Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L-лактат:цитохром C-оксидоредуктази Hansenula polymorpha

30. Gonchar M., Smutok O., Demkiv O., Paryzhak S., Gayda G., Schuhmann W. Novel recombinant and genetically modified enzymes as the biorecognition elements of the biosensors // Abs. of Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology “Current State and Prospects for Future Cooperation” - Kyiv (Ukraine). - 2006. - P. 70.

31. Gonchar M., Smutok O., Pavlishko H., Gayda G., B. Ngounou, Schuhmann W. Bi-enzyme oxidase- and peroxidase-based amperometric biosensor for alcohol, formaldehyde and glycerol assay // Abs. of International conference “Peroxidase 2006” - Aveiro (Portugal). - P. 72.

Анотація

Смуток О.В. Скринінг мікробних продуцентів, очистка та біоаналітичне використання L-лактат:цитохром c-оксидоредуктази Hansenula polymorpha. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.

Дисертаційна робота присвячена скринінгу дріжджових продуцентів стабільної форми L-лактат:цитохром c-оксидоредуктази (флавоцитохрому b₂), його виділенню, фізико-хімічній і ензимологічній характеристиці та біоаналітичному використанню у харчовій технології.

Прведено скринінг 14 видів та штамів дріжджів і відібрано H. polymorpha 356 як перспективний продуцент стабільного флавоцитохрому b₂. Оптимізовано умови культивування дріжджів з максимальним виходом ферменту.

Розроблено нову ефективну схему препаративного отримання високоочищеного препарату флавоцитохрому b₂ з клітин перспективного продуцента стабільного ферменту - метилотрофних дріжджів H. polymorpha. Досліджено деякі фізико-хімічні та ензимологічні характеристики ферменту.

На основі високоочищеного препарату флавоцитохрому b₂ H. polymorpha і осмійвмісного полімерного медіатора розроблено лабораторний прототип амперометричного біосенсора, вивчено його аналітичні характеристики та показана придатність для визначення L-лактату у винах.

Розроблено новий ензиматично-фотометричний метод визначення L-лактату. Метод ґрунтується на ензиматичному окисленні L-лактату до пірувату в присутності фериціаніду з одночасним відновленням нітротетразолієвого синього до кольорового реагенту - формазану. Метод було використано для кількісного визначення L-лактату у зразках вин.

Ключові слова: метилотрофні дріжджі, флавоцитохром b₂, очистка і характеристика фермента, L-лактат, амперометричний біосенсор, ензиматичний аналіз.

Аннотация

Смуток О.В. Скрининг микробных продуцентов, очистка и биоаналитическое применение L-лактат:цитохром c-оксидоредуктазы Hansenula polymorpha. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.

Диссертационная работа посвящена скринингу дрожжевых продуцентов стабильной формы флавоцитохрома b₂, его выделению, физико-химической и энзимологической характеристике, биоаналитическому использованию в пищевой технологии.

Проведен скрининг 14 видов и штаммов дрожжей и отобран H. polymorpha 356 как перспективный продуцент стабильного флавоцитохрома b₂. Оптимизированы условия культивирования H. polymorpha 356 и химический состав ростовой среды (1 % глюкоза, 0,2 % лактат). Показано, что глюкоза в концентрациях 0,5 -5 г/л не репрессирует синтез флавоцитохрома b₂, а внесение в питательную среду лактата в концентрации 0,2 % и выше оказывает индуцирующое влияние на синтез фермента.

Разработана эффективная схема препаративного получения высокоочищенного препарата стабильного флавоцитохрома b₂ из клеток H. polymorpha. Выделение фермента включало несколько этапов: высушивание клеток, физическое разрушение с последующим лизисом бутанолом, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. Выход фермента после очистки составлял 90 % с максимальной удельной активностью препарата 12 мкмольмин^-1мг^-1 белка. Исследованы некоторые физико-химические и энзимологические характеристики фермента (молекулярный вес субъединицы, спектры поглощения, термостабильность).

На основе высокоочищенного препарата флавоцитохрома b₂ H. polymorpha и осмий-содержащего полимерного медиатора разработан лабораторный прототип амперометрического биосенсора, изучены его аналитические характеристики и показана возможность определения содержания L-лактата в винах биосенсорным методом. Биосенсор обладает высокой чуствительностью, селективностью и стабильностью.

Разработан новый энзимо-фотометрический метод определения содержания L-лактата с использованием флавоцитохрома b₂. Метод основан на энзиматическом окислении L-лактата до пирувата в присутствии феррицианида с одновременным восcтановлением нитротетразолиевого синего в окрашенный формазан. Метод использован для количественного определения L-лактата в образцах вин.

Изучен коэффициент корреляции между результатами определения содержания L-лактата в винах биосенсорным и энзиматическим методами (R = 0,999).

Ключевые слова: метилотрофные дрожжи, флавоцитохром b₂, очистка и характеристика фермента, L-лактат, амперометрический биосенсор, энзиматический анализ.

Abstract

Smutok O.V. Screening of microbial producers, isolation and bioanalytical application of L-lactate:cytochrome c-oxidoreductase of Hansenula polymorpha - Manuscript.

The thesis for Doctoral degree in Biology and specialization in Microbiology (03.00.07). Institute of Cell Biology of the National Academy of Sciences of Ukraine, L'viv, 2007.

The thesis are devoted to the screening of yeast producers of a stable form of flavocytochrome b₂, it's isolation, physico-chemical, enzymological characterization, and bioanalytical application in food thechnology.

The screening of 14 yeasts species has shown that H. polymorpha 356 could be sucsessfully used as a source of a stable form of flavocytochrome b₂. The optimal conditions of maximal enzyme production have been found.

The effective scheme of preparative isolation of highly purified flavocytochrome b₂ from the cells of the most promising produsers of the stable enzyme, methylotrophic yeast H. polymorpha, has been developed. Some physico-chemical and enzymological characteristics of the enzyme have been investigated.

A new prototype of amperometric biosensors based on highly purified flavocytochrome b₂ from H. polymorpha and osmium-containing redox-paint has been developed. The main characteristics of the sensor have been investigated and possibility of its application for assay of L-lactate in wines has been approved.

A new enzymo-photometeric method for L-lactate assay has been proposed. The method is based on enzymatic oxidation of L-lactate to pyruvate in the presence of ferricyanide coupled with nitrotetrazolium blue reduction to colored product, formazan. The method has been used for quantitative determination of L-lactate in wines samples.

The key words: methylotrophic yeast, flavocytochrome b₂, purification and characterization of enzyme, L-lactate, amperometric biosensor, enzymatic analysis.

Размещено на Allbest.ru