологічних умов, оптимізація параметрів біосинтезу ІФН в дослідній установці, як прототипі промислової апаратури, з застосуванням ІММК як інтерфероногену.

1. Огляд літератури

Наведена загальна характеристика інтерферонів, здійснений детальний аналіз структурно-функціональних властивостей відомих індукторів інтерферонів І типу за критеріями функціональної активності та технологічності, а також викладені відомості щодо клітин-продуцентів ІФН, їх культивування в промислових умовах. Окремо розглянуті питання апаратурного оформлення біосинтезу біологічно-активних сполук культурами клітин in vitro та принципи дії обладнання, що при цьому використовується.

2. Матеріали та методи досліджень

Наведено характеристику об'єктів, опис апаратури та методів, якими користувалися при виконанні дисертаційної роботи.

В роботі досліджувалися об`єкти двох типів: біотичні - клітини-продуценти ІФН І типу, та абіотичні - системи культивування i складові процесу інтерфероногенезу. В якості індукторів ІФН І типу використовувались інтерфероногенні молекулярні комплекси, у яких полінуклеотидна складова ковалентно з'єднувалася з гранулярним нерозчинним носієм (ІММК). Компонентами ІММК слугували дріжджова РНК (НПО “Біохімреактив“, Олайна, Латвія) та гідрохлорид тилорону (“Sigma”, США). Індукторами порівняння в дослідах слугували вільні молекулярні комплекси дріжджова РНК-тилорон (МК), вільний гідрохлорид тилорону, а також як вільні, так і іммобілізовані на тих же гранулярних носіях ридостин (дволанцюгова РНК (длРНК) дріжджів S. cerevisiae, НПО “Вектор”, Росія) та poly(I)-poly(C) (“Calbiochem”, США). Як нерозчинні гранулярні носії для ковалентного зв'язування полінуклеотидних компонентів індукторів ІФН використовувалися Cефадекс (Sephadex G-50 Medium 50-150 мm “Pharmacia”, Швеция), Cефароза (Sepharose 4B, 60-140 мm, “Pharmacia”) та Cферон (Spheron 300 (LC) 63-100 мm “Lachema”, Чехія).

В основі дії створеної авторами дослідної установки для культивування клітин-продуцентів ІФН з використанням ІММК у якості інтерфероногену покладений принцип роллерного перемішування горизонтально закріплених ємностей для культивування. Установка конструювалася як універсальна, в розумінні можливості культивувати як моношарові, так і суспензійні культури.

Установка зібрана на базі редукційного електродвигуна з максимальною швидкістю обертання валу 60 об/год. Як датчик температури використовувався термометр опору ТСП-5071 (Росія), а як датчик обертів - магнітний датчик VDO 804/6/10 (Чехія). Точність підтримання температури підтримували в межах ±0,1°С, а швидкість обертів валу - ±0,1 об/год від заданої швидкості. Установка оснащена електронним блоком керування на базі двох мікроконтроллерів. Зв`язок блоку керування з комп'ютером здійснювали через СОМ-порт за допомогою інтерфейсного блоку, зібраного на базі мікросхеми МАХ 233. Контроль за технологічним процесом та введення дослідих параметрів культивування здійснювалося комп'ютером за допомогою програми BioTech v.1, розробленої спеціально для виконання даної роботи.

Визначення біологічних властивостей індукторів ІФН, в умовах in vitro, проводили з використанням перещеплюваної лінії клітин тестикул поросят (ПТП) (НДІ ветеринарії УААН), та фібробластів мишей L-41 і L-929 (Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології НАН України ім. Р.Є. Кавєцького) (моделі моношарової культури). Первинні культури лейкоцитів (мононуклеарів) людини І(0) групи використовували як моделі суспензійної культури.

Життєздатність клітин визначали методом виключення барвника живими клітинами при фарбуванні 0,1% розчином трипанового синього (Doyle , Griffiths, 1998).

Для визначення кількості індукованого ІФН використовували вірус везикулярного стоматиту (ВВС) штам Індіана, отриманий з музею НДІ епідеміології і мікробіології ім. Н.Ф. Гамалеї, Росія. Титрування ІФН у зразках проводили згідно стандартної методики (Соловьев, Бектемиров, 1981).

Активність препаратів ІФН розраховували у логарифмічному значенні - log2(кількість дворазових розведень досліджуваного зразка), або стандартних міжнародних одиницях - МО/мл.

Усі досліди проводили у трьох та більше повторностях. Статистичну обробку результатів експериментів здійснювали за спеціальними комп'ютерними програмами для персональних ЕОМ. Графічну обробку результатів проводили за допомогою програм Microsoft Exel ХР та Harvard Chart XL for Windows ХР.

3. Результати та їх обговорення

Наведені результати власних досліджень відносно створення ІММК з використанням різних за фізико-хімічними характеристиками гранулярних компонентів та полірибонуклеотидів з різною вторинною структурою, вивчення їх фізичних та інтерфероногенних властивостей, впливу на життєдіяльність клітин-продуцентів, а також технологічних параметрів розробленої установки для культивування клітин в умовах дії на них часток ІММК.

Вміст іммобілізованих рибополінуклеотидів у препаратах ІММК виявився принаймні на 2-3 порядки меншим за традиційної іммобілізації білків, здатних до інкорпорації в сітчасту структуру гранули. Кількість приєднаних полінуклеотидів у всіх випадках була більшою на гранулах Сферону 300. Хімізм процесу активації всіх трьох нерозчинних носіїв виявився практично ідентичним. При цьому відмічається, що завдяки більш вільній орієнтації полінуклеотиду, ковалентно закріпленого на носіях типу сферонів, у порівнянні з іншими, приєднання здійснюється більш повно и не впливає на реакції, яким цей полінуклеотид піддають далі.

Характерна для іммобілізованих полінуклеотидів молекулярна маса (порядку 150-300 баз для дріжджової РНК, 200-800 баз для ридостину та 300-700 баз для poly(I)-poly(С)) практично виключала інкорпорацію лігандів всередину гранули, обмежуючи ковалентну кон'югацію зовнішньою поверхнею останньої. Стосовно до мети дослідження - створення контактного індуктора ІФН, подібне обмеження аж ніяк не є вадою, оскільки саме іммобілізовані на поверхні гранули молекули мають вступати в контакт з клітинами-продуцентами. Слід також відмітити, що дріжджова РНК приєднувалася до носіїв більш ефективно, ніж інші полінуклеотиди, що, можливо, є відображенням структурних відмінностей вказаних полімерів.

Визначення ж-потенціалів, що визначають заряди поверхні індукторних систем та клітин-продуцентів, характеризує ступінь контакту між ними, потрібний для початку процесу індукції, а в подальшому біосинтезу ІФН, тому проводили дослідження зарядових характеристик контактуючих часток у середовищі культивування.

З наведених даних видно, що найбільша різниця ж-потенціалів, і таким чином найвірогідніший контакт поверхонь часток у розчині, спостерігався у випадку пари мононуклеари/Сферон 300. По мірі зменшення величини
ж-потенціалів найсуттєвіша різниця між ними спостерігається у випадку системи Сферону 300 з іммобілізованою на його поверхні РНК - (-9,6 мВ), а найменша - у випадку системи Сферон 300 - рoly(I)-рoly(C) - (-8,1 мВ).

Головним питанням даного дослідження було питання щодо можливості длРНК, іммобілізованої на нерозчинних гранулярних носіях, індукувати синтез ІФН в клітинах.

В той час, як контакт лейкоцитів з Сфероном 300 і тилороном, які брали самі по собі, практично не приводила до появи ІФН, ІММК, на відміну від вказаних його компонентів, викликав індукцію синтезу ІФН. Достатньо велику індукторну дію викликав іммобілізований препарат олРНК у порівнянні з його неіммобілізованою формою, що можна пояснити утворенням достатньо великої кількості дволанцюгових структур у складі дріжджової олРНК у процесі її іммобілізації на Сферон. У випадку ж подальшого комплексоутворення нуклеїнового компонента такої іммобілізованої конструкції з тилороном (препарат ІММК) індукторний ефект ще більш підвищувався. Це свідчило щодо утворення в структурі іммобілізованої олРНК додаткових дволанцюгових фрагментів, здатних забезпечувати інтерфероногенну дію.

У випадку моношарових культур найбільш ефективними індукторами теж виявилися ІММК на основі комплексу дріжджова РНК-тилорон, причому найефективнішим носієм був Сферон 300. При іммобілізації з цим носієм інтерфероногенна ефективність різних полінуклеотидних компонентів ІММК розподілялася у ряду: дріжджова РНК-тилорон>poly(I)-poly(С)>ридостин (р<0,05), що в цілому співпадає з літературними даними.

Ефективність інтерфероногенезу, що здійснювалася іммобілізованими полінуклеотидними індукторами у всіх трьох моношарових клітинних культурах, виявилася практично рівною ефективності тих же індукторів у розчинній формі.

Найбільшу ефективність як в іммобілізованій, так і у розчинній формах, виявили poly(I)-poly(С) та молекулярний комплекс дріжджова РНК-тилорон. При цьому концентрація індукторів (у випадку ІММК - концентрація полінуклеотидного компоненту) відповідала рекомендованій (Ершов, Новохатский, 1980).

Найвищого рівня продукція ІФН у випадку культури ПТП досягає приблизно через 4 години від початку дії ІММК, L-41 - через 3 години, а L929 - через 5 годин. У випадку суспензійної культури (лейкоцити крові людини) цей показник набуває найбільшого значення на 10 годину від початку дії цього індуктора.

З метою встановлення, до якого типу належить ІФН, який індукується в клітинах під дією ІММК, зразки культуральної рідини після визначення в них титру ІФН, піддавали дії фізичних факторів (інкубації при 60С упродовж 30 хв, а також підкисленню до рН 2,0 упродовж 24 год). При цьому титри ІФН під дією фізичних факторів достовірно не змінювалися (Р 0,05). Це прямо свідчить про те, що ІФН, який індукується в цьому випадку, внаслідок його кислото- та термостабільності, можна віднести до ІФН І типу (/ - ІФН).

Як видно, зі збільшенням кількості циклів регенерації досить суттєво (40%) знижується кількість РНК, зв'язаної зі Сфероном 300. Найбільш вірогідно це пояснюється дією різноманітних нуклеаз, присутніх у середовищі з клітинами. Зі зниженням цього параметра зменшується і здатність ІММК індукувати ІФН. Слід додати, що багаторазове використання і наступна очистка ІММК від клітин і клітинних фрагментів приводила до деякої втрати загального об'єму цих іммобілізованих конструкцій (10-20%), що також знижувало загальний інтерфероногенний ефект ІММК.

Однак сама можливість багаторазового використання ІММК як індукторів у технології широкомасштабного виробництва препаратів ІФН І типу вважається безсумнівною перевагою у порівнянні з їх розчинними прототипами.

Головним питанням даної роботи була оцінка ефективності культивування клітин і біосинтезу ІФН в дослідній установці у порівнянні зі стаціонарними умовами культивування.

Як видно з наведених даних, культивування в дослідній установці суттєво сприяє збереженню життєздатності клітин-продуцентів, по відношенню до стаціонарних умов.

Так, у випадку суспензійної культури мононуклеарних клітин крові людини на 8 год культивування в стаціонарних умовах кількість клітин зменшилася - майже у 4 рази, порівняно з культивуванням в дослідній установці. У випадку моношарової культури кількість клітин збільшувалася при культивуванні в установці приблизно в 1,7 рази, а в стаціонарних умовах на 8 годину культивування спостерігалася повна загибель клітин.

Дані щодо кількості ІФН, синтезованого вказаними клітинами-продуцентами в дослідних умовах, підтверджують попередній висновок. У випадку обох досліджуваних типів культур клітин культивування в установці приводило до накопичення ІФН у значно більш високих титрах, ніж за стаціонарних умов.

Для оптимізації біосинтезу ІФН при використанні ІММК у якості індуктору надзвичайно важливим є попередній дослідний підбір оптимального для інтерфероногенезу співвідношення кількості клітин-продуцентів до часток ІММК.

Як видно, присутність часток ІММК в середовищі культивування у кількостях, перевищуючих кількість культивованих клітин (10/1), негативно впливає як на їх життєздатність, так і спроможність до інтерфероногенезу. Це, можливо, пояснюється надлишком контактів між клітинами та частками ІММК з відповідними незворотними порушеннями структури клітинних мембран. При цьому слід відмітити, що частки Сферону 300, на основі якого був створений ІММК, у набухлому стані мають об`єм 10-11 см3, що практично на порядок перевищує об`єм середньої еукаріотичної клітини, і тому потенційно спроможні не тільки завдавати механічні пошкодження клітинам, але і пасивно перешкоджати трансмембранному проходженню іонів та субстратів до клітини.

Поряд з вирішальними факторами забезпечення життєдіяльності клітин ссавців, до яких звичайно відносять оптимальний температурний режим та рівень рН середовища, велике значення при культивуванні in vitro мають умови, пов`язані з рухом середовища. В роботі визначені оптимальні для культивування клітин швидкості перемішування культурального середовища для кожної з культур у певні фізіологічно важливі періоди культивування (у межах 7 об/год та 5 об/год, відповідно). Дослідно встановлені також оптимальні величини співвідношення кількості часток ІММК та клітин-продуцентів в середовищі культивування 1/100, початкової концентрації клітин в ємностях біореактора на рівні 106-107 кл/мл середовища, а також оптимального вмісту сироватки великої рогатої худоби у живильному середовищі при культивуванні клітин моношарових та суспензійної культур 15-25 %.

Розроблено апаратурну схему отримання ІФН І типу з суспензійної (лейкоцитів) та моношарових культур клітин з використанням ІММК у якості індуктора. У випадку суспензійної культури лейкоцитарна маса з донорської крові потрапляє до холодильника Х-1, де зберігається до моменту введення в виробничий цикл. Після подачі до реактору Р-1, туди ж подається розчин версену, що руйнує домішок еритроцитів. Отримана суспензія розділяється на центрифузі Ц-3, з якої очищена лейкомаса подається в термостатовану шафу Т-4, в якій розташована установка для культивування З-5. Туди ж додається суспензія ІММК та живильне середовище 199. Індукція ІФН проходить протягом 12 год при температурі 36,5 С та швидкості обертів валу 7 об/год.

У разі використання в якості продуцентів ІФН моношарових клітинних ліній здійснюється їх попереднє підрощення на матрацах М-8 та М-9, після чого культура разом з живильним середовищем 199 подається для другого підрощення в установці для культивування З-7, розташованій у термостатованій шафі Т-8. Після підрощення, яке триває 24 год. здійснюється заміна поживного середовища на свіже та внесення суспензії ІММК з З-15. Процес індукції відбувається впродовж 12 годин при температурі 36,5 С та швидкості обертів валу 5 об/год.

Після індукції клітинна суспензія з ІММК у живильному середовищі передається в збірник З-10, а потім на відстоювання З-11, де відбувається відділення розчину ІФН від часток ІММК. Отриманий розчин ІФН передається на стадію НА-17, де відбувається наповнення ампул та сушіння в сублімаційній сушарці СШ-18. Частки відпрацьованого ІММК передаються в збірники З-12 та З-13, де здійснюється дворазове відмивання від залишків клітинного матеріалу водою. Потім завис відмитого ІММК передається на регенераційну обробку розчином тилорону в З-14, після чого ІММК знову використовується в промисловому циклі які індуктор.

Висновки

інтерферон продуцент іммобілізований рибополінуклеотид

1. Розроблено технологію одержання препаратів інтерферону І типу з використанням імобілізованого молекулярного комплексу (ІММК) у якості індуктору, яка дає змогу використовувати ІММК впродовж шести циклів інтерфероногенезу.

2. Сконструйовано штучні конструкції для здійснення процесу індукції ІФН І типу (б/в-ІФН) в умовах in vitro на основі молекулярних комплексів дріжджової РНК, яка ковалентно приєднана до нерозчинних гранулярних матриць, з гідрохлоридом тилорону. Показана інтерфероногенна здатність таких конструкцій, вивчена динаміка синтезу індукованого ними ІФН і доведена його належить до ІФН І типу (б/в-ІФН).

3. Досліджено значення величин ж-потенціалів індукторних систем на основі Сферону 300 та лейкоцитів: (-3,9 mV) - Сферон 300-РНК; (-4,6 mV) - Сферон 300-ридостин; (-5,2 mV) - Сферон 300-poli(I)-poli(C); лейкоцити (-13,5 mV)

4. Встановлено, що вміст іммобілізованих рибополінуклеотидів в отриманих індукторних системах становить (мкг/г): на основі Сферону 300 (РНК - 31,8±2,6, ридостин - 30±2, poli(I)-poli(C) - 28,7±3); на основі Сефадексу G-50 (РНК - 24,6±1,2, ридостин - 22,2±1,6, poli(I)-poli(C) - 21,7±3,9); на основі Сефарози 4В (РНК - 29,3±2, ридостин - 27,1±3, poli(I)-poli(C) - 26,8±3,9).

5. Визначено кількісні та часові параметри синтезу ІФН клітинами-продуцентами суспензійної та моношарових культур під дією контактів з гранулами ІММК в середовищі культивування. Встановлено, що найвищого рівня продукція ІФН лейкоцитами крові людини досягає на 10 год, ПТП - через 4 год, L-41 - через 3 год, а L-929 - через 5 год.

6. Розроблено і сконструйовано дослідну установку, яка може слугувати прототипом промислової апаратури при одержанні ІФН в умовах in vitro індукованого за допомогою ІММК з застосуванням моношарових та суспензійних клітинних культур.

7. Експериментально оцінено ефективність та проведено підбір технологічних параметрів інтерфероногенезу в культурах обох типів під дією ІММК. Встановлено, що оптимальними параметрами інтерфероногенезу є швидкість обертів валу 5 об/год, вміст сироватки великої рогатої худоби 17 %, співвідношення клітин-продудентів до часточок індуктору 100 до 1.

8. Розроблено апаратурно-технологічну схему отримання інтерферону І типу для обох типів досліджених культур з використанням іммобілізованої індукторної системи багаторазової дії.

Література

1. Карпов О.В., Жолобак Н.М., Манджос О.П., Пенчук Ю.М., Співак М.Я. Вивчення зв'язку структура-активність в ряду лігандів інтерфероніндукуючих молекулярних комплексів з одноланцюговою РНК. // Вісник Київського нац. університету ім. Тараса Шевченка. Біологія - 2001 - Вип. 35 - С.25-28.

2. Карпов О.В., Верьовка С.В., Манджос О.П., Пенчук Ю.М., Поводзинський В.М., Жолобак Н.М., Співак М.Я., Кисельова О.К. Індукція інтерферонів І типу в умовах in vitro за допомогою іммобілізованого комплексного інтерфероногену. // Доп. НАН України - 2003 - №9 - С.178-181.

3. Пенчук Ю.М., Поводзинський В.М., Карпов О.В. Конструювання та випробування іммобілізованого комплексного індуктору -інтерферонів. // Укр. журн. мед. техн. технол. - 2005 - №3-4 - С.80-84.

4. Карпов А.В., Пенчук Ю.Н., Веревка С.В. Применение иммобилизованных индукторов в технологии получения природных интерферонов І типа в культурах клеток. Использование гранулярных носителей. // Биотехнология - 2006 - №1 - С.30-35.

5. Деклараційний патент UA 70637А, А61К38/21. Індуктор інтерферону першого типу в культурах клітин. / О.В. Карпов, В.М. Поводзинський, Ю.М. Пенчук, Н.М. Жолобак, С.В. Верьовка. - Опубл. 15.10.2004. Бюл. № 10.

6. Деклараційний патент UA 70638А, А61К38/21. Спосіб одержання інтерферону першого типу. / О.В. Карпов, В.М. Поводзинський, Ю.М. Пенчук, Н.М. Жолобак, С.В. Верьовка. - Опубл. 15.10.2004. Бюл. № 10.

7. Деклараційний патент UA 71280А, А61К38/21. Спосіб одержання інтерферону першого типу. / О.В. Карпов, В.М. Поводзинський, Ю.М. Пенчук, Н.М. Жолобак, С.В. Верьовка. - Опубл. 15.11.2004. Бюл. № 11.

Размещено на Allbest.ru