Биологическая активность бионаночастиц серебра, полученных методом "зеленого" синтеза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Применение бионаночастиц серебра в медицине

1.2 Основные методы получения бионаночастиц серебра

1.2.1 Получение бионаночастиц серебра методом химического восстановления в растворах

1.2.2 "Зеленый синтез": получение бионаночастиц с использованием растений

1.3 Физико-химические свойства бионаночастиц сереба

1.4 Зависимость форм и размеров бионаночастиц серебра

1.4.1 Методы измерения размеров бионаночастиц

1.5 Химический состав и свойства чистотела большого

2. Эксперементальная часть

2.1. Материалы и методы исследований

2.1.1. Растительный материал и приготовление вытяжек из лекарственного сырья

2.1.2 «Зеленый» синтез бионаночастиц серебра модифицированных соком

2.1.3 Оценка фунгицидных свойств бионаносеребра

2.1.4 Статистическая обработка результатов

2.2 Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1 Фунгицидные эффекты лекарственного растения Chelidonium majus по отношению к патогенному грибу Fusarium оxysporum

2.2.2 Фунгицидные эффекты лекарственного растения Chelidonium majus с взаимодействием наночастиц серебра (AgSo4) по отношению к патогенному грибу Fusarium оxysporum

Выводы

Список использованных источников

Введение

В последнее время интерес в развитии новых стратегий для формирования бионаночастиц серебра проистекает от их потенциального применения в различных областях физики, химии, биологии, медицины и материаловедения [Murraya et al., 2008]. Также большой интерес представляет «зеленый» синтез бионаночастиц (БНЧ), в частности на основе ионов серебра в сочетании с экстрактами лекарственных растений, которые оказывают усиленную антимикробную активность [Абдрахимова с соавт., 2014].

В настоящее время большое распространение получают материалы с бионаночастиц (БНЧ) серебра. Такой интерес обусловлен тем, что включение в состав материала бионаночастиц Ag придает ему фунгицидные и антимикробные свойства [Ravindra et al., 2010]. Известно, что коллоидые растворы серебра эффективны против более 650 видов микроорганизмов, в то время как антибиотики обычно активны против 5-10 видов. Необходимо отметить также, что привыкание БНЧ серебра не вырабатывается, как это наблюдается при использование обычных антибиотиков. Это объясняется тем, что одноклеточные организмы не могут мутировать в формы устойчивые к действию БНЧ серебра.

Коллоидные растворы и покрытия с бионаночастицами серебра могут применяться в таких областях как:

1) медицина и здравоохранение:

- более быстрое заживления ран,

- предотвращение грибковых поражений,

- медицинская диагностика,

2) продукты гигиены,

3) защитные ткани,

4) производство спортивной одежды.

Применение препаратов и материалов на основе БНЧ серебра в медицине возможно, если при их производстве не использовались токсичные для человека восстановители (растворы аммиака, щелочные и т.п.). Таким образом, особые требованиями к наноматериалом, которые используются для биомедицинских применений стимулирует интерес к получению БНЧ серебра методом «зеленой химии». С другой стороны,такие методы обычно сочетают в себе невысокую стоимость исходных материалов, биосовместимость, наличие природного реагента восстановителя, поверхностно активных веществ (ПАВ), которые играют роль стабилизаторов комплексообразователей- все это способствует получению «в одном флаконе» стабильных гидрозолей БНЧ серебра.

Последние исследования в данной области посвящены получению коллоидных растворов серебра с использованием экстрактов растений [Begum et al., 2009]. Можно предположить, что уникальное соотношение между восстановителями и ПАВ для различных экстрактов растений приводит к тому, что форма и размеры БНЧ серебра в коллоидных растворах отличаются в зависимости от используемого экстракта. Есть данные собраны из различных источников, которые отражают зависимость формы и размеры БНЧ серебра от используемого экстракта растений. Однако оказалось, что при использовании экстрактов в процессе синтеза коллоидных растворов серебра, высоко вероятность получить сферические БНЧ, размер которых в среднем порядка 30 нм. Известно, что с уменьшением размера БНЧ серебра возрастает их противогрибковая антибактериальная активность [Крутяков с соавт., 2008]: при одинаковом содержании металла в гидролизе БНЧ Ag со среднем диаметром 9.8 нм проявляли в 10 раз большую активность, чем частицы со средним размером 62 нм. Таким образом используя экстракты растений в процессе приготовлений коллоидных растворов серебра можно получить БНЧ серебра, способные подавлять рост бактерий и грибковых культур.

Цель настоящей работы - выявление биологической активности бионаночастиц (БНЧ) серебра при инфицировании проростков пшеницы специфическим патогеном Fusarium oxysporum. В связи с этим решали следующие задачи:

- освоить методы «зеленого» синтеза бионаночастиц путем сочетания ионов серебра и экстракта чистотела большого Chelidonium majus L., а также культивирования Fusarium oxysporum для апробации тест-системы;

- оценить влияние БНЧ серебра на ростовые процессы проростков пшеницы на фоне их заражения специфическим патогеном.

1. Обзор литературы

1.1 Применение бионаночастиц серебра в медицине

Бионаночастицы не разрушаются под действием длительного облучения. Их свойства нашли широкое применение в сфере изучения различных биологических процессов и природы явлений. Поэтому, бионаночастицы могут быть использованы для постоянного контроля динамики процессов в клетках живых организмов от недели до месяца. Одним из наиболее важных направлений, в области применения биомаркеров, является их использование для поиска средств для диагностики рака. Когда бионаночастицы серебра объединяются с раковыми антителами, раковые клетки становятся «мечеными» и каждая клетка может быть обнаружена с помощью обычного микроскопа, благодаря «усилению» их свойств [Lok et al., 2007].

В связи со способностью особым образом модифицированных бионаночастиц серебра длительное время сохранять биоцидные свойства, рационально использовать наносеребро не в качестве дезинфицирующих средств частого применения, а добавлять в краски, лаки и другие материалы, что позволяет экономить деньги, время и трудозатраты [Комаров, 2007].

Одной из важнейших задач современной медицины является профилактика и коррекция последствий загрязнения окружающей среды для человека. Эта проблема, помимо возрастания естественного фона радиации, находится в тесной связи с постоянным поступлением в окружающую среду отходов промышленных производств и применяемых в сельском хозяйстве химикатов. Указанная задача относится к числу важных также в связи с расширением арсенала химических соединений в промышленности, быту, медицине и научных исследованиях [Ефимов, 2001].

Так же, при изготовлении имплантируемых устройств применяются наночастицы серебра, которые необходимы в медицинской практике [Singleton, 2004]. В настоящее время существуют два типа имплантируемых инвазивных устройств: устройства, которые полностью имплантированные внутри пациента, и устройства, которые частично размещены в теле. Полностью имплантируемые устройства, такие как клапаны, могут быть загрязнены в имплантациях и требуют профилактического лечения антибиотиками в течение нескольких лет после операции для предотвращения инфекции [Ashkarran et al., 2012]. В отличие от этого, устройства, такие как венозные катетеры склонны к бактериальной колонизации благодаря непрерывному воздействию внешней среды [Lok et al., 2007].

Идеальные свойства антибактериальных покрытий включают длительную активность, высокий уровень бактерицидной и бактериостатической деятельности, способны действовать в отношении широкого спектра бактерий, они так же обладают высокой биосовместимостью и низкой токсичностью [Park et al., 2009].

Нанокристаллические серебряные повязки

Типичные повязки состоят из двух слоев полиэтилена, по формированию «бутерброд», вокруг покрыты слоем из полиэфирной марли. Рандомизированные клинические исследования (РКИ) оценили превосходства в заживлении ран и в лечении ожогов с помощью повязок с нанокристаллическим серебром, а так же протестировали эффективность нанокристаллического серебра. Нанокристаллические повязки существенно ускорили заживление ран у исследуемых пациентов [Huang et al., 2007].

Противовоспалительные свойства бионаночастиц серебра

Противовоспалительная деятельность бионаночастиц серебра может быть опосредована сокращением высвобождения цитокининов [Castillo, 2008], уменьшения лимфоцитов и тучных клеток инфильтрации [Boucher, 2008], и индуции апоптоза в воспалительных клетках [Nadworny, 2008]. Матричные металлопротеназы (ММП) осуществляют воспалительные процессы, так же могут способствовать незаживающим характером хронических язв. Нанокристаллические серебряные повязки значительно снижают ММП уровень, а так же улучшают заживление ран [Wright et al., 2002].

Токсичность наносеребра

Оценка токсичности наносеребра - проблема двоякая. Во-первых, токсичность, возникает от того, одинаковые ли размеры биологических молекул (например, ДНК и белков) и каким образом может взаимодействовать при повреждении ДНК, денатурации белка, и при образовании свободных радикалов. Исследования показали, что наносеребро цитокинично через его взаимодействие с митохондриями и индукции апоптоза с помощью производства активных форм кислорода, которые приводят к гибели клеток [Hsin et al., [2008].

1.2 Основные методы получения бионаночастиц серебра

1.2.1 Получение бионаночастиц серебра методом химического восстановления в растворах

Наночастицы серебра в водных растворах получают путем восстановления ионов серебра с помощью глюкозы, аскорбиновой кислоты, гидразина, боргидрида натрия и других восстановителей. Реакцию восстановления проводят в различных условиях. Восстановление глюкозой проводят при нагревании до 60⁰С. Для увеличения скорости протекания реакции используют гидроксид натрия. Полученные частицы исследуют различными способами: методом рентгеновской дифракции (XRD), методом трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), а также проводились исследования на спектрофотометре. Исследования показали, что в ходе восстановления в водных растворах были получены частицы размером 10 - 20нм, л = 1.5418 A°

К способам управления размерами наночастиц, применяемым в научной практике, относятся: использование полимерных матриц, позволяющих управлять размерами нанокластеров, полимерной защиты; физические методы управления размерами (обработка ультразвуком, облучение рентгеновским излучением и использование токов высокой чистоты). Изменение размера нанокластеров металлов добиваются также варьированием природы восстановителя [Кузьмина с соавт., 2007]. Так, использование боргидрида натрия при восстановлении позволяет в большинстве случаев получить наночастицы серебра с узким распределением по размерам в пределах 2-8 нм. Восстановление более мягким восстановителем, таким как гидразин, приводит к образованию более крупных наночастиц металлов с размерами 15-30 нм. При варьировании условий восстановления возможно получение практически монодисперсных наночастиц. Строение и размер продукта в большой степени зависит от условий реакции таких как температура и концентрация нитрата серебра. Например, когда температура понижается до 120 или увеличивается до 190, в полученном продукте доминируют наночастицы с нерегулярной структурой (формой). Начальная концентрация нитрата серебра должна быть не больше 0.1М, в противном случае будет выпадать в виде осадка металлическое серебро. Наночастицы серебра с различными размерами могут быть получены в результате увеличения времени проведения реакции.

Также известны способы получения наночастиц серебра в неводных средах. Наночастицы серебра с фиксированным размером были синтезированы с помощью модифицированного высокомолекулярного процесса, который предполагает восстановление нитрата серебра с этиленгликолем в присутствии стабилизаторов, таких как поливинилпирролидон [Сергеев с соавт., 1999].

1.2.2 "Зеленый синтез": получение бионаночастиц с использованием растений

Растения способны восстанавливать ионы металлов как на своей поверхности, так и в различных органах и тканях, удаленных от места проникновения ионов. В связи с этим растения используются для извлечения ценных металлов. Подобный процесс в настоящее время называется фитодобычей. Накопленные металлы можно извлекать из убранных растений с использованием агломерационного и плавильного методов. Исследование процесса биоакумуляции металлов в растениях показало, что металлы, как правило, накапливаются в виде наночастиц. Например, растения Brassica juncea (листовая горчица) и Meticago sativa (люцерна посевная) накапливали наночастицы серебра размером 50 нм в количестве до 13.6% от собственного веса при выращивании на нитрате серебра в качестве субстрата [Harris et al., 2008]. Икосаэдры золота размером 4 нм выявлялись в M. Sativa [Gardea - Torresdey etal., 2002], полусферические формы частиц меди размером 2 нм - в Iris pseudocorus (ирис всевдоаировый) [Manceau etal., 2008], выращенных на субстратах, содержащих соли соответствующих металлов [Harris etal., 2008].

В целом механизм синтеза металлических наночастиц в растениях и в растительных экстрактах включает три основные фазы: 1) фазу активации, в процессе которой происходит восстановление ионов металла; 2) фазу роста, в течение которой происходит спонтанное включение мелких соединений наночастиц в наночастицы большего размера (формирование наночастиц за счет гетерогенной нуклеации и роста), что сопровождается увеличением термодинамической стабильности наночастиц, и 3) фазу терминации процесса, определяющую окончательную форму наночастиц [Si S et al., 2007]. бионаночастица серебро пшеница синтез

Процесс образования наночастиц схематически изображен на рисунке.



Рис. 1. Схема синтеза металлических наночастиц в растительном экстракте

Ионы металла связываются с восстаналивающими метаболитами и стабилизирующими агентами, восстаналиваясь до атомов металлов. Полученных комплекс атома металла с метаболитом взаимодействует с другими комплексами, формируя метаболлическую наночастицу, затем происходит рост и слияние отдельных мелких наночастиц в более крупные за счет процесса переконденсации до тех пор, пока частицы не обретут нужный размер и форму, стабильные в данных условиях.

При увеличении длительности фазы роста наночастицы агрегируют между собой, образуя нанотрубки, нанопризмы, наношестиугольники, а так же множество других наночастиц нерегулярной формы [Kim et al., 2010].

В настоящее время для синтеза металлических наночастиц используют различные физические и химические процессы, позволяющие получать наночастицы с заданными свойствами. Однако, несмотря на широкое распространение, это, как правило, дорогостоящие, трудоемкие способы, сопряженные с риском и потенциальной опасностью для окружающей среды и живых организмов. Таким образом, существует очевидная потребность в альтернативных экономически эффективных и в то же время экологически чистых методах производства наночастиц [Sharma et al., 2009].

При получении наночастиц необходимо учитывать их неустойчивость и высокую реакционную способность, которые могут привести к агрегации наночастиц, потере необходимых свойств при взаимодействии с окружающей средой, изменить структуру наночастиц. Это может нарушить эволюционный переход к наноматериалу и в конечном итоге определить низкий уровень качества эксплуатационных характеристик [Минько с соавт., 2013].

1.3 Физико-химические свойства бионаночастиц сереба

В последние годы интерес к бионаночастицам и материалам на их основе растёт лавинообразно в основном из-за их необычных физических характеристик, отличных от свойств соответствующих компактных материалов. Бионаночастицы серебра, как элемента, являются новым классом материала с существенными, по сравнению с макрочастицами, различиями в физико-химических характеристиках, оптических, электромагнитных и каталитических свойствах. В наноразмерном диапазоне практически любой материал проявляет уникальные свойства. Физические свойства наночастиц серебра отличаются от свойств макромолекулярного серебра (например, уменьшение размеров частицы приводит к уменьшению ее температуры плавления [Ling et al., 2009].

Коллоидное наносеребро - продукт, состоящий из наночастиц серебра, взвешенных в воде, содержащей стабилизатор коллоидной системы (Рисунок 2). [Limbach et al., 2007].

Рисунок 2. Электронная микрофотография коллоидных наночастиц серебра

Свойства коллоидного раствора, в том числе и наночастиц серебра, определяются возможностью коагуляции и перекресталлизации, т. е. агрегативной устойчивостью, а также седиментационной устойчивостью и возможностью их окисления кислородом воздуха [Зимон с соавт., 2006].

Метод визуального наблюдения за системой может дать предварительные и общие закономерности относительной устойчивости исследуемой дисперсии. Может быть зафиксировано изменения окраски системы и/или образования осадка в ней. Для наночастиц серебра цвет систем от красного (желто-коричневого) меняется до серого и даже черного. Визуальный метод наблюдения может сыграть определяющую роль при исследовании седиментационной устойчивости [Сумм с соавт., 2000].

НЧ серебра имеют преимущественно сферическую форму и распределены по размерам в диапазоне 2 ч 20 нм. Гидрозоли серебра, полученные восстановлением ионов металла экстрактами растений, практически не влияют на рост дрожжевых грибков. Коллоидные растворы серебра подавляют рост грибковых культур Penicillium sp. Противогрибковая активность коллоидных растворов возрастает с увеличением концентрации серебра в гидрозоле и близка к линейной. Максимальная способность подавлять рост Penicillium sp. наблюдается у коллоидных растворов серебра, которые были получены с использованием экстракта из листьев крапивы. Коллоидные растворы серебра полностью подавляют рост бактерий E.coli и Staphylococcus sp. [ Mohammad etal., 2012].

Таким образом, используя экстракты растений в процессе приготовления коллоидных растворов серебра можно получить НЧ серебра, способные подавлять рост бактерий и грибковых культур [ Mohammad etal., 2012].

1.4 Зависимость форм и размеров бионаночастиц серебра

Типичный размер бионаночастиц серебра - 5-50 нм [Limbach etal., 2007].

Можно предположить, что уникальное соотношение между восстановителями и поверхностно активными веществами для различных экстрактов растений приводит к тому, что форма и размеры НС в коллоидных растворах отличаются в зависимости от используемого экстракта. В таблице 1 собраны данные из различных источников, которые отражают зависимость формы и размера НЧ серебра от используемого экстракта растений [Крутяков с соавт., 2008].

Таблица. 1. Зависимость формы и размера НЧ серебра от используемого экстракта растений.

РАСТЕНИЕ	РАЗМЕР, нм	ФОРМА
Эвкалипт лимонный (Eucalyptus citriodora) экстракт листьев	20	Сферическая
Смоковница бенгальская (Ficus bengalensis) экстракт листьев	21	неправильной формы
Пижма обыкновенная (Tanacetum vulgare)	16	сферическая, треугольная
Мята перечная (Mentha piperita) экстракт листьев	5-30	Сферическая
Ятрофа куркас (Jatropha curcas) Латекс	10-20	Кубическая
Ятрофа куркас (Jatropha curcas) экстракт семян	15-50	Сферическая
Лавсония(хна) (Lawsonia inermis) экстракт листьев	39	квази-сферическая
Шлемник бородатый (Scutellaria barbata) экстракт листьев	5-30	сферическая, треугольная
Гваюла (Parthenium argentatum)	50	неправильной формы
Азадирахта индийская (Azadirachta indica) экстракт листьев	50-100	сферическая, призмы
Пеларгония ароматная (Pelargonium graveolens) экстракт листьев	16-40	Сферическая
Чай (Camellia sinensis)	20	Сферическая
Кофе (Coffea arabica)	25	Сферическая
Гибискус китайский (Hibiscus rosasinensis)	14	Сферическая
Мед	4	сферическая, призмы
Лебеда (марь белая) (Chenopodium album) экстракт листьев	10-30	Сферическая
Алоэ настоящее (Aloe vera)	15	Сферическая
Рапс (Brassica napus) экстракт листьев	13	Сферическая
Китайская капуста (Brassica chinesis var parachinensis) экстракт листьев	11	Сферическая
Перец овощной (Capsicum annuum)	10-40	Сферическая
Молочай шерстистый (Euphor biahirta) экстракт листьев	40-50	квази-сферическая
Паслен (Solanum torvum) экстракт листьев	13	Сферическая
Десмодиум трехцветковый (Desmodium triflorum) экстракт листьев	5-20	Сферическая
Триантема(Trianthema decandra) экстракт корня	10-50	кубическая, шестиугольная
Эвкалипт (Eucalyptus hybrida) экстракт листьев	50-150	Кубическая

Однако оказалось, как видно из таблицы, что при использовании экстрактов растений в процессе синтеза коллоидных растворов серебра, высока вероятность получить, сферические НЧ, размер которых в среднем порядка 30 нм.

Известно, что с уменьшением размера НС возрастает их противогрибковая и антибактериальная активность [Крутяков с соавт., 2008]; при одинаковом содержании металла в гидрозоле НЧ Ag со средним диаметром 9.8 нм проявляли в 10 раз большую активность, чем частицы со средним размером 62 нм. Коллоидные растворы серебра можно синтезировать восстановлением ионов серебра экстрактами из листьев крапивы, плодов шиповника, листьев березы [Begum etal., 2009].

Большое влияние на формирование наночастиц оказывает величина рН растительного экстракта [Gan etal., 2012]. Изменение рН приводит к изменению заряда природных фитореагентов в составе экстракта, что влияет на их способность связывать и восстанавливать катионы и анионы металлов в процессе синтеза наночастиц, а это в свою очередь может влиять на форму, размер и выход наночастиц.

Так, в случае ионов серебра (1+) и порошка клубней Curcuma longa (куркума длинная), существенно больше наночастиц серебра синтезируются при щелочных рН, при которых экстракты могут содержать больше отрицательно заряженных функциональных групп, способных эффективно связывать и восстанавливать ионы серебра [Sathishikumar etal.,2010].

Другой важный фактор, влияющий на формирование наночастиц в экстрактах растений - это температура [Bankar etal., 2010]. Установлено, что в растениях люцерны (M. sativa) треугольные серебряные наночастицы образуются только при температуре выше 30?С [Lukman etal., 2010].

В опытах на экстрактах растения Cassia fistula (кассия трубчатая) обнаружили, что температура может влиять и на структурную форму синтезируемых наночастиц: при комнатной температуре формируются, в основном, серебряные наноленты, тогда как при температуре выше 60?С основную массу составляют сферические наночастицы [Lin et al., 2010]

В связи с ограниченной возможностью растений восстанавливать ионы металлов, эффективность синтеза металлических наночастиц также зависит от электрохимического потенциала иона [Haverkamp et al., 2009].

Так, способность растительного экстракта эффективно восстанавливать ионы металла может быть существенно выше в случае ионов с большим положительным электрохимическим потенциалом (к примеру, Ag⁺ ) , чем в случае ионов с низким химическим потенциалом, таких как ([Ag S₂O₃) ₂ ] ^3- ) [Haverkamp et al., 2009].

1.4.1 Методы измерения размеров наночастиц

В таблице 2 приведены применяющиеся на данный момент методы измерения размеров наночастиц [Kecskes et al., 2003]

Таблица 2.Методы определения размеров наночастиц

Методы анализа	Явления или процессы, лежащие в основе данного метода
Электронная микроскопия	Анализ образца с помощью пучка ускоренных электронов
Просвечивающая электронная микроскопия	Просвечивание образца пучком Электронов с определением размера и внутренней структуры частиц
Сканирующая (растровая) электронная микроскопия	Сканирование поверхности образца пучком электронов с одновременной регистрацией вторичных электронов и получение объемного изображения
Сканирующая зондовая микроскопия	Анализ с помощью зонда, рельефа, поверхности образца
Сканирующая туннельная микроскопия	Анализ рельефа токопроводящих поверхностей путем фиксирования величины тунельного тока, возникающего между острием зонда и поверхностью образца
Атомно-силовая микроскопия	Анализ рельефа и механических свойств поверхностей путем фиксирования величины Ван-дер-Вальсовых сил, возникающих между острием зонда и поверхностью образца
Светорассеяние (метод статистического рассеяния света Фотонная корреляционная спетроскопия (метод динамическогого рассеяния света)	Определение размера частиц по интенсивности рассеянного света Определение размера частиц по коэффициенту диффузии, определяемого путем интенсивности и частотных характеристик рассеянного света
Малоугловое рассеяние (рентгеновских лучей и нейтронов)	Оценка размера частиц по угловой зависимости интенсивности диффузного рассеяния (в области малых углов)
Дифракционные методы (рентгеное-электроно-нейронография)	Диффузия излучения на кристаллической решетке образца с получением дифрактограммы и оценка размеров кристаллов по величине уширения дифракционных максимумов
Седиментация	Определения размера частиц по скорости их оседания
Адсорбционный метод (БЭТ)	Определения удельной поверхности ( размера частиц) образца путем измерения величины низкой температурной адсорбции и инертных газов (азота)

1.5. Химический состав и свойства чистотела большого

(Chelidonium majus L.)

Трава содержит более 20 алкалоидов (хелидонин рисунок 1, хелеритрин, сангвинарин, протопин и др.), эфирные масла, витамин С (аскорбиновая кислота) (от 170 до 1000 мг %), витамин А (каротин) (до 14,9 мг %), флавоноиды, сапонины и органические кислоты (лимонную, яблочную, янтарную и хелидоновую).

Рисунок Общее строение хелидонина

Алкалоиды - это азотсодержащие органические вещества, которые характеризуются высокой физиологической активностью. В малых дозах алкалоиды являются лекарствами, в больших - ядами [Андреева, 2005].

Присутствие алкалоидов в траве составляет 0,27-2,25%, а в корнях -- от 1,90 до 4,1%. Состав алкалоидов является достаточно сложным и по структуре может быть соотнесен к изохинолиновым производным и их различным видам. Следует заметить, что в чистотеле алкалоиды присутствуют как в связанном состоянии с хелидоновой кислотой (по структуре сходна с меконовой), так и свободном. Данное растение характеризуется наличием алкалоидов следующих подгрупп:

- подгруппа протопина, включает протопин, аллокриптопин;

- подгруппа протоберберина, включает берберин, коптизин, стилопин;

- подгруппа бензофенонтридина, включает хелидонин, хелеритрин, хелирубин, сангвиритрин, азотсодержащие соединения -- тирамин, холин, гистамин [Барабанов, 2006].

Алкалоиды чистотела обладают разнообразными свойствами: хел хелидонин оказывает действие, подобное морфину (болеутоляющий и успокаивающий эффект), гомохелидонин действует как судорожный яд, сангвинарин возбуждает секрецию слюнных желез, усиливает перистальтику кишечника, обладает наркотическим действием, протопин тонизирует гладкую мускулатуру матки и снижает порог возбудимости вегетативной нервной системы (нервная система, иннервирующая внутренние органы).

О метоксихелидонине следует, однако сказать, что это не индивидуальный алкалоид, а смесь, как было доказано в 1994 г, трех алкалоидов - (+)-хеламина, (+)-гомохелидонина и (+)-хеламидина в соотношении 67:28:5%, то есть, к предыдущим следует причислить еще два алкалоида. В монографии [Потопальский,1992] кроме этих алкалоидов дополнительно значатся: коризамин, тетрагидрокоризамин, хелидимерин, сангвидимерин, хелидамин, а о спартеине уточняется, что он присутствует в d-, l- и dl-формах.

Согласно требованиям Фармакопеи Украины для аптечной сети в настоящее время используют заготовки травы чистотела, собранной в период цветения. Однако давно известно, что корни растения и его надземная часть отличаются между собой как по составу, так и по соотношению входящих в них алкалоидов. Кроме того, это соотношение колеблется также и в зависимости от условий вегетации, времени сбора сырья и места произрастания чистотела.

В работах чехословацких ученых Ю. Славика и Л. Славиковой с сотрудниками, посвятивших практически все свои труды изучению алкалоидов разных видов растений, достаточно внимания уделено выделению алкалоидов из чистотела большого. Наиболее полно ими изучен алкалоидный состав корней растения [Slavik с соавт., 2005], когда ими было выделено в чистом виде более 480 г алкалоидов (из 68 кг аптечного сырья), что составило 0.71%-ный выход идентифицированных алкалоидов (истинное содержание алкалоидов, надо полагать, заведомо выше). Среди выделенных алкалоидов свыше 63% суммарного состава приходилось на хелидонин, затем шел протопин - порядка 20%, аллокриптопин ~10.5% и гомохелидонин ~ 2%. Чуть меньше 2% пришлось на долю вместе взятых сангвинарина, хелеритрина, хелирубина, хелилютина. Коризамин, берберин и коптизин вместе составили около 1%; стилопин, хеламин и хеламидин ~ 0.1, 0.2 и 0.3%, соответственно.

В алкалоидном комплексе надземной части растения (точнее - листовых пластинках и стеблях) согласно работе [Булатов с соавт., 2006] количественно преобладают третичные бензофенантридины - гомохелидонин и хелидонин. За ними следуют протопины (сам протопин, и -аллокриптопины), четвертичные протоберберины - берберин и коптизин, и наконец, четвертичные бензофенантридины - сангвинарин и хелеритрин. Доминирующими алкалоидами в листьях в начале вегетации являются гомохелидонин и протопин, тогда как хелидонин присутствует в очень небольшом кoличестве. Зато он, наряду с гомохелидонином, преобладает в стеблях. По мере роста растения бензофенантридинов становится все больше в стеблях (почти в 2 раза), а протоберберинов - в листьях (в 3-4 раза).

Относительно процентного содержания алкалоидов в надземной части растения следует отметить, что оно наибольшее сразу после таяния снега (~1,9% -2%), когда биомассы еще мало, а набор алкалоидов невелик. В период цветения, когда накопление биомассы и разнообразие алкалоидного состава достигают наибольших значений, процентное содержание алкалоидов в надземной части растения снижается (~0.82%) и становится вполне сопоставимым с его содержанием в корнях. Основным в смеси алкалоидов надземной части являются гомохелидонин (в корнях его всего лишь ~2 %) и хелидонин. Берберин составляет (в отличие от содержания в корнях) свыше 11 % от суммы алкалоидов и сосредоточен преимущественно в листьях. Сангвинарин и хелеритринобнаружены в основном в стеблях и притом в очень небольших количествах. Однако их содержание к осени резко возрастает (до 9 %)[Волощук, Потопальский, 2010].

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Растительный материал и приготовление вытяжек из лекарственного сырья

В качестве объекта исследований использовали проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) с. Казанская 560, которые выращивали в течение 7 суток при комнатной температуре. В работе было использовано лекарственное сырье: трава чистотела большого (Chelidonium majus L.), собранная в экологически чистых районах Республики Татарстан.

Образцы растительных соков из чистотела большого и были получены следующим способом:

свежие листья (5 г) промывали проточной водопроводной водой и измельчали. Полученную массу заворачивали в 4-6 слоев марли, отжимали между двумя стерильными металлическими пластинами, помещенными в тиски. Полученный сок центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., далее супернатант пропускали через мембранный фильтр Synpor с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный растительный сок разливали в пробирки Эппендорф и хранили при температуре -20 °C. Перед исследованием соки растений разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 1:10 и 1:100.

2.1.2 «Зеленый» синтез бионаночастиц серебра модифицированных соком Chelidonium majus

Образцы бионаночастиц серебра были синтезированы с помощью чистотела большого следующим образом:

Приготовленный сок чистотела большого (7 мл) смешивали с дистиллированной водой (29 мл) и добавили сульфат серебра AgSO4 (0,06 г). Полученный раствор перемешали 2 минуты при температуре 65С в магнитной мешалке, обладающей функцией электроплитки -Hei-Standart. Наблюдали изменение цвета от светло-желтого до коричневого, что свидетельствует образование бионаночастиц серебра. Перед исследованием раствор с бионаночастицами серебра разводили дистиллированной водой до концентрации 1:10; 1:100 и 1:1000. БНЧ серебра добавили к тест-системам (контрольным и зараженным проросткам пшеницы),отсюда получили биологический эффект.

Рисунок 1. Схема «зеленого» синтеза бионаночастиц и их тестирования

2.1.3 Оценка фунгицидных свойств бионаносеребра

Для изучения влияния раствора бионаносеребра на всхожесть семян и рост инфицированных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) с. Казанская 560, семена замачивали на сутки в водопроводной воде со спорами (Кое 500 тыс.спор/мл) фитопатогенного гриба Fusarium оxysporum [Smirnov, 2011]. Затем инфицированные и неинфицированные семена проращивали в темноте, в чашках Петри, на воде (Контроль) и на растворах, разведенных 1:10 и 1:100. Длину побегов и корней проростков пшеницы измеряли на 3 и 7 сутки, выращивания.

2.1.4 Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных математических методов в программе Microsoft Excel. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение в группе не превышало 15%. Различие между группами считали достоверным при Р ? 0.05.

2.2 Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1 Фунгицидные эффекты лекарственного растения Chelidonium majus по отношению к патогенному грибу Fusarium оxysporum

Результаты прорастания семян пшеницы показаны на рисунках:

Рисунок 2. Морфометрические показатели проростков, предварительно обработанных БНЧ серебра, в разных разведениях на фоне инфицирования патогеном.

Контроль - без инфицирования (100%), опыт - с инфицированием.

Рисунок 3. Морфометрические показатели проростков, предварительно обработанных соком чистотела (СЧ) в разных разведениях.

Обозначения те же, что и на рис.2.

2.2.2 Фунгицидные эффекты лекарственного растения Chelidonium majus с взаимодействием бионаночастиц серебра (AgSo4) по отношению к патогенному грибу Fusarium оxysporum

Результаты лабораторных исследований свидетельствуют о том, что сок Chelidonium majus L., значительно подавляли развитие гриба Fusarium оxysporum и в разведении СчAgSo4 1:100 значительно увеличился рост побега, корня и боковых корней, в разведении Сч AgSo4 1:10 рост побегов, корней и боковых корней увеличились чуть слабее. Инфицирование подавляло ростовые процессы в большей степени, чем корней. Сок Ch. majus в малом разведении (контроля) оказал дополнительное ингибирующее действие на фоне заражения грибом, снижая размеры побегов проростков, что приводило к торможению роста. Использование БНЧ серебра практически полностью снимало негативный эффект инфицирования. Это могло быть связано с выделением Fusarium оxysporum в среду гормональных концентраций гиббереллиноподобных соединений [Rademacher et al., 1994].

Таким образом, нами выявлено, что обработка соком Ch.majus при высоких разведениях ингибировала энергию прорастания и всхожесть семян по сравнению с контролем. Следует отметить, что БНЧ серебра снижало рост-ингибирующие действие и самого сока Ch.majus при малом разведении, которое, по-видимому, было обусловлено его токсичностью.

Выводы

1)Полученные методом "зеленого" синтеза бионаночастиц серебра проявляли высокую биологическую активность, что показано с помощью тест-системы инфицированных проростков пшеницы на ранних стадиях прорастания;

2) Заражение специфическим фитопатогеном Fusarium подавляло ростовые процессы более чем на 50%, тогда как обработка БНЧ серебра полностью снимала данный негативный эффект. Более того, при этом наблюдали повышение морфометрических показателей, наиболее выраженное для корней - в 6 и 4 раз для зараженных и незараженных растений, соответственно.

Список использованных источников

1. Абдрахимова Й.Р. Вторичные метаболиты растений: физиологические и биохимические аспекты. Часть 2. Алкалоиды: Учебно-методическое пособие. - Казань: Каз. гос. ун-т., 2009. - 40 с.

2. Андреева И.И., Родман Л.С. Ботаника. -- 3-е, перераб. и доп.. -- М: Колос, 2005. -- С. 399. -- 528.

3. Барабанов Е.И. Ботаника: учебник для студ. высш. учеб.заведений. -- М: Издательский центр «Академия», 2006. -- С. 230-241.

4. Баширова Р.М., Усманов И.Ю., Ломаченко Н.В.//Вещества специализированного обмена растений (Классификация. Функции): учебное пособие /Под ред. Г.П.Яковлева. - СПб.: Спец Лит, 2006. 845 с.

5. Блинова К.Ф. // Ботанико-фармакогностический словарь: справочное пособие. - М.: Высшая школа, 1990. - С.272.

6. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения//Культура клеток растений и биотехнология/ Под ред. Р.Г.Бутенко. - М.: Наука, 1986.-243с.

7. Гаммерман А.Ф. Курс фармакогнозии. - Л.: Медицина, 1967. -703 с.

8. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. -11-е изд. - М.: Медицина, 1990. 400 с.

9. Гринкевич Н. И., Сафронич Л. Н. Химический анализ лекарственных растений: Учеб.пособие для фармацевтических вузов. -- М.: 1983. -- С. 126-132.

10. Ефимов С.Н. Изучение антимутагенной активности природных

биологически активных веществ околоплодника гречихи посевной / С.Н. Ефимов, А.Г. Семенов, Д.Л. Стахеев // Современные проблемы

фундаментальной и клинической медицины: Сборник статей молодых ученых и студентов / результаты 60-ой юбилейной конференции им. Н.И. Пирогова. - Томск, 2001. - С.131-132.

11. Ильинская О.Н. Маргулис А.Б. Краткосрочные тест-системы для определения генотоксичности // (методическое руководство). - К.: Изд. КГУ, 2005. - 30 с.

12. Колычева З.И. Биологическая химия. - Тобольск: ТГПИ им. Д.И.Менделеева, 2003. - С. 174-175.

13. Мвапе И., Абдрахимова Й. Р., Карамова Н.С//Сок растений чистотела большого снижает генотоксический эффект фурацилина. Казань. 2010. С. 253-257.

14. Муравьева Д.А. Фармакогнозия (с основами биохимии лекарственных растений); под ред. Д. А. Муравьева.- М.: Медицина, 1978. - С. 625-627.

15. Монографии ВОЗ о лекарственных растениях, широко используемых в Новых независимых государствах (ННГ)// ISBN 978924 459772 9/2010. 451 с.

16. Палов М., Энциклопедия лекарственных растений// в кн.: Действующие вещества растительного происхождения; Издательство «Мир» - Москва,1998. - С 350.

17. Племенков В. В. Введение в химию природных соединений. -- Казань: 2001. -- с. 253.

18. Попов А.М. Противоопухолевая активность вторичных метаболитов морских беспозвоночных/Вестник ДВО РАН. 2006. №5. С. 81-90.

19. Семёнов А. А., Карцев В. Г. Основы химии природных соединений. -- М.: ICSPF, 2009. -- Т. 2.

20. Потопальский А.И. Препараты чистотела в биологии и медицине. Киев. Наукова думка. 1992., 237с.

21. Фонштейн Л.М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем// Методическое указание.- М.- 1985. - 34 с.

22. Aniszewski, T. Alkaloids -- secrets of life. -- Amsterdam: 2007. -- p. 110--111.

23. Gershenzon J. Plant Defenses: Surface Protectants and Secondary Metabolites. InPlantPhysiology, 3nd ed., L. Taiz, 2003. PP. 347-376.

24. Mitsuoka T, Hidaka H, Eida T., 1987. Effect of fructo-oligosaccharides on intestinal microflora. Nahrung 1987;31:427-436 19

25. Hesse. M. Alkaloids. Nature's Curse or Blessing. -- Wiley-VCH, 2002. -- p. 204.

26. Kada, T. Mutation and environmental studies: Scientific reports of the research project[Text]/T. Kada//Environment cleaning by microorganisms. -2006. - P. 695-648.

27. Vorobijeva, L.I.Abilev S.K. Antimutagenic properties of bacteria: review [Text] / L.I.Vorobijeva,S.K. Abilev//Applied Biochemistry and Microbiology. - 2002. V.38. - N2. -P. 97-107.

28. Spiller G. A., Caffeine. -- USA: CRC Press, 1997. -- Introduction to the chemistry, isolation, and biosynthesis of methylxanthines.

29. Kada, T. Desmutagens and bioantimutagens- their modes of action [Text]/ T. Kada//Bioassays.-2006.-V.7.-P. 113-116.

30. Kada, T. Environmental antimutegens and carcinogens [Text]/ T. Kada, Eds T. Sigimura, S. Kondo, H. Takebe.- 2006.- P. 355.

Список сокращений

БНЧ - бионаночастица

ПАВ - поверхностно активные вещества

Ag - серебро

СЧ - сок чистотела

К - контроль

О - опыт

Размещено на Allbest.ru

...