Індукований морфогенез і клональне мікророзмноження перспективних сортів м'яти

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Нікітський ботанічний сад - національний науковий центр

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.20 - біотехнологія

Індукований морфогенез і клональне мікророзмноження перспективних сортів м'яти

Бугара Ігор Олександрович

Ялта - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано в Інституті ефіроолійних та лікарських рослин УААН.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бугаєнко Людмила Олександрівна, Південний філіал "Кримський агротехнологічний університет" Національного аграрного університету Кабінету міністрів України, завідувач кафедри біотехнології, ефіроолійних і лікарських рослин, селекції і насінництва сільськогосподарських культур.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Митрофанова Ольга Володимирівна, Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, головний науковий співробітник відділу біотехнології і біохімії рослин;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Ігнатова Світлана Олександрівна, Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН та МОН України, завідувач лабораторії культури тканин.

Провідна установа: Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, м. Київ.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Садогурський С.Ю.

Анотація

клональний мікророзмноження морфогенез меристема

Бугара І.О. Індукований морфогенез і клональне мікророзмноження перспективних сортів м'яти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія. Нікітський ботанічний сад - Національний науковий центр УААН, Ялта 2006.

Дисертаційна робота присвячена розробці біотехнологічних прийомів і біотехнологічної схеми клонального мікророзмноження м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів in vitrо.

Показано залежність морфогенезу і регенерації рослин в культурі ізольованих меристем від генотипу, розміру експланта, часу відбору матеріалу (сезонність) і складу живильного середовища. Встановлено, що при культивуванні ізольованих меристем на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, Шенка-Хільдебрандта і Гамборга-Евелега множинне пагоно- і коренеутворення відбувалося протягом одного циклу вирощування культур, а коефіцієнт розмноження складав 1:4,9-1:6,9 залежно від сорту і складу живильного середовища. Вперше розроблено прийоми клонального мікророзмноження сортів м'яти на основі культури ізольованих листкових і стеблових експлантів. Показано, що культура листкових і стеблових експлантів забезпечує вищий коефіцієнт розмноження (1:11-1:31), ніж меристемна культура.

Оптимізовано умови одержання калюсних культур із листкових і стеблових експлантів і показано високий рівень їх гетерогенності за морфологією клітин і вмістом ДНК в інтерфазних ядрах. Розроблено біотехнологічну схему клонального мікророзмноження перспективних вітчизняних сортів м'яти, що дає змогу одержувати необхідну кількість рослин при різних способах регенерації.

Ключові слова: м'ята, індукований морфогенез, клональне мікророзмноження.

Аннотация

Бугара И.А. Индуцированный морфогенез и клональное микроразмножение перспективных сортов мяты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Никитский ботанический сад - Национальный научный центр УААН, Ялта 2006 г.

Диссертационная работа посвящена разработке биотехнологических приемов и биотехнологической схемы клонального микроразмножения мяты сортов Симферопольская 200, Заграва, Украинская перечная, Двухукосная, Прилукская 6 на основе комплекса методов культуры изолированных тканей и органов in vitro. В результате исследований разработаны биотехнологические приемы клонального микроразмножения на основе меристемной культуры. Выявлена зависимость морфогенеза и регенерации растений в культуре изолированных меристем от генотипа, времени отбора материала (сезонности) и состава питательной среды. При культивировании изолированных меристем на модифицированных питательных средах Мурасиге-Скуга, Шенка-Хильдебрандта и Гамборга-Эвелега множественная регенерация растений происходила в течение одного цикла выращивания культуры. Установлена зависимость коэффициента размножения от длительности культивирования. Показано, что максимальный коэффициент размножения (1:5,6-1:6,9) наблюдается на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга на 75-е сутки, на модифицированной питательной среде Шенка-Хильдебрандта (1:4,9-1:5,9) - 45-е сутки, а на модифицированной питательной среде Гамборга-Эвелега (1:5,4-1:6,1) - 30-е сутки культивирования.

Впервые разработаны биотехнологические приемы клонального микроразмножения изучаемых сортов мяты на основе культуры изолированных листовых и стеблевых эксплантов in vitro. Показано, что при культивировании эксплантов молодых листьев на модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга наблюдался прямой органогенез и регенерация растений непосредственно из тканей листа, а в культуре стеблевых сегментов - непрямой морфогенез через образование первичного каллуса. Установлено, что культура изолированных листовых и стеблевых эксплантов обеспечивает более высокий коэффициент размножения (1:11-1:31), чем культура изолированных меристем.

Оптимизированы условия получения каллусных культур из листовых и стеблевых эксплантов и показан высокий уровень их гетерогенности по морфологии клеток и содержанию ДНК в интерфазных ядрах.

Разработана биотехнологическая схема клонального микроразмножения перспективных сортов мяты отечественной селекции, позволяющая получать необходимое количество растений при различных способах регенерации.

Разработанная биотехнологическая схема была апробирована не только для клонального микроразмножения изучаемых сортов мяты, но и двух других сортов - Прилукская карвонная, Удайчанка и четырех перспективных селекционных образцов - 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia ), K 59(4n) (M. canadensis), 94.18.8 (M. citrata x M. longifolia), 92.9.35 (M. citrata K 66 (4n) х M. aquatica K6).

Ключевые слова: мята, индуцированный морфогенез, клональное микроразмножение.

Annotation

Bugara I.A. Induced morphogenesis and clonal micropropagation of perspective mint varieties. - Manuscript.

Thesis for a Ph.D. Degree in Biology, speciality 03.00.20 - biotechnology. Nikitsky Botanical Garden - National Scientific Centre of the Ukrainian Academy of Agrarian Sciences, Yalta, 2006.

The work is devoted to elaboration of biotechnological methods and biotechnological scheme of the clonal micropropagation of varieties mint Simferopolskaya 200, Zagrava, Ukrainskaya perechnaya, Dvuhukosnaya and Prilukskaya 6 on the basis of the culture of isolated meristems, leaf and stem explants in vitro. The dependence between morphogenesis, regeneration of plants in the culture of isolated meristems and genotype, size of explants, time of material selection (seasonality) and composition of nutrient medium was shown. It was established that plural shoot and root regeneration while cultivating isolated meristems on modified nutrient media Murashige-Skoog, Schenk-Hildenbrandt and Gamborg-Eveleigh occured during one cycle of cultivation, and multiplication coefficient was 1:4,9-1:6,9 depending on variaty. The methods of mint sorts clonal micropropagation on the basis of the culture of isolated leaf and stem explants were elaborated for the first time. It was shown that the culture of leaf and stem explants ensures higher multiplication coefficient (1:11-1:31), than meristem culture. The conditions of callus cultures obtaining from leaf and stem explants were optimized and high level of heterogeneity in cell morphology and DNA content in the intherphase nucleus was detected. The biotechnological scheme of the clonal micropropagation of promising domestic mint varieties, that makes it possible to obtain the necessary quantity of plants with different types of regeneration was developed.

Key words: mint, induced morphogenesis, clonal micropropagation.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. М'ята - ефіроолійна і лікарська рослина з широким спектром практичного використання. Сухе листя й ефірна олія м'яти здавна використовуються для виготовлення лікарських засобів, а також у парфюмерно-косметичній промисловості як натуральні ароматизатори. За останні десятиріччя в Україні створено високоолійні сорти м'яти (Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька карвонна, Удайська, Удайчанка, Імла та ін.), що відзначаються високим вмістом ефірної олії, підвищеною врожайністю сухого листя, зимостійкістю і посухостійкістю, стійкістю до іржі, із різним напрямком біосинтезу ефірної олії сортів (Бугаенко, 1985; Шило, 1987; Бугаенко и др., 1999).

На цей час для розмноження м'яти застосовуються виключно традиційні методи - кореневищами і розсадою. Проте, для прискореного впровадження нових сортів у виробництво, а також для швидкого розмноження унікальних селекційних генотипів використання лише цих двох методів вже недостатнє. Необхідно розробити ефективні технології розмноження і виробництва високоякісного посадкового матеріалу на принципово новій методичній основі. Перспектива створення таких технологій пов'язана з розробкою прийомів клонального мікророзмноження на основі комплексу методів культури ізольованих тканин і органів in vitro (Катаева, Бутенко, 1983; Митрофанова, 1997).

Біотехнологічні способи клонального мікророзмноження м'яти розроблені поки-що недостатньо. Наукові роботи здебільшого присвячені вирішенню окремих методичних питань і вивченню можливості використання прийомів in vitro для мікророзмноження видів Mentha piperita L., M. spicata L., M. arvensis L., M. viridis L. і деяких інших (Ono, Jakeda, 1970; Codaccioni, 1982; Repcakova et al., 1986; Pech, Pires, 1986; Shasany et al., 1998; Savithri et. al., 2001; Phannipha et al., 2004 і ін.). Існує значно менше даних щодо використання біотехнологічних методів клонального мікророзмноження сортового матеріалу м'яти, одержаного внаслідок спрямованої селекції (Родов, Давидова, 1987; Русева, Дачев, 1990; Бидюкова, Кириченко, 2001). При цьому нові сорти вітчизняної селекції для подібних досліджень не використовувалися. В зв'язку з цим розробка біотехнологічних прийомів клонального мікророзмноження перспективних сортів м'яти на основі комплексу методів культури ізольованих тканин і органів in vitro є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися у відділі селекції і насінництва Інституту ефіроолійних і лікарських рослин Української Академії аграрних наук відповідно до програм за темами: "Розробити методи клонального мікророзмноження для одержання посадкового матеріалу перспективних ефіроолійних і лікарських рослин" (№ державної реєстрації 01.94U023836); "Створити новий вихідний матеріал для селекції ефіроолійних і лікарських рослин на основі методів клітинної інженерії" (№ державної реєстрації 01.94U023827); "Розробити методи розмноження з використанням культури меристем in vitro для одержання посадкового матеріалу лаванди і м'яти" (№ державної реєстрації 01.94U023845).

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - розробити біотехнологічні прийоми та біотехнологічну схему клонального мікророзмноження перспективних сортів м'яти вітчизняної селекції. В зв'язку з поставленою метою в роботі вирішувалися такі завдання:

оптимізувати умови одержання асептичних культур;

дослідити особливості морфогенезу ізольованих меристем залежно від розміру експланта і часу відбору матеріалу (сезонність);

виявити особливості регенерації рослин в культурі ізольованих меристем на живильних середовищах різного складу;

вивчити особливості морфогенезу і регенерації рослин в культурі листкових і стеблових експлантів;

підібрати умови для адаптації рослин-регенерантів in vivo;

розробити біотехнологічну схему клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових та стеблових експлантів in vitro;

оптимізувати умови одержання калюсних культур і виявити їх цитологічні особливості.

Об'єкт дослідження: культура in vitro ізольованих меристем, листкових і стеблових, калюсна культура.

Предмет дослідження: морфогенетичні реакції і показники регенераційної здатності in vitro експлантів вегетативних органів і калюсних культур м'яти.

Методи дослідження: культура ізольованих тканин і органів рослин; світлова мікроскопія; кількісна люмінесцентна мікроскопія; біометрія і математична обробка результатів експерименту.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для ряду нових перспективних і раніше створених сортів м'яти вітчизняної селекції (Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька 6) виявлено особливості морфогенетичних реакцій в культурі вегетативних органів in vitro і розроблено біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів. Виявлено залежність типу мікророзмноження від генотипу, сезонності відбору, типу і розміру експланта, а також складу живильного середовища. Експериментально показано, що протягом одного циклу вирощування культури на первинному живильному середовищі можливе одержання повноцінних рослин-регенерантів м'яти з ізольованих меристем шляхом індукції множинного пагоноутворення і ризогенезу in vitro.

Вперше розроблено спосіб прямої регенерації рослин в культурі листкових експлантів м'яти. Встановлено, що при культивуванні in vitro стеблових експлантів реалізація морфогенезу і регенерація рослин відбувається непрямим шляхом - через утворення первинного калюсу.

Оптимізовано умови одержання калюсних культур з експлантів вегетативних органів. Вивчено морфологічні і цитологічні особливості калюсних культур, показано високий рівень гетерогенності калюсних клітин за морфологією і вмістом ДНК в інтерфазних ядрах.

Практичне значення роботи. На основі експериментального вивчення закономірностей морфогенезу в культурі ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів м'яти розроблено повний цикл процесу і запропоновано біотехнологічну схему клонального мікророзмноження сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6, починаючи від введення експлантів в ізольовану культуру до адаптації рослин-регенерантів in vivo. Проведено апробацію і показано можливість використання біотехнологічних прийомів для клонального мікророзмноження інших перспективних сортів і селекційних зразків м'яти. На основі розроблених підходів розмножено і передано на Прилуцьку дослідну станцію і в відділ селекції та насінництва ІЕЛР рослини м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Прилуцька карвонна, Удайчанка, а також перспективні селекційні зразки (84.57.2, K59 4n, 94.18.8, 92.9.35) в кількості 626 штук для створення оригінальних маточників і включення в селекційний процес (акти від 03.06.03; 22.12.04; 10.06.05).

Матеріали дисертаційної роботи увійшли в учбові програми курсів "Основи біотехнології", "Основи біотехнології рослин", "Клональне мікророзмноження рослин", "Основи біотехнології одержання ефіроолійної сировини", що викладаються в Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського і Південному філіалі "Кримський агротехнологічний університет" Національного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо здобувачем виконані: розробка схеми дослідів, проведення лабораторних досліджень, математична обробка, аналіз і обговорення одержаних результатів. Разом з науковим керівником складено план роботи, проведено підбір об'єктів і методик досліджень, розроблено структуру дисертаційної роботи і підготовлено наукові публікації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідалися на міжнародній конференції "Сучасні проблеми безгрунтового культивування рослин" (Вірменія, Єреван, 1999), на міжнародній конференції "Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів" (Україна, Харків, 1999), на республіканській конференції молодих вчених Криму "Актуальні питання сучасної біології" (Україна, Сімферополь, 2000), на міжнародній конференції "Сучасні наукові дослідження в садівництві" (Україна, Ялта, 2000), на міжнародній конференції "Вивчення онтогенезу рослин природних культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії" (Україна, Полтава, 2000), на міжнародній конференції молодих вчених "Сучасні проблеми генетики, біотехнології і селекції рослин" (Україна, Харків, 2001), на міжнародному симпозіумі "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources" (Україна, Ялта, 2002), на всеукраїнській конференції молодих вчених "Актуальні питання сучасного природознавства" (Україна, Сімферополь, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 робіт, з|із| них 6 статей в спеціалізованих наукових виданнях і 10 - статті, матеріали і тези наукових конференцій.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 196 сторінках і складається зі вступу, 6 розділів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури (280 джерел, у тому числі 165 іноземних), додатка і містить 20 таблиць і 36 рисунків.

2. Основний зміст роботи

Огляд літератури

У літературному огляді викладено біологічні особливості і традиційні методи розмноження м'яти, а також сучасні літературні дані з клонального мікророзмноження і інших напрямків досліджень з біотехнології видів роду Mentha L.

Матеріал і методи

Матеріалом для проведення досліджень слугували сорти м'яти Сімферопольська 200 (M. canadensis L. К 59 (4n) х М. aquatica L. K 6), Заграва (M. canadensis K 59 (4n) x M. longifolia L. N 6), Українська перцева (M. piperita A₂ (4n) x M. spicata 2.8.14), Двохукісна (M. canadensis K 60 (4n) x M. spicata 2.8.14), Прилуцька 6 (одержаний методом відбору в насінному потомстві алополіплоїдної форми M. piperita).

Для досліджень in vitro рослинний матеріал вирощували в закритому ґрунті. При проведенні експериментальних робіт використовували загальноприйняті методи культури ізольованих клітин, тканин і органів рослин (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980). Ізольовані меристеми, вегетативні бруньки, а також листкові і стеблові експланти культивували на модифікованих нами живильних середовищах Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige і Skoog, 1962), Шенка-Хільдебрандта (ШХ) (Schenk і Hildebrandt, 1972) і Гамборга-Евелега (ГЕ) (Gamborg і Eveleigh, 1968), доповнених індолілоцтовою кислотою (ІОК), 2,4-дихлорфеноксиоцтовою кислотою (2,4-Д), кінетином, 6-бензиламінопурином (БАП). Культуральні посудини з експлантами інкубували в умовах термостатованого приміщення з температурою 25-27^оС, освітленістю 3000-4000 лк, 16-годинним фотоперіодом і відносною вологістю повітря 60-70 %.

Цитоморфологічні дослідження проводили на тимчасових препаратах, приготовлених за загальноприйнятими методами (Дженсен, 1965; Паушева, 1980). Для кількісного визначення ДНК в інтерфазних ядрах калюсних клітин матеріал фіксували за Карнуа (Бродский, 1960). Вміст ДНК в інтерфазних ядрах калюсних клітин визначали на цитофлуориметрі за інтенсивністю флуоресценції комплексу ДНК-олівоміцин (Бородина и др., 1979; Зеленин и др., 1984). Як еталон, прийнятий за 2С, використовували вміст ДНК в інтерфазних ядрах епідермісу молодого листя. Обсяг вибірки складав 30-120 ядер.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили на персональному комп'ютері з використанням прикладного програмного забезпечення Statistika 5.1 і Microsoft Office XP для Microsoft Windows.

Клональне мікророзмноження м'яти на основі культури ізольованих меристем in vitro

Одержання асептичних культур. Для оптимізації умов одержання асептичних культур м'яти були використані традиційні стерилізуючі речовини (гіпохлорити натрію і кальцію, перекис водню, 90% етанол), а також препарат "Брадофен". Кращі результати були одержані при поверхневій обробці матеріалу препаратом "Брадофен" в 50% і 100% концентраціях протягом 5 і 10 хвилин. Дослідження показали, що препарат "Брадофен" при мінімальному рівні контамінації (4,4%) не робив візуально помітної шкодочинної дії на тканини. Експланти зберігали зелений колір і швидше виявляли здатність до морфогенезу, ніж після стерилізації іншими випробуваними речовинами.

Вплив розміру експлантів ізольованих меристем на морфогенез і регенерацію in vitrо. Дослідження показали, що для всіх виучуваних сортів м'яти із збільшенням розміру експлантів ізольованих меристем здатність до морфогенезу і регенерації рослин збільшувалася. Кращу здатність до морфогенезу в умовах in vitro виявляли меристеми з 2-3 парами листкових примордіїв (1,27-1,64 мм). На основі одержаних результатів вся подальша робота з клонального мікророзмноження сортів м'яти базувалася на використанні експлантів ізольованих меристем з 2-3 парами листкових примордіїв.

Залежність морфогенезу і регенерації рослин від часу введення експлантів у культуру in vitro (сезонності відбору). Експлантація ізольованих меристем на живильні середовища з січня по грудень показала, що краща здатність до морфогенезу і регенерації рослин спостерігалася при введенні їх в культуру in vitro на протязі березня-червня (кількість меристем, що розвиваються, 83,9-100%). При експлантації меристем на живильні середовища в липні-серпні, а також в осінньо-зимовий період з вересня по лютий кількість меристем, здатних до морфогенезу, знаходилася на рівні 40,0-75,0%. Проте впродовж всього року ізольовані меристеми сортів Сімферопольська 200, Заграва і Українська перцева відрізнялися вищим морфогенетичним потенціалом.

Особливості морфогенезу і регенерації рослин на живильних середовищах різного складу. Дослідження показали, що кращими живильними середовищами для регенерації рослин і клонального мікророзмноження в культурі ізольованих меристем були модифіковані нами живильні середовища Мурасіге-Скуга (0,5 мг/л ІОК, 0,1 мг/л кінетин, 1,0 мг/л БАП), Шенка-Хільдебрандта (0,5 мг/л ІОК, 0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л кінетин, 1,0 мг/л БАП) і Гамборга-Евелега (0,5 мг/л ІОК, 2,0 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л кінетин, 1,0 мг/л БАП). В процесі культивування ізольованих меристем сортів м'яти на підібраних модифікаціях живильних середовищ множинне пагоноутворення і ризогенез спостерігалися на первинному живильному середовищі протягом одного циклу вирощування культури. Разом з цим було встановлено, що при культивуванні ізольованих меристем на модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга окремі етапи морфогенезу уповільнювались порівняно з культивуванням на інших використовуваних живильних середовищах (табл. 1).

Таблиця 1. Послідовність і терміни проходження етапів морфогенезу в культурі ізольованих меристем на модифікованих живильних середовищах різного складу

Сорт	Приживлення і початкові етапи морфогенезу	Початок регенерації основного пагона	Початок регенерації коренів	Початок множинного пагоноутворення
	МС	ШХ	ГЕ	МС	ШХ	ГЕ	МС	ШХ	ГЕ	МС	ШХ	ГЕ
	кількість діб у культурі
Сімферопольська 200	15-17	8-10	6-9	16-18	12-13	10-11	28-30	18-19	12-13	20-21	18-20	14-16
Заграва	19-21	10-11	7-10	24-25	13-14	11-12	37-38	18-20	14-16	27-29	19-20	16-17
Українська перцева	20-22	11-13	11-12	24-26	17-18	17-18	39-40	24-25	20-21	30-31	29-31	22-23
Двохукісна	24-26	26-28	12-14	28-30	27-29	18-20	44-46	34-36	22-23	33-35	36-38	25-26
Прилуцька 6	25-27	28-29	15-17	29-31	29-30	21-23	47-49	35-37	26-27	34-36	38-39	30-32

Виявлені закономірності свідчать про те, що послідовність морфогенезу і регенерації рослин при культивуванні ізольованих меристем на модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, Шенка-Хільдебрандта і Гамборга-Евелега в значній мірі детерміновані генотипом і складом живильного середовища. Вплив генотипу більшою мірою виявлявся в термінах настання окремих етапів морфогенезу. Разом з тим живильне середовище робило вплив як на інтенсивність, так і на послідовність проходження основних етапів морфогенезу і регенерації рослин in vitro.

Залежність коефіцієнта розмноження від тривалості культивування. В процесі культивування ізольованих меристем виучуваних сортів м'яти виявлено залежність коефіцієнта розмноження від тривалості вирощування культури. На модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга цикл вирощування до максимального коефіцієнту розмноження (1:5,6-1:6,9) складав 75 діб, а на модифікованому живильному середовищі Шенка-Хільдебрандта (1:4,9-1:5,9) - 45 діб. На модифікованому живильному середовищі Гамборга-Евелега максимальний коефіцієнт розмноження (1:5,4-1:6,1) спостерігався на 30-у добу (табл. 2).

Таблиця 2. Кількість мікропагонів на один експлант (коефіцієнт розмноження) залежно від тривалості культивування на різних живильних середовищах, ()

СОРТ

30 діб

45 діб

60 діб

75 діб

МС

ШХ

ГЕ

МС

ШХ

ГЕ

МС

ШХ

ГЕ

МС

ШХ

ГЕ

Сімферопольська 200

1,9±0,3

4,3±0,2

6,1±0,1

3,9±0,1

5,9±0,2

6,1±0,1

5,1±0,1

5,9±0,2

6,1±0,1

6,9±0,1

5,9±0,2

6,1±0,1

Заграва

1,2±0,2

4,1±0,2

5,9±0,1

3,7±0,2

5,7±0,2

5,9±0,1

4,9±0,1

5,7±0,2

5,9±0,1

6,6±0,9

5,7±0,2

5,9±0,1

Українська перцева

0,7±0,2

1,5±0,2

5,6±0,2

2,5±0,2

5,4±0,2

5,6±0,2

4,6±0,2

5,4±0,2

5,6±0,2

6,0±0,4

5,4±0,2

5,6±0,2

Двохукісна

0,4±0,1

0,9±0,3

5,7±0,3

1,7±0,2

5,0±0,4

5,7±0,3

4,4±0,3

5,0±0,4

5,7±0,3

6,1±0,3

5,0±0,4

5,7±0,3

Прилуцька 6

0,2±0,1

0,7±0,1

5,4±0,2

1,5±0,2

4,9±0,5

5,4±0,2

4,1±0,3

4,9±0,5

5,4±0,2

5,6±0,4

4,9±0,5

5,4±0,2

Подальше культивування не приводило до збільшення коефіцієнта розмноження, проте сприяло дальшому розвитку рослин-регенерантів.

Живцювання меристемних мікропагонів in vitro. Для живцювання in vitro меристемні рослини виймали з пробірок, розрізали на фрагменти, що складалися з вузла з однією парою листків, і поміщали на поверхню живильного середовища того ж складу. В процесі вирощування живців спостерігалася регенерація спочатку мікропагонів, а далі коріння. На 45-60-у добу культивування кількість рослин-регенерантів на один експлант досягала 4,6-6,1 залежно від генотипу і складу живильного середовища.

Адаптація рослин до умов in vivo. З метою адаптації до умов in vivo рослини, одержані на основі меристемної культури і живцювання in vitro, переносили в різні субстрати з суміші ґрунту, торфу і керамзиту. Кращі результати вдалося одержати при вирощуванні рослин в субстраті торф - керамзит (1:1). В процесі адаптації до умов in vivo рослини поступово переводили на звичайний режим вирощування в закритому ґрунті. У першій половині травня меристемні рослини висаджували в польові умови і вирощували до фази технічної зрілості.

При порівнянні меристемних рослин м'яти з рослинами, розмноженими традиційним розсадним способом, не було виявлено відмінностей між масовою часткою ефірної олії і вмісту в ній основних компонентів.

Біотехнологічна схема клонального мікророзмноження м'яти на основі культури ізольованих меристем in vitro. На підставі проведених досліджень була розроблена біотехнологічна схема клонального мікророзмноження м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 на основі культури ізольованих меристем in vitro (табл. 3).

Біотехнологічна схема включає проведення ряду послідовних етапів, починаючи від введення експлантів в умови in vitro до адаптації рослин-регенерантів до умов in vivo. Виконання етапів біотехнологічної схеми може базуватися виключно на культивуванні ізольованих меристем. Разом з тим, схема припускає поєднання культури ізольованих меристем з живцюванням in vitro.

Розроблена біотехнологічна схема була апробована не тільки для клонального мікророзмноження м'яти виучуваних сортів, але і двох інших сортів - Прилуцька карвонна, Удайчанка і чотирьох перспективних селекційних зразків - 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia L.), K 59(4n) (M. canadensis), 94.18.8 (M. citrata Ehrh. x M. longifolia), 92.9.35 (M. citrata K 66 (4n) х M. aquatica K6).

Таблиця 3. Етапи біотехнологічної схеми клонального мікророзмноження м'яти на основі культури ізольованих меристем in vitro

Зміст етапу	Умови реалізації етапу
1. Висадка донорних рослин в закритий ґрунт.	Вегетаційні посудини об'ємом 10 л, субстрат - ґрунт : керамзит (5 : 1).
2. Ізоляція і експлантація меристем на живильні середовища.	Стерилізація рослинного матеріалу препаратом "Брадофен" (5 хв). Експлантація на живильні середовища меристем з 2-3 парами листкових примордіїв або вегетативних бруньок.
3. Культивування експлантів ізольованих меристем in vitro.	Модифіковані живильні середовища: Мурасіге-Скуга - 75 діб; Шенка-Хільдебрандта - 45 діб; Гамборга-Евелега - 40 діб
4. Живцювання меристемних мікропагонів (при необхідності збільшення коефіцієнта розмноження).	Розділення мікропагонів на вузли з однією парою листків.
5. Культивування вузлів стебла in vitro.	Модифіковані живильні середовища: Мурасіге-Скуга - 60 діб; Шенка-Хільдебрандта - 45 діб; Гамборга-Евелега - 45 діб.
6. Адаптація рослин-регенерантів до умов in vivo.	Розділення вкорінених мікропагонів і перенесення в пластикові стаканчики об'ємом 200 мл з субстратом торф : керамзит (1 : 1). Вирощування 45 діб, полив в міру необхідності.

Клональне мікророзмноження м'яти в культурі листкових і стеблових експлантів in vitro

Морфогенез і регенерація рослин в культурі листкових експлантів. Для індукції морфогенезу і регенерації рослин молоде листя експлантували на агаризоване і рідке модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, доповнене 0,5 мг/л ІОК і 10 мг/л БАП. В процесі культивування першою видимою ознакою прояву морфогенетичних реакцій була диференціація вегетативних бруньок безпосередньо з тканин листка з подальшою регенерацією мікропагонів і коріння. Таким чином, в культурі листкових експлантів спостерігався прямий органогенез, що приводило до утворення рослин-регенерантів.

Наші дослідження показали перевагу використання рідких живильних середовищ для регенерації рослин і клонального мікророзмноження в культурі листкових експлантів всіх виучуваних сортів м'яти. В результаті одного циклу вирощування (30 діб) на рідкому живильному середовищі з одного листового експланта м'яти сортів Сімферопольська 200 і Заграва розвивалося 27-31 рослина-регенерант, а сортів Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 - 22-23. При використанні агаризованого живильного середовища кількість рослин-регенерантів складала відповідно 24-26 і 16-20. Культивування листкових експлантів як на рідкому, так і на агаризованому живильних середовищах понад 30 діб не приводило до додаткового утворення мікропагонів і не сприяло збільшенню коефіцієнта розмноження при ростових процесах, що продовжувалися.

Морфогенез і регенерація рослин в культурі стеблових експлантів. Для культивування стеблових експлантів виучуваних сортів м'яти використовували живильне середовище такого ж складу, як і для культивування експлантів молодого листя. Першою видимою ознакою у відповідь реакції експланта на умови культивування була індукція калюсогенезу. При подальшому культивуванні спостерігалася диференціація вегетативних бруньок, регенерація мікропагонів і коріння. Таким чином, в культурі стеблових експлантів сортів м'яти виявлявся непрямий органогенез і регенерація рослин відбувалася через утворення первинного калюсу. Проведені дослідження не виявили переваги рідкого або агаризованого живильного середовища для регенерації рослин і клонального мікророзмноження в культурі стеблових експлантів. У обох випадках за один цикл вирощування (30 діб) з одного експланта розвивалося 11-14 рослин-регенерантів залежно від сорту, а культивування понад 30 діб не приводило до збільшення коефіцієнта розмноження.

Адаптація рослин, одержаних в культурі листкових і стеблових експлантів, до умов in vivo. Адаптацію рослин до умов in vivo проводили за тією ж схемою, що і рослин, одержаних в культурі ізольованих меристем. Проте, в даному випадку із-за високого коефіцієнта розмноження дещо ускладнювався етап розділення й індивідуалізації рослин, одержаних з одного експланта. Тому процедуру розділення на індивідуальні рослини виконували в чашках Петрі за допомогою препаровальної голки. Рослини переносили в субстрат з торфу і керамзиту (1:1), а далі поступово переводили на звичайний режим вирощування в закритому ґрунті, де вони досягали фази технічної зрілості.

При порівнянні рослин м'яти, одержаних в культурі листкових та стеблових експлантів з рослинами, розмноженими традиційним розсадним способом, морфологічних відмінностей не виявлено.

Біотехнологічна схема клонального мікророзмноження м'яти на основі культури ізольованих листкових і стеблових експлантів. Проведені дослідження дали змогу розробити біотехнологічну схему клонального мікророзмноження м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6, використовуючи молоде листя і стеблові сегменти як експланти (табл. 4).

Таблиця 4. Етапи біотехнологічної схеми клонального мікророзмноження м'яти на основі культури ізольованих листкових і стеблових експлантів in vitro

Зміст етапу	Умови реалізації етапу
1. Висадка донорних рослин в закритий ґрунт	Вегетаційні посудини об'ємом 10 л, субстрат - ґрунт : керамзит (5 : 1).
2. Введення експлантів молодого листя і стеблових сегментів в умови in vitro.	Стерилізація рослинного матеріалу препаратом "Брадофен" (5 хв). Експлантація на живильні середовища молодого листя завдовжки 0,7-1,0 см і сегментів стебел без вузлів завдовжки 0,7-1,0 см.
3. Культивування експлантів in vitro.	Рідке або агаризоване модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга - 30 діб.
4. Індивідуалізація рослин і їх адаптація in vivo.	Розділення вкорінених мікропагонів і перенесення в субстрат торф : керамзит (1 : 1) на 45 діб, полив в міру необхідності.

На основі розроблених біотехнологічних прийомів було проведено клональне мікророзмноження перспективного селекційного зразка 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia) для включення в селекційні програми по створенню нових сортів м'яти.

Деякі особливості калюсогенезу в культурі вегетативних органів м'яти in vitro

Загальна характеристика процесу калюсоутворення в культурі листкових і стеблових експлантів. З метою індукції калюсоутворення в культурі листкових і стеблових експлантів м'яти використовували модифіковані живильні середовища Мурасіге-Скуга, доповнені 2,4-Д, кінетином і БАП. Для більшості виучуваних сортів, максимальна частота (90-100%) й інтенсивність калюсоутворення спостерігалися на модифікованому живильному середовищі, що містить 0,5 мг/л кінетину, 0,5 мг/л БАП і 2,0 мг/л 2,4-Д. Перші ознаки калюсоутворення спостерігалися на 14-21-у добу культивування залежно від сорту. На експлантах молодого листя утворення калюсу спостерігалося в базальній частині в місцях розтину тканини. У культурі стеблових експлантів калюс утворювався на поверхні зрізу. Калюс, що формувався, мав ясно-зелене забарвлення і рихлу консистенцію.

Залежність частоти калюсоутворення від часу відбору матеріалу (сезонність) і фізіологічного віку листка. Дослідження показали, що частота калюсоутворення в культурі листкових експлантів залишалася достатньо високою протягом всього року і не опускалася нижче 70-80% залежно від сорту. Разом з тим, для всіх сортів була характерна залежність процесу калюсогенезу від фізіологічного віку листка. Максимальна частота калюсоутворення (96,6-100%) спостерігалася при введенні в ізольовану культуру 1-4 пари листків від верхівки пагона, що є фізіологічно молодшими. Із збільшенням віку листка частота калюсоутворення знижувалася на 30,0%.

Морфологічні особливості калюсних культур. Дослідження показали, що калюсні культури м'яти сорту Сімферопольська 200 характеризувалися гетерогенністю за клітинним складом. У первинному і пасажному калюсі виявлялися клітини меристематичного типу, паренхімні клітини різних розмірів і форм, накопичуючі клітини, а також елементи судинної системи. Особливо слід відзначити присутність в калюсних культурах морфогенних ділянок, в яких при цитологічному аналізі були виявлені ембріоїдоподібні структури, що складалися з 6-8 і до кількох десятків клітин. Ці ембріоїдоподібні структури були не здатні до дальшого розвитку, що, очевидно, пов'язано з генетичними блоками розвитку при соматичному ембріогенезі (Wang Jiang-bo et al, 2000; Xing et al, 2000), обумовленими складною гібридною природою виучуваних сортів, створених на основі міжвидової гібридизації і поліплоїдії.

Спрямованість кількісних змін ДНК в інтерфазних ядрах клітин калюсних культур в процесі пасирування. Цитохімічні дослідження показали, що у I-пасажі інтерфазні ядра клітин меристематичного типу калюсних культур м'яти сорту Сімферопольська 200 містили переважно 2С-4С ДНК. Із збільшенням пасажу спостерігалася тенденція до збільшення гетерогенності клітин за вмістом ДНК, проте переважали клітини, що містять 2С-4С ДНК. Клітини паренхімного типу відрізнялися вищим рівнем гетерогенності за вмістом ДНК і це виявлялося вже для калюсних культур I-пасажу. Із збільшенням пасажу ця гетерогенність прогресувала і в калюсних культурах III-пасажу межа варіювання клітин за вмістом ДНК в інтерфазних ядрах складала 2С-13С.

Аналіз і обговорення одержаних результатів

У даному розділі проведено аналіз одержаних результатів і їх порівняння з відомими літературними даними з клонального мікророзмноження видів роду Mentha. Головним підсумком цього дослідження є розробка біотехнологічних прийомів і загальної біотехнологічної схеми клонального мікророзмноження перспективних сортів м'яти Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6. У загальній біотехнологічній схемі прийоми клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів, що є самостійними блоками, об'єднані в єдиний біотехнологічний процес.

Розроблена загальна біотехнологічна схема дає змогу проводити клональне мікророзмноження м'яти як на основі культури ізольованих меристем, так і на основі поєднання меристемної культури з культурою листкових і стеблових експлантів.

З практичної точки зору становить інтерес порівняльна характеристика результатів клонального мікророзмноження при використанні різних експлантів (табл. 5). Такий порівняльний аналіз дає можливість оцінити ефективність розроблених біотехнологічних прийомів і визначити оптимальний спосіб клонального мікророзмноження залежно від мети і поставлених завдань.

Таблиця 5. Порівняльна характеристика результатів клонального мікророзмноження сортів м'яти на основі розробленої біотехнологічної схеми

Показники	Тип експланта
	меристеми	молоде листя	стеблові сегменти
Первинний експлант	2-3 пари листкових примордіїв (1,27-1,64 мм)	довжина 0,7-1,0 см	довжина 0,7-1,0 см
Тривалість культивування від введення експланта до одержання рослин-регенерантів, діб	40 - 75	30	30
Коефіцієнт розмноження за один цикл вирощування	1:4,9-1:6,9	1:22-1:31	1:11-1:14
Живильне середовище	модифіковані (агаризовані): Мурасіге-Скуга; Шенка-Хільдебрандта; Гамборга-Евелега	модифіковане Мурасіге-Скуга (рідке)
Субстрат для адаптації до умов in vivo	торф-керамзит 1:1
Приживлення рослин в умовах in vivo (через 45 діб), %	96,7-100	91,7-100

Висновки

Вперше розроблено біотехнологічні прийоми клонального мікророзмноження м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна і Прилуцька 6 на основі культури ізольованих меристем, а також листкових і стеблових експлантів in vitro.

Виявлено високий морфогенетичний потенціал експлантів ізольованих меристем м'яти з 2-3 парами листкових примордіїв (1,27-1,64 мм). При введенні таких експлантів в культуру in vitro 83,9% - 98,9% з них здатні до морфогенезу і регенерації рослин.

Показано залежність морфогенезу і регенерації рослин в культурі ізольованих меристем від часу відбору матеріалу (сезонність). Краща здатність до морфогенезу і регенерації у всіх сортів спостерігалася при введенні експлантів в культуру in vitro протягом березня-червня.

На модифікованих живильних середовищах Мурасіге-Скуга, Шенка-Хільдебрандта і Гамборга-Евелега, доповнених кінетином, БАП, ІОК і 2,4-Д, при культивуванні ізольованих меристем виявлено множинне пагоноутворення і ризогенез (коефіцієнт розмноження 1:4,9-1:6,9) протягом одного циклу вирощування культур, що виключає проведення власне мікророзмноження і вкорінення мікропагонів як спеціальних етапів, пов'язаних з субкультивуванням.

Встановлено вплив складу живильних середовищ на інтенсивність пагоно- і коренеутворення при клональному мікророзмноженні в культурі ізольованих меристем. На модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга цикл вирощування культур складає 75 діб, а на модифікованому живильному середовищі Гамборга-Евелега - 40 діб.

Розроблено спосіб клонального мікророзмноження м'яти на основі живцювання меристемних мікропагонів in vitro, що забезпечує коефіцієнт розмноження 1:4,6-1:6,1.

Виявлено різну морфогенетичну реакцію листкових і стеблових експлантів в ході культивування на модифікованому живильному середовищі Мурасіге-Скуга. Встановлено, що при клональному мікророзмноженні в культурі листкових експлантів спостерігається прямий органогенез і регенерація рослин безпосередньо з тканин листка. У культурі стеблових експлантів виявлено непрямий органогенез, при цьому регенерація рослин відбувається з клітин первинного калюсу протягом одного циклу вирощування.

Клональне мікророзмноження м'яти на основі культури листкових і стеблових експлантів in vitro забезпечує вищий коефіцієнт розмноження (1:11-1:31), ніж на основі культури ізольованих меристем.

Оптимізовано умови одержання калюсних культур з листкових і стеблових експлантів. Виявлено морфологічні і цитологічні особливості калюсних культур і вперше показано високий рівень гетерогенності калюсних клітин м'яти за морфологією і вмістом ДНК в інтерфазних ядрах. Встановлено, що із збільшенням пасажу рівень морфологічної гетерогенності за клітинним складом знижується, а рівень гетерогенності за змістом ДНК зростає.

Розроблено біотехнологічну схему клонального мікророзмноження перспективних вітчизняних сортів м'яти, що дає змогу одержувати необхідну кількість рослин при різних способах регенерації.

Практичні рекомендації

Для інтенсивного розмноження м'яти сортів Сімферопольська 200, Заграва, Українська перцева, Двохукісна, Прилуцька 6, Прилуцька карвонна, Удайчанка і селекційних зразків 84.57.2 (M. canadensis x M. rotundifolia), K 59(4n) (M. canadensis), 94.18.8 (M. citrata x M. longifolia), 92.9.35 ( M. citrata K 66 (4n) х M. aquatica K6) рекомендується використовувати біотехнологічні прийоми, засновані на культивуванні in vitro ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів.

Розроблену біотехнологічну схему клонального мікророзмноження на основі культури ізольованих меристем, листкових і стеблових експлантів in vitro рекомендується використовувати як найважливішу складову при створенні промислової біотехнології одержання високоякісного посадкового матеріалу м'яти і як ефективний допоміжний прийом для розмноження унікальних зразків в селекційних програмах зі створення нових сортів.

Матеріали, викладені в дисертаційній роботі, можуть використовуватися у вузах при розробці навчальних курсів, спецкурсів і проведенні лабораторно-практичних занять з біотехнології рослин.

Список публікацій

1. Бугара И.А., Бугара А.М. Некоторые особенности клонального микроразмножения мяты на основе культуры изолированных меристем in vitro // Бюл. Никит. бот. сада. - 2002. - Т. 86. - С. 49-53.

2. Бугара И.А., Бугара А.М. Клональное микроразмножение мяты в культуре листовых сегментов in vitro // Вісник Харківського Національного Аграрного Університету. - 2002. - 1, № 9. - С. 60-64.

3. Бугара И.А., Бугара А.М. Культура изолированных тканей мяты in vitro: возможности для размножения сортов и сохранения биологического разнообразия // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 12. -2002.- С. 194-199.

4. Бугара И.А., Бугаенко Л.А. Клональне мікроразмноження деяких сортів м'яти на основі культури ізольованих меристем in vitro // Вісник аграрної науки. - 2002. - 1. - С. 53-55.

5. Бугара И.А., Бугара А.М. Использование методов биотехнологии для размножения растений и сохранения генофонда // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 13. - 2003. - С. 14-20.

6. Бугара И.А., Бугаенко Л.А., Бугара А.М. Клональное микроразмножение мяты в культуре стеблевых сегментов in vitro // Экосистемы Крыма, их оптимизация и охрана. - Вып. 14. - 2004. - С. 97-103.

7. Бугара И.А., Бугаенко Л.А. Морфогенез и клональное микроразмножение мяты in vitro // Труди Міжнар. наук. конф. "Оптимізація селекційного процесу на основі генетичних методів" - Харків. - 1999. - С. 17-19.

8. Бугара И.А. Экспериментальный морфогенез изолированных меристем мяты in vitro // Труди I республ. Конф. молодых учен. Крыма "Актуальные вопросы современной биологии". - Симферополь. - 2000. - С. 39.

9. Пилунская О.А., Бугара И.А. Некоторые особенности морфогенеза изолированных меристем розы эфиромасличной и мяты in vitro // Труди 12 Міждунар. наук. конфер. "Вивчення онтогенезу рослин природних і культурних флор у ботанічних закладах і дендропарках Євразії". - Полтава. - 2000. - С. 240.

10. Бугара И.А. Микроклональное размножение мяты in vitro // Труды VIII Междунар. конф по садоводству "Современные научные исследования в садоводстве". - Ялта. - 2000. - С. 15-19.

11. Бугаенко Л.А., Бугара И.А., Лисоматко Е.В. Способы размножения мяты и перспективы улучшения качества посадочного материала // Труды КГАУ. - 2000. - № 66. - С. 150-154.

12. Бугара И.А. Микроклональное размножение мяты in vitro методом индукции прямого морфогенеза // Труды Междунар. конф. молодых учен. "Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции". - Харьков. - 2001. - С. 7.

13. Бугара И.А. Клональное микроразмножение некоторых сортов мяты на основе адвентивного побегообразования в культуре листовых сегментов in vitro // Труды КГАУ. - 2002. - № 72. - С. 14-17.

14. Бугара И.А. Использование метода in vitro для микроклонального размножения мяты // Третья Междунар. конф "Современные проблемы беспочвенного культивирования растений". - Ереван. - 1999. - С. 64.

15. Bugara I.A. Clonal micropropagation of mint in vitro // Int. simp. "Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources". - Yalta. - 2002. - P. 28.

16. Бугара И.А. Получение каллусных тканей мяты и их цитологическая характеристика // Труды Всеукр. конфер. молодых ученых "Актуальные вопросы современного естествознания". - Симферополь. - 2003. - С. 18.

Размещено на Allbest.ru

...