Метаболiчнi механiзми адаптацi чорноморських риб до гiпоксичних станiв

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метаболiчнi механiзми адаптацiп чорноморських риб до гiпоксичних станiв

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора бiологiчних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Кисень є найважливішою складовою гідрохімічного комплексу чинників морського середовища, яка обмежує розповсюдження організмів і впливає на видове різноманіття їхніх угруповань (Романенко, 2004). Евтрофікація, пов'язана з антропогенним навантаженням на водойми, а також обмеження водообміну, є основними причинами, що призводять до виникнення зон стійкої гіпоксії (Joyce, 2000). Останнім часом це явище все частіше охоплює високо продуктивні шельфові зони і відкриті акваторії Світового океану, викликаючи якісну трансформацію існуючих екосистем (McEnroe et al., 1998; Joyce, 2000; Duncombe-Rue et al., 2000; Shulman et al., 2002). Зони стійкої придонної гіпоксії порівняно недавно сформувались і на північно-західному шельфі Чорного моря (Фесюнов, Назаренко, 1991; Виноградов и др., 1992; Золотарев и др., 1996). Зараз ця акваторія активно реколонізується організмами різних трофічних рівнів (Зайцев, 1987; Фащук и др., 1991). У перспективі тут можна очікувати виникнення унікальної для Чорного моря гіпоксичної екосистеми.

Виконуючи функцію акцептора електронів у дихальному ланцюзі мітохондрій, кисень в остаточному підсумку зумовлює енергетичний статус тканин і організму в цілому. В умовах водного середовища, де дифузія його протікає в 10000 разів менш ефективно, в порівнянні з повітрям, виникнення гіпоксичних станів у гідробіонтів стає більш імовірною подією. Особливо це актуально для риб, у яких енергетичні витрати на обмін істотно превалюють над конструктивними процесами (Шмидт-Ниельсен, 1982; Хочачка, Сомеро, 1988; Шульман, Урденко, 1989; Shulman, Love, 1999; Maіna, 2002). Стан гіпоксії може виникати не тільки в умовах зовнішнього дефіциту кисню, а й при гіпер- і гіпотермії (Арсан, 1986 a, b; Романенко и др., 1991; Dong, Zhang, 1992; Xu et al., 1994; Guіweі et al., 1998; Portner et al., 2004; Heіse et al., 2006). До них можна віднести випадки переднерестової анемії (Raіzada, Sіngh, 1981; Маслова, Тавровская, 1991), природні і токсичні варіанти метгемоглобинемії (Koudela, Zіtkova, 1991; Schoore, 1995; Hofer, Gatumu, 1994). Причини, що лежать в основі їхнього розвитку, не завжди ясні і зрозумілі.

Серед тканин гідробіонтів особлива роль належить скелетній мускулатурі. Переорієнтація її метаболізму на посилення анаеробних процесів, може привести до зміни рухової активності виду і вплинути на його майбутню долю в екосистемі. Про нестійкість кисневого режиму скелетних м'язів морських і прісноводних риб свідчить низька швидкість утилізації кисню, яка сполучається з високою щільністю капілярів і мітохондрій у тканині, порівняних з вищими хребетними (Mathіeu-Costello et al., 1996; Johnston, Ball, 1997). Для м'язів багатьох риб характерний нескомпенсований тип стехіометрії цитохромів мітохондрій (Савина, 1992; Zhou et al., 2000), а також дуже ефективні метаболічні схеми анаеробної генерації енергії (Bіdіnotto et al., 1997; Lutz, Nіlsson, 1997; Bіckler, Buck, 2007), важливим елементом яких є білковий катаболізм (Shulman, Love, 1999; Shulman et al., 2002; Chew et al., 2005). Таке співвідношення процесів дозволяє припустити низьку ефективність масопереносу кисню у риб на тканинному рівні.

Характеризуючи кисневі режими тканин, звертають увагу на дві групи параметрів, які в стійкому стані повинні бути збалансовані: напруження кисню (РО₂) в артеріальній, венозній крові і тканинних структурах; швидкості транспорту кисню кров'ю й утилізації його тканинами (Лауэр, Колчинская, 1964). Перша група параметрів - відповідальна за швидкості дифузії кисню на рівні гематопаренхіматозного бар'єра, друга - за величини PO₂ у крові і тканинах. Однак, ці аспекти фізіології риб фактично не розроблені. На сьогоднішній день є велика інформація про процеси мікроциркуляції (Soederstroem, Nіlsson, 2000; Schwerte et al., 2003; Stenslokken et al., 2004; Florіndo et al., 2006 і ін.) і газотранспортні властивості крові риб (Feuerleіn, Weber, 1996; Fago et al., 1995; Pellegrіnі et al., 2003; Jensen, 2004 і ін.). Дані ж про об'ємний тканинний кровотік, РО₂ у тканинах і венозній крові, важливі для розпізнавання первинних і вторинних форм гіпоксії, навпаки, надто обмежені або відсутні (McKenzіe et al., 2004). Це означає, що питання щодо вивчення процесів, які визначають кисневий гомеостаз тканин у гідробіонтів і риб, зокрема, раніше не порушувались. Розробці цього напряму екологічної і фізіологічної біоенергетики риб і присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота тісно пов'язана з виконанням планових науково-дослідних робіт Інституту біології південних морів НАН України, рядом державних проектів, міжнародних грантів і госпдоговорних тем. Отримані результати були використані під час підготовки звітів з держбюджетних тем: «Еколого-фізіологічні і фізіолого-біохімічні основи існування популяцій тварин в угрупованнях і екосистемах Чорного моря» (№ держ. реєстації 01.9.10 056168); «Метаболічні основи існування масових видів безхребетних і риб в умовах мінливого режиму Чорного моря» (№0196U022102); «Структурно-функціональні основи продукційних процесів у гідробіонтів» (№0199U001389); «Біохімічні і метаболічні стратегії, які забезпечують функціональне біорізноманіття гідробіонтів» (№0103U001049). Частину досліджень було виконано у рамках проектів: «Комплексний екологічний моніторинг прибережної зони Чорного й Азовського морів», №01.02/02540 (Національне агентство морських досліджень і технологій); «Фізіолого-біохімічна індикація забезпечення харчуванням ракоподібних і риб пелагіалі Чорного моря», №5.4/211 (Державний комітет України у справах науки і технологій); «Оцінка фізіологічного стану промислових гідробіонтів, що живуть в умовах дії несприятливих антропогенних факторів», №0195U025265 (Міністерство рибного господарства України). При виконанні робіт були використані кошти, отримані в рамках міжнародного гранта персональної підтримки з програми «Іnternatіonal Scіence and Educatіon Program» (№QSU 084189).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідження кисневих режимів скелетних м'язів морських риб і механізмів їхньої функціональної корекції при різних станах організму й умовах навколишнього середовища.

Для цього виконувались наступні завдання.

· Дослідити в умовах експерименту фізіологічні і поведінкові аспекти дії уретанової анестезії на організми різних систематичних груп морських риб і визначити на цій основі стадії наркозу й ефективні концентрації наркотичного агента для різної температури, солоності і напруження кисню в середовищі.

· Порівняти величини РО₂ у крові і м'язовій тканині, дифузійну здатність, швидкості масопереносу й утилізації кисню в скелетних м'язах різних екологічних груп морських риб.

· Вивчити кисневі режими скелетних м'язів і механізми їхньої корекції у морських риб в умовах експериментальної гіпоксії, гіпотермії, гіпоосмії і гіподинамії.

· Дослідити динаміку кисневого статусу м'язової тканини і процеси, які його обумовлюють, у морських риб протягом річного циклу.

· На основі отриманого експериментального матеріалу визначити основні принципи регуляції кисневих режимів скелетних м'язів у морських риб, а також механізми розвитку і компенсації гіпоксичних станів.

Об'єкти дослідження: представники донної і пелагічної іхтіофауни Чорного й Азовського морів (всього 15 видів риб).

Предмет дослідження: механізми спрямованої корекції кисневого режиму скелетних м'язів морських риб.

Методи дослідження: загальноприйняті методи аналізу іхтіологічного матеріалу; фотоколориметричні і спектрофотометричні методи визначення активності ферментів, концентрації мінеральних і органічних речовин у біологічних пробах; потенціометричні методи контролю частоти дихання, частоти серцевих скорочень, об'ємного тканинного кровотоку, напруження кисню у воді, крові, гемолізатах і м'язах; вертикальний диск-електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) зразків гемоглобіну; авторадіографічні і гістологічні методи обробки проб м'язів, крові і відбитків кровотворних органів; світлова мікроскопія при вивченні гістологічних і цитологічних препаратів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше використаний комплекс показників для характеристики кисневого режиму тканин нижчих хребетних (морські риби). Виявлена надзвичайно низька дифузійна здатність тканнинних структур скелетних м'язів риб відносно кисню. Показано, що це - основна причина низьких значень тканинного РО₂ і малої ефективності утилізації кисню м'язами, незважаючи на високу щільність капілярної мережі в них.

Описано три нових види гіпоксичних станів у морських риб: гіпоксія гіподинамічного стану; гемічний вид гіпоксії, виявлений в умовах гіпотермії і пов'язаний з високим тепловим ефектом реакції оксигенації гемоглобіну; гіпоосмічна гіпоксія, яка визначається гідратацією скелетних м'язів при адаптації до умов розпріснення середовища. Вперше запропоновано класифікацію гіпоксичних станів для водяних організмів.

Визначено механізми термінової і довгострокової регуляції тканинного РО₂. Показано, що найбільший внесок у стабілізацію кисневого режиму м'язової тканини робить процес корекції положення кривих оксигенації гемоглобіну. Виявлено, що в основі його лежать кількісні зміни гетерогенної структури пігменту і внутрішньоеритроцитарної концентрації нуклеотидтрифосфатів (NTP). Відзначено низьку ефективність процесів тканинної гіперемії, яка лише частково забезпечує необхідний адаптаційної ефект.

Вперше показано, що кров риб, толерантних до гострої зовнішньої гіпоксії, має одночасно високу спорідненість до кисню і підвищену чутливість до рН (ефект Бора). Досліджено гетерогенну систему гемоглобіну і виявлено компонент із зазначеними функціональними характеристиками. Показано, що вміст його в крові спрямовано зростає в умовах експериментальної гіпоксії.

Встановлені спрямовані перебудови в цитохромному ланцюзі мітохондрій м'язів риб (нескомпенсований тип стехіометрії), які підвищують ефективність функціонування дихального ланцюга в умовах низького тканинного РО₂.

Вперше виявлена участь і визначена значущість тканинного рівня ліпідів у корекції дифузійної здатності скелетних м'язів риб відносно кисню.

Описано феномен метаболічного арешту на рівні циркулюючих еритроцитів у риб, здатних існувати в умовах гострого дефіциту кисню. Визначені співвідношення активностей гексокінази, Na⁺, K⁺-ATPази і балансу одновалентних катіонів (Na⁺ і K⁺), що існують на мембрані клітин червоної крові у досліджених видів риб.

Встановлена моноциклічність у функціонуванні кровотворної тканини у риб протягом річного циклу. Показано, що активний еритропоез у них відбувається лише в післянерестовий період і спостерігається протягом 2-3 місяців. В інший час у системі червоної крові переважають деструктивні процеси, які супроводжуються розвитком анемії і метгемоглобинемії і зумовлюють розвиток стану переднерестової гіпоксії у риб.

Виявлено, що у теплолюбних риб в умовах гіпотермії (менше 5^оС) судини м'язів втрачають здатність активно реагувати на функціональні навантаження, що пов'язано з підвищенням вмісту Ca²⁺ у м'язовій тканині.

Показано, що еритроцити евригалінних риб, у порівнянні зі стеногалінними, мають підвищену стійкість до осмотичного шоку і більш ефективні Na⁺, K⁺-ATPази. У цих видів визначені процеси осморегуляції, які забезпечують ефективне функціонування їхніх клітинних систем в умовах гіпотонії плазми крові.

Практичне значення отриманих результатів. Запропонована в роботі класифікація гіпоксичних станів орієнтована як на морські, так й на прісноводні риби. Вона дозволяє планувати рибоводні заходи таким чином, щоб уникнути виникнення на практиці подібних станів. Особливо варто звернути увагу на низку екзогенних і ендогенних форм гіпоксії, а також гіподинамічну гіпоксію.

Камбала-глоса, кефалі (сингіль, гостроніс і, особливо, піленгас) є об'єктами сучасного рибництва на території України. Дані, отримані з гематології й біохімії крові для цих видів, можуть бути використані при уточненні або визначенні меж фізіологічних норм, їм властивих, а також діагностиці їхнього стану.

Встановлено, що в умовах експериментальної гіподинамії у кефалі-піленгаса розвивалась анемія, артеріальна гіпоксемія, зростала кількість гіпоксичних і аноксичних зон у м'язовій тканині, які у сукупності приводили до розвитку стану гіпоксії. Це дозволяє рекомендувати даний вид для басейнового, а не сажового вирощування у рибоводних господарствах.

Вперше показано, що розвиток метгемоглобинемії у риб може викликати не тільки нітритна інтоксикація, яка найчастіше трапляється в рибогосподарській практиці, а й ряд природних станів (нерест) і чинників середовища (гіпотермія). Це необхідно враховувати під час контролю стану посадкового матеріалу і планування рибоводних заходів.

Дослідження впливу уретанової анестезії на організм морських риб дозволило визначити основні стадії наркозу й ефективні концентрації наркотичного агента з урахуванням факторів середовища і стану організму. Показано також, що цей вид анестезії справляє значно м'якший ефект, у порівнянні з іншими, широко застосовуваними препаратами (MS-222, хлорбутанол, хінальдин, менокаїн, пропоксат, метомидат і багато інших). Це дозволяє рекомендувати використання зазначених розробок не тільки в науковій галузі, а і в рибогосподарській практиці.

Теоретичні положення і практичні розробки дисертації використані автором під час лекцій з фізіології гіпоксичних станів, фізіології і біохімії адаптаційних процесів, екологічної фізіології та біохімії риб студентам факультетів біологічного профілю.

Особистий внесок дисертанта. Автор самостійно обґрунтував тему, мету та основні завдання дослідження, оволодів усіма використовуваними в роботі лабораторними методами аналізу біологічного матеріалу і реєстрації фізіологічних показників, а також застосовуваними розрахунками; виконав основний комплекс експериментальних робіт, проаналізував і узагальнив отримані результати, сформулював висновки.

У процесі підготовки і виконання роботи здобувачу надали консультативну допомогу з окремих теоретичних і методологічних питань - д.м.н. М.М. Середенко, Інститут фізіології НАН України (класифікація гіпоксичних станів, розрахунки масопереносау й утилізації кисню в тканинах); д.б.н. М.М. Маслова, к.б.н. Т.В. Тавровська, Інститут еволюційної фізіології і біохімії РАН (сезонні аспекти еритропоезу у пойкілотермів; авторадіографія і мікроскопічний аналіз препаратів крові і кровотворних органів у риб); д.б.н. С.В. Коношенко, Таврійський національний університет МОН України (методи фракціонування гемоглобінів і побудова кривих оксигенації пігментів).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на X Всесоюзній конференції з еволюційної фізіології (Ленінград, Росія, 1990); V Всесоюзній конференції з раннього онтогенезу риб (Астрахань, 1991); VІІІ науковій конференції з екологічної фізіології і біохімії риб (Петрозаводськ, 1992); І, ІІ, ІV з'їздах Гідроекологічного товариства України (Київ, 1993; 1997; Феодосія, 2005); 31^st, 33^rd European Marіne Bіology Symposіum (St.-Petersburg, Russіa, 1996; Wіlhelmshaven, Germany, 1998); BMB 15 and ECSA 27 Sіmposіum «Comparіson of Enclosed and Semіenclosed Marіne Systems» (Marіehamn, Aland, Fіnland, 1997); Baltіc Sea Scіence Congress (Stockholm, Sweden, 2001); V Міжнародній конференції «Водні екосистеми й організми» (Москва, Росія, 2003); Міжнародному науковому семінарі «Особливості механізмів адаптації риб до факторів середовища» (Феодосія, 2003); Fіrst (Іnaugural) Ukraіnіan Congress of Cell Bіology (Lvіv, 2004); XІ з'їзді фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова (Єкатеринбург, Росія, 2004); Міжнародній конференції «Сучасні проблеми фізіології і біохімії водяних організмів» (Петрозаводськ, Росія, 2004); І з'їзді фізіологів СНД (Сочі, Росія, 2005); Міжнародній науковій конференції «Водная экология на заре XXІ века (Винберг-100)» (С.-Петербург, Росія, 2005); XІІІ Міжнародній нараді з еволюційної фізіології (С.-Петербург, Росія, 2006); Міжнародній науковій конференції «Проблеми біологічної океанографії XXІ століття» (Севастополь, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 52 наукові праці, з них 32 статті, які входять до переліку, затвердженого ВАК України, 1 стаття і 19 тез доповідей у збірниках матеріалів конференцій.

Структура й обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, 12-ти розділів, висновків, списку використаних джерел, який містить 987 найменувань (168 кирилицею, 819 латиницею). Робота ілюстрована 40 рисунками і 66 таблицями. Загальний обсяг рукопису становить 441 сторінка.

Зміст роботи

анестезія риба наркоз чорноморський

Розділ 1. Кисневий режим морських вод і організми

Розділ є першою частиною огляду літератури з тематики дисертаційної роботи. У ньому розглядаються основні фізико-хімічні принципи регуляції кисневих режимів водойм. Показано, що зовнішня гіпоксія є поширеним явищем у водах Світового океану. Вона актуальна і для північно-західного шельфу Чорного моря. Розглянуті основні уявлення про формування гіпоксичних акваторій у морському середовищі.

Дається загальна характеристика екосистем гіпоксичних зон Світового океану і Чорного моря з акцентом на морські риби. Проведено порівняльну оцінку стійкості представників чорноморської іхтіофауни до зовнішньої гіпоксії за значеннями граничних і критичних концентрацій кисню у воді.

Розділ 2. Фізіологічні і молекулярні системи транспорту й утилізації кисню у риб

Розділ є основною складовою огляду літератури. В ньому представлено інформацію про стан систем кисневого забезпечення тканин у морських і прісноводних риб. Розглянуто процеси мікроциркуляції: щільність, геометрія, морфологія й ультраструктура судин капілярного русла, артеріол і венул, судинорухові реакції, об'ємний тканинний кровотік і методи його реєстрації. Велику увагу приділено кисневій ємності крові у риб і шляхам її функціональної корекції (еритропоез, депо крові, деструкція старих еритроїдних форм). Окремим блоком представлено інформацію про гемоглобіни риб. Охарактеризовані особливості їхньої структури, поліморфізм, функціональні властивості. Особливий акцент зроблено на механізми спрямованої корекції положення і форми кривих оксигенації гемоглобіну.

Вперше зроблено спробу узагальнити інформацію про кисневий гомеостаз тканин риб. Наводяться дані про РО₂ в артеріальній, венозній крові і тканинних структурах. Оцінюються дифузійні характеристики тканин і чинники, що впливають на них: тканинний рівень ліпідів і міоглобіну. Розглянені молекулярні системи утилізації кисню (цитохроми) і реакції клітинних систем риб на гіпоксію.

Відзначено, що інформація про об'ємний тканинний кровотік, РО₂ у тканинах і венозній крові, важлива для розпізнавання первинних і вторинних форм гіпоксії, для риб надзвичайно обмежена. З цієї причини не можна скласти повне уявлення про механізми спрямованої корекції тканинного РО₂ і основні шляхи розвитку тканинної гіпоксії в зазначеній систематичній групі організмів.

Розглянуто історію й еволюцію уявлень про формування гіпоксичних станів на організменному і тканинному рівнях. Представлені сучасні підходи до їхньої класифікації і діагностики. Відмічено, що діюча класифікаційна система гіпоксичних станів не може бути цілком екстрапольована на водяні організми. Це обумовлено специфікою фізико-хімічних властивостей водного середовища й особливостями функціональної організації гідробіонтів. Підкреслюється, що проблема гіпоксичних станів для водяних організмів і риб, зокрема, раніше не порушувалась, і питання їхньої діагностики фактично не розроблені.

Розділ 3. Матеріал і методи дослідження

Результати досліджень, представлені в дисертаційній роботі, були отримані протягом 1980-2003 років. Основна частина експериментів, лабораторна обробка проб та їхній аналіз були виконані на базі ІнБПМ НАН України.

Робота виконувалась на 15-ти видах азово-чорноморських риб: кефаль-сингіль (Lіza aurata R.); кефаль-гостроніс (Mugіl salіens R.); кефаль-піленгас (Liza hamatocheila T.); ставрида (Trachurus medіterraneus S.); тюлька (Clupeonella cultriventris N.); камса (Engraulіs encrasіcolus L.); бичок-кругляк (Neogobіus melanostomus P.); бичок-мартовик (Gobіus batrachocephalus P.); бичок-трав'яник (Zosterisessor ophіocephalus P.); бичок-кругляш (Gobіus cobіtіs P.); бичок-ротан (Neogobіus ratan P.); бичок-нігер (Gobіus nіger L.); бичок-рижик (Neogobіus eurycephalus K.); камбала-глоса (Platіchthys flesus L.), скорпена (Scorpaena porcus L.). Рибу відловлювали в Керченській протоці, на Експериментальній базі ПівденНІРО (с. Заповітне, Крим), у районі Кара-Дага і Севастополя. Частину матеріалу для проведення досліджень надав Експериментальний кефалевий завод ЧВОРП «Антарктика» (с. Біленьке, Одеська область).

У роботі задіяний спеціально виготовлений експериментальний стенд, який дозволяв підтримувати задану PО₂ у воді і температуру протягом необмеженого часу, а також регулярно робити заміну води для видалення метаболітів.

Проби артеріальної і венозної крові здобували відповідно пункцією дорсальної аорти (aorta dorsalіs) і хвостової вени (vena caudalіs). В інших випадках кров брали пункцією венозного синуса (sіnus venosus) чи передсердя серця (atrіum). Як антикоагулянт застосовували гепарин («Rіchter», Угорщина). Зразки м'язової тканини для біохімічних і гістологічних досліджень одержували з великого білого бічного (musculus lateralіs magnus) і поверхневого червоного бічного (musculus lateralіs superfіcіalіs) м'язів, розташованих за спинним плавцем. У донних риб проби червоної м'язової тканини відбирали в районі хвостового стебла.

Методи вивчення кисневого режиму м'язів. Напруження кисню в м'язах (P_mО₂) вимірювали потенціометрично. Використовували склований платиновий мікроелектрод з діаметром кінчика 4-6 мкм. Електроди завчасно постарювали і калібрували (Березовский, 1975). Дифузійний струмінь кисню з потенціалом поляризації 0,55-0,65 V реєстрували за допомогою підсилювача постійного струму ОР-925 («Radelkіs», Угорщина) і потенціометра КСП-4. Як допоміжний електрод застосовували стандартний каломельний електрод. Напруження кисню в пробах артеріальної (P_aО₂) і венозної (P_vО₂) крові вимірювали на кислотно-лужному аналізаторі ОР-210 («Radelkіs», Угорщина) з використанням стандартного кисневого електрода Е 5046 («Radіometer», Данія). Об'ємний кровотік (Q) у червоних і білих м'язах вимірювали методом H₂-кліренсу з електрохімічною генерацією водню, адаптованого до застосування на водяних тваринах (Вязовой и др., 1982) з використанням платинового мікроелектрода (діаметр 150 мкм, довжина 3 мм).

Насичення артеріальної (S_aО₂) і венозної (S_vО₂) крові киснем визначали шляхом фотометрування проб при 540, 560, 580 нм (Houston, 1990) з наступним розрахунком концентрації оксигемоглобіну або встановлювали, виходячи з величин P_aО₂ і P_vО₂, за кривою дисоціації оксигемоглобіну, вводячи поправку на зсув рН.

На підставі отриманих величин розраховували швидкість споживання О₂ м'язовою тканиною (V_mО₂) і її дифузійну здатність (D_mО₂), швидкість масопереносу О₂ артеріальною (V_aО₂) і венозною (V_vО₂) кров'ю, гемодинамічний еквівалент (НЕ).

Методи вивчення капілярної мережі м'язів. При оцінці щільності капілярної мережі застосовували ін'єкційний метод Огнева (Шошенко и др., 1984) і безін'єкційний метод Слонимського (Киселева и др., 1983). На поперечному зрізі тканин (товщина 25-30 мкм) підраховували кількість капілярних і м'язових одиниць, а також визначали їхній діаметр, використовуючи окуляр-мікрометр. На поздовжних зрізах вимірювали довжину капілярних одиниць.

На підставі отриманих значень розраховували величину капілярного резерву, радіус Крога (R_K), площу капілярної стінки (S), обсяг тканинного циліндра (V) і поверхневий показник (ПП).

Морфо-функціональні методи дослідження червоної крові. Вміст гемоглобіну в крові визначали за допомогою гемиглобінціанідного методу, використовуючи стандартний набір реактивів (НПО «Биолар»). Кількість еритроцитів у крові підраховували в камері Горяєва (Стенко, 1975). Гематокрит визначали шляхом центрифугування зразків крові в капілярах (750 g; 30 хвилин). На підставі отриманих значень розраховували еритроцитарні індекси: MCV, MCH і MCHC.

Криві кисневого насичення крові будували за методом Таккера в модифікації Кляшторина і Саликзянова (1980). Вимірювання виконували при PCO₂ у газовому середовищі тонометра - 4,0 і 10,7 гПа і температурі 15^оС, паралельно реєструючи рН розчину. На підставі отриманих значень розраховували величини ефекту Бора і коефіцієнта Хілла. Величину рН у пробах артеріальної і венозної крові визначали мікрометодом на кислотно-лужному аналізаторі ОР-210 («Radelkіs», Угорщина). Вплив АТР на кисневозв'язуючі характеристики розчинів гемоглобіну оцінювали за зміною величини показника Р₅₀ у відповідь на введення в інкубаційне середовище тонометра АТР (кінцева концентрація 70 мкМ г^-1 Hb).

Фракціонування очищених гемолізатів здійснювали за допомогою вертикального диск-електрофореза в поліакриламідному гелі (Стародуб, 1979). Концентрація акриламіду - 7%. Офарблювали електрофореграми кумаси брильянтовим блакитним (G-250) і бензидиновим реагентом на гемові групи (Маурер, 1971). Денситометрування проводили на денситометрі «Carl Zeіss» (Німеччина). У ряді випадків фракції гемоглобіну елюювали з гелевих блоків (Стародуб, 1979) і вивчали їхні кисневозв'язуючі властивості. Концентрували зразки за допомогою мембран фірми «Amіcon» (США).

Вміст NTP у клітинах червоної крові і розчинах визначали шляхом гідролізу лабільного фосфату (Крикливый и др., 1979). Концентрацію Mg²⁺ і Cl^- в еритроцитах оцінювали фотометрично, використовуючи набори реактивів («Lacheme», Чехія). Концентрації Na⁺ і К⁺ у плазмі крові і гемолізатах визначали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 у суміші пропан-повітря (Комаров и др., 1976).

Активність Na^+,К⁺-АТРази зразків еритроцитарних мембран визначали в інкубаційному середовищі складу: 3 mМ Na₂ATP, 100 mМ NaCl, 20 mМ KСl, 3 mМ MgCl₂, 10 mМ гістидину (рН 7,4), 5 мкг білка клітинних мембран. Як інгібітор застосовували уабаїн. Звільнений неорганічний фосфат у пробі оцінювали методом Фіске, Суббароу (Кочетов, 1980). Білок у пробах контролювали методом Бредфорда (Sedmak, Grossberg, 1977). При оцінці активності гексокінази в еритроцитах використовували інкубаційне середовище складу: 100 mМ трис-HCl буфера (pН 7,4), 2 mМ MgCl₂, 0,2 mМ NADP, 2 mМ Na₂ATP, 20 mМ глюкози, 0,2U глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, 0,1 мл гемолізату. Температура - 15^оС.

Вміст води в крові оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах WP-11 (Польща) свіжої і висушеної до постійної ваги при 105^оС краплі крові. Осмотичну резистентність еритроцитів визначали за допомогою мікроскопічного методу Яновського. Кислотні еритрограми будували згідно з методом Гітельзона, Терскова (Стенко, 1975).

Мазки крові і відбитки пронефросу фіксували в метанолі й офарблювали методом Паппенгейма (Стенко, 1975). На препаратах підраховували число незрілих еритроїдних форм. Для оцінки темпів їхньої проліферації використовували метод авторадіографії (Киселева и др., 1983). Як радіоактивний попередник синтезу DNA (S-період) застосовували ³Н-тимідин.

Біохімічні дослідження плазми крові і скелетних м'язів. Вміст глюкози в плазмі визначали орто-толуїдиновим методом, використовуючи стандартний набір реактивів (НПО «Биолар»). Одночасно вимірювали вміст лактату ферментативним способом (Комаров и др., 1976).

Концентрацію АТР у м'язах визначали методом Лампрехта, Тротшольда (Ещенко, 1982). Вміст лактату в м'язовій тканині в цих же гомогенатах оцінювали ферментативним методом Хохорста (Ещенко, 1982). Сумарний вміст ліпідів у червоних і білих м'язах визначали фотометрично за реакцією з фосфованілиновим реагентом (Кучеренко, Васильев, 1985). Використовували стандартний набір реактивів фірми «Lacheme» (Чехія). Рівень міоглобіну в м'язах оцінювали фотометрично за методикою Рейнафарье (Reynafarіe, 1963). Кількісне визначення вмісту цитохромів (aa₃, b, c, c₁) проводили за методом Чанса в модифікації Євдотієнко, Мохової (1967). Активність аланінамінотрансферази (АлАТ) у м'язах оцінювали динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля із застосуванням набору реактивів («Sіmco Ltd» Україна).

Вміст води в м'язах оцінювали шляхом зважування на аналітичних вагах WP-11 (Польща) свіжих і висушених до постійної ваги при 105^оС зразків тканини. Органічну речовину після висушування проб розчиняли в концентрованій HNO₃. У розчинах визначали концентрації Na⁺, K⁺ і Ca^2+. Виміри здійснювали на полуменевому фотометрі ПАЖ-3 з використанням суміші пропан-повітря (Na⁺, K⁺) і ацетилен-повітря (Ca²⁺).

Загальні фізіологічні методи. У ряді експериментів визначали інтенсивність споживання кисню рибами, частоту дихання і серцевих скорочень, критичні і граничні концентрації кисню. Споживання кисню оцінювали респірометрично. Вміст кисню контролювали за допомогою оксиметра АК-04 (НПО «Сигма») і потенціометра КСП-4. Критичні і граничні концентрації кисню визначали за методикою перерваного потоку [Кляшторин, 1977]. Пневмограму і пульсограму реєстрували з імплантованих у тіло риб електродів. Запис робили за допомогою підсилювача ОР-925 («Radelkіs», Угорщина) і потенціометра КСП-4.

Розділ 4. Фізіологічні аспекти дії уретанової анестезії на організм морських риб. Визначення ефективних концентрацій уретану

Цей етап передував основній частині роботи. Його необхідність була спричинена тим, що під час визначення низки показників здійснювалась активна маніпуляція з тваринами, що приводило до виникнення стану handlіng стресу. У дослідницькій і рибоводній практиці застосовуються десятки анестетиків. Однак, багато з них справляють очевидний асфіксичний ефект, а фізіологічні аспекти дії інших досліджені слабко. У представленій роботі як анестезуючий препарат обрано уретан. Він м'яко впливає на респіраторний і серцево-судинний центри. Ефект після дії уретану не виражений, оскільки кінцевими продуктами є СО₂, NH₃, H₂O (Veenstra et al., 1987; Белокопытин, 1993). Однак, цих відомостей не вистачає для практичного застосування зазначеного препарату, оскільки відсутня інформація про стадії наркотичного стану та його вплив на процеси тканинного дихання. Дослідження показали, що уретанова анестезія викликає у риб розвиток 3-х послідовних станів: спокою, збудження і глибокого наркозу.

· Період спокою зберігався тривалий час (до 1,5 години) і спостерігався в надто широкому діапазоні концентрацій уретану у воді, що знижувало імовірність передозування наркотичного агента. В особин зникала реакція переляку, а фізіологічний стан носив стійкий характер. Споживання кисню, дихальна і серцева ритміка, число еритроцитів і концентрація гемоглобіну в крові риб зберігалися на рівні контрольних величин. Посилення анаеробних процесів не відзначали, про що свідчили постійні значення P_vО₂, вміст глюкози і лактату в плазмі крові.

· Період збудження збігався з втратою координації рухів, деякою інтенсифікацією обмінних процесів і ростом варіабельності значень контрольованих показників, зокрема, дихальної і серцевої ритміки.

· При глибокому наркозі спостерігалися припинення рухової активності, прогресуюче зниження частоти дихання і серцевих скорочень, розвиток тканинної гіпоксії. Споживання кисню особинами зменшувалося більш, ніж у 3 рази, а P_vО₂ - у 2 рази (p<0,001). Одночасно відбувалося зростання концентрації лактату і глюкози в плазмі крові на 60-65% (p<0,001).

Початкова стадія уретанової анестезії (період спокою) була обрана надалі як оптимальна для роботи. На цій підставі були визначені ефективні концентрації анестетика для 6-ти пелагічних і 6-ти донних видів морських риб, а також вивчена їх залежність від температури, солоності і концентрації кисню в морській воді. Ці розробки були використані при виконанні основної частини дисертаційної роботи.

Розділ 5. Порівняльне вивчення кисневих режимів м'язової тканини морських риб різної природної рухливості

Порівняльні дослідження виконані на 10-ти видах морських риб, які відрізняються толерантністю до температури, солоності, вмісту О₂ у воді, а також природною рухливістю. В схожих умовах вмісту: щільність посадки - 50-80 л на особину, фотоперіод - 12 год день: 12 год ніч, температура води - 15+1^оС, добовий харчовий раціон - 6-7% від маси тіла, найбільш радикальні відмінності були виявлені між пелагічними і донними видами.

Кисневий режим скелетних м'язів. Напруження кисню в артеріальній і венозній крові пелагічних риб було на 78,3-212,5% (p<0,001) вищим, ніж у донних (табл. 1). Артеріо-венозна різниця за PО₂ майже в 2 рази (p<0,001) перевищувала аналогічні значення, зареєстровані для малорухливих риб. Вищі значення PО₂ були відзначені і для обох типів скелетних м'язів (P_rО₂ і P_wО₂).

Напруження кисню в крові і м'язах риб різної рухливості

Розрахунок середньокапілярного (P_cО₂) і середньом'язового (P_mО₂) напруження кисню дозволив визначити існуючий градієнт PО₂ між кров'ю і скелетними м'язами (P_m-сО₂). Значення цього показника у активних видів у 1,8-2,5 рази перевищували (p<0,001) аналогічні величини у донних риб (табл. 1). Це означає, що дифузія кисню в їх м'язовій тканині відбувалася з більшою швидкістю.

Аналіз характеру розподілу PO₂ в червоних м'язах пелагічних видів показав, що основна маса значень - 78,2-86,4%, припадала на діапазон 22,0-42,0 гПа (рис. 1). Поряд з високим локальним PO₂ (близько 60 гПа), траплялись абсолютно аноксичні зони і зони з дуже низьким напруженням кисню (менш 8 гПа). Частка останніх становила 2-4%. У представників донної фауни максимуми кривих розподілу PO₂ знаходилися в області більш низьких значень. Розподіл PO₂ у тканині мав більш складний характер. Близько 80% усіх значень знаходилося в районі 6,0-24,0 гПа. Частка аноксичних і гіпоксичних зон (менш 8 гПа) у донних видів була в 2,8-12,5 рази вища, ніж у пелагічних, і складала 11-25%.

Діапазон зміни PO₂ у білих м'язах збігався у всіх досліджуваних риб - 0-20 гПа. Однак, у порівнянні з донними видами, максимуми на гістограмах розподілу у пелагічних риб знаходився на 2-4 гПа праворуч. У 39,0-67,0% білих м'язів пелагічних риб PO₂ не перевищувало 8 гПа. У донних видів ця величина була значно вища і досягала 81,0-84,0%.

Масоперенос кисню в м'язовій тканині пелагічних риб був у 4,1-12,4 рази вищий (p<0,001) аналогічних значень, зареєстрованих для донних риб, і становив відповідно 0,3-0,7 і 0,5-1,0 мл О₂ хв^-1 100^-1 г для венозної й артеріальної крові. Розходження були обумовлені більш високими значеннями об'ємної швидкості тканинного кровотоку - 14-20 і 3-6 мл хв^-1 100^-1 г для червоних і білих м'язів, відповідно, і підвищеною кисневою ємністю крові - 14-20 мл л^-1 (артеріальна кров), у рухливих видів.

Розрахунок дифузійної здатності м'язової тканини (D_mО₂) показав, що у активних видів вона була на 89,7-338,5% вища (p<0,001), ніж у донних риб і складала 33-55 мл O₂ хв^-1100 г^-1 гПа^-1 (10^-4). Це обумовлювалося високою часткою червоної мускулатури в скелетних м'язах пелагічних риб, підвищеною щільністю капілярної мережі, високим вмістом ліпідів і міоглобіну в м'язовій тканині, а також низьким рівнем її гідратації. Сполучення цих властивостей забезпечувало активним видам риб зростання площі дифузійної поверхні, зниження товщини дифузійного шару і полегшення дифузії кисню в м'язовій тканині.

Молекулярні системи утилізації кисню. Утилізація кисню м'язовою тканиною у пелагічних риб у стані спокою склала 26,0-28,4%, що відповідає 0,146-0,271 мл О₂ хв^-1 100 г^-1. У донних риб% утилізації кисню м'язовою тканиною був вищий - 34,7-42,8%, але абсолютні значення швидкості споживання кисню не перевищували 0,050 мл О₂ хв^-1 100 г^-1, що відбиває нижчу інтенсивність енергетичного обміну. Ефективність утилізації кисню у активних видів була вища. Це відбивають більш низькі значення гемодинамічного еквівалента (HE). Розходження за даним показником досягали 45% (p<0,001).

М'язи пелагічних риб відрізнялися підвищеним рівнем цитохромів у порівнянні з донними видами. Розходження досягали 2,6-9,2 разів (p<0,001). Максимум відзначали у високорухливої ставриди - 96,6+7,0 і 7,1+0,7 нмоль г^-1, відповідно для червоних і білих м'язів, а мінімум у донного мартовика - 10,5+1,4 і 1,2+0,2 нмоль г^-1. Принципові відмінності між цими групами риб відзначали в організації цитохромних систем. У донних видів вміст цитохрому aa₃ у м'язах обох типів на 23,9-58,7% (p<0,05) перевищував рівень цитохромів b, c, c₁. Відношення b/aa₃, c₁/aa₃ і c/aa₃ були менше одиниці, тобто для м'язової тканини донних видів була характерна нескомпенсована стехіометрія цитохромів. У активних риб, навпаки, стехіометрія цитохромів була близька до стехіометрії цитохромів наземних тварин. Рівень цитохрому aa₃ у червоних і білих м'язах був мінімальний. Найбільш показові розходження між донними і пелагічними видами по відношенню b/aa₃ - у 2,4-3,1 рази (p<0,001).

Концентрація АТФ у білих м'язах пелагічних риб була на 22-140% (p<0,05-0,001) вища, ніж у донних видів. Для червоних м'язів таких розходжень не встановлено. Близькі результати отримані й у відношенні концентрації лактату в тканині. Величина рН артеріальної і венозної крові у малоактивних видів була нижча, ніж у пелагічних риб. Слід особливу увагу звернути на артеріо-венозну різницю (рН_a-v). У донних риб вона була в 2,3-4,2 рази вища (p<0,001). Це, очевидно, відбиває більш високий відсотковий вміст білих м'язів у тілі донних риб, рівень анаеробних процесів у яких вищий.

Молекулярні системи транспорту кисню. Киснева ємність крові (С_maxО₂) у рухливих видів на 38,3-98,9% (p<0,001) перевищувала значення, відзначені для донних риб. Це обумовлювалось розходженнями в концентрації гемоглобіну і числі еритроцитів в циркулюючій крові. MCH мав обернену залежність. У малорухливих видів він був на 30-45% вищий (p<0,01-0,001).

Максимальну спорідненість крові до кисню відзначали у малоактивних риб. Величина P₅₀ при PCO₂ - 4 гПа і температурі 15^oС дорівнювала 15,7-19,4 гПа. У пелагічних видів вона була на 25,8-113,6% (p<0,001) вища: 24,4-33,5 гПа. Коефіцієнт Хілла (n), що відбиває характер взаємодії субодиниць у молекулі гемоглобіну при її оксигенації, у пелагічних риб на 16,1-56,8% (p<0,001) перевищував значення, зареєстровані для донних видів. Зміни PСО₂ інкубаційного середовища в діапазоні 4,0-10,7 гПа (15^oС) викликало у рухливих риб значне збільшення P₅₀ (ефект Бора - r). Максимальний зсув кривих оксигенації відзначали у активної ставриди (-0,53+0,02). У донних видів він був менш виражений. Слід зазначити, що гемоглобіни донних риб функціонували в середовищі з більш низькими значеннями pН. Це, очевидно, і визначало їхню низьку чутливість до зазначеного чинника.

Відомо, що ATP і GTP у риб є основними регуляторами спорідненості гемоглобіну до кисню (Wells et al., 1997; Val, 1999). У даній роботі показано, що концентрації нуклеотидтрифосфатів (NTP) в еритроцитах донних і пелагічних риб були близькими. Однак, концентрація Mg²⁺ в клітинах червоної крові донних видів на 38-125% (p<0,01-0,001) перевищувала значення, відзначені для активних риб. Mg²⁺ є конкурентом гемоглобіну за ATP (Houston, Koss, 1984). Відношення Mg²⁺/NTP в еритроцитах у малорухливих видів було в 2,5-4,8 рази вище (р<0,001). Це означає, що участь NTP у корекції спорідненості крові до кисню у пелагічних риб було більш виражене.

Експеримент із гіподинамією. Для уточнення впливу гіподинамії на кисневий режим скелетних м'язів був виконаний експеримент на піленгасі. Досліджувану групу риб утримували протягом 5-ти місяців у сажалках розміром 1 м³ по 5-6 особин на кожну. Умови утримування виключали активне переміщення особин. Контрольна група риб знаходилася в бетонних басейнах, розміром 80х4 м. Її фонову рухову активність не було обмежено. Експозиція - 5-ть місяців.

Гіподинамія викликала зниження значень P_mО₂ на 28,6% (p<0,001). У досліджуваної групи вони становили 20,0+0,7 гПа. В розподілі P_mО₂ відзначали зсув максимуму ліворуч на 7-8 гПа (рис. 2). Частка гіпоксичних зон (менше 8 гПа) у м'язовій тканині зростала в 2 рази і досягала 10%. Подібні зміни відбувалися в білих м'язах. Щільність капілярних одиниць у м'язах піленгаса протягом експерименту зменшувалася на 20-28% (p<0,001).

Обмеження рухової активності приводило до зниження рівня гемоглобіну в крові з 88,3+1,3 до 77,1+2,0 г л^-1 (p<0,001). Показник P₅₀ зменшувався на 22,0% (p<0,01), що відбивало збільшення спорідненості крові до кисню. Концентрація NTP в еритроцитах залишалася на рівні контрольних значень. Чутливість гемоглобіну піленгаса до pН (ефект Бора) знижувалася на 25,6% (p<0,01).

Сумарний вміст цитохромів у м'язовій тканині піленгаса в ході експерименту зменшувався на 42,0-58,7% (p<0,001) (рис. 3). Зміни торкалися червоних і білих м'язів. Найбільшого зниження зазнавав цитохром b, тобто дихальний ланцюг мітохондрій за характером організації наближався до нескомпенсованого типу.

Таким чином, результати порівняльного аналізу й експериментальних досліджень показали, що зменшення рухової активності риб призводить до зниження тканинного PO₂, збільшення числа гіпоксичних зон у тканині і зниження рН внутрішнього середовища організму. Це супроводжується функціональними і структурними перебудовами молекулярних систем транспорту й утилізації О₂, які обмежують їхню потужність, знижують їх чутливість до pН і забезпечують адаптацію до умов низького PO₂ у тканині.

Розділ 6. Експериментальна гіпоксія і кисневі режими м'язової тканини морських риб

Для виявлення функціональних механізмів корекції кисневого режиму скелетних м'язів морських риб поміщали в умови експериментальної гіпоксії. Використовували окремих представників пелагічної і донної іхтіофауни.

Пелагічний вид. Експерименти виконані на сингілі. Контрольна група риб утримувалась при PO₂ у воді 158-162 гПа (8,0-8,5 мг л^-1). Досліджувані групи - при 85 гПа, 55 гПа і 35 гПа. Експозиція - 15 діб. Відбір проб здійснювали на 1-2-у, 10-у і 15-у добу дослідження. Температура води - 15+1^оС.

Зниження PO₂ у воді викликало зменшення P_aО₂ на 22,4%, 47,1% і 63,8% (p<0,001) відповідно при 85, 55 і 35 гПа. У м'язах помітне зниження P_mО₂ відзначали, лише починаючи з 55 гПа. У білих м'язах воно склало 15,1% (p< 0,01), а в червоних - 28,5% (p<0,001). При 35 гПа зміни були ще більш виражені. Утримування особин при 55 гПа протягом 15-ти діб супроводжувалося майже повною компенсацією відзначених вище змін. При 35 гПа цього не відмічали. Загибель риби при 35 гПа на 3-ю добу дослідження становила 100%.

Аналіз стану кефалей, утримуваних при 55 гПа, дозволив виявити дві групи процесів, які забезпечують спрямовану корекцію тканинного PO₂.

· На початку (1-2 доба) відзначалося збільшення щільності функціонуючої капілярної мережі (N_c), підвищення швидкості тканинного кровотоку (Q) і випорожнення кров'яних депо (вага селезінки зменшувалась на 34,1%, p<0,001). Це підвищувало кисневу ємність крові (C_aО₂) і в остаточному підсумку величину масопереносу кисню артеріальною кров'ю (V_aО₂) (термінова адаптація).

· Потім (10-15 доба) відбувалися кількісні перебудови на рівні гемоглобінової системи, що приводять до збільшення спорідненості крові до O₂ і зниження її чутливості до рН, а також адаптація дихального ланцюга мітохондрій м'язів до умов низького PO₂ (довгострокова адаптація).

У гемоглобіновій системі кефалей було виявлено 5 компонентів: 3 основних і 2 мінорних. В умовах гіпоксії вміст 3-го компонента (R_f - 0,198+0,005) підвищувався на 40,3% (p<0,001). При цьому частка 4-го знижувалася на 21,8% (p<0,001). Третій компонент мав більш високу спорідненість до O₂ і менш виражений ефект Бора (P₅₀: 13,7 гПа; r: -0,27), ніж 4-ий (P₅₀: 19,5 гПа; r: -0,48). Перебудова повинна була підвищувати спорідненість крові до O₂ і знижувати її чутливість до рН, що дійсно мало місце. Рівень NTP в еритроцитах при цьому не зазнавав статистично значущих змін.

Загальний рівень цитохромів при адаптації до 55 гПа в червоних м'язах підвищувався на 10,1% (p<0,01), а в білих - на 15,6% (p<0,01). При цьому відзначали зміну стехіометрії цитохромів. Індекс b/aa₃ наближався до одиниці: 1,74+0,05 (контроль), 1,06+0,06 (55 гПа: 15 доба), тобто дихальний ланцюг за характером організації наближалася до гіпоксичного типу.

Донний вид. Експерименти виконані на кругляку. Контрольна група риб утримувалася при PO₂ у воді 158-162 гПа (8,0-8,5 мг л^-1). Досліджувані групи - при 45 гПа, 25 гПа і 15 гПа. Експозиція - 15 діб. Відбір проб здійснювали на 1-2-у, 10-у і 15-у добу експерименту. Температура води - 15+1^оС.