Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О. О. КОВАЛЕВСЬКОГО

УДК 579.68+84:546.48+49+81

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Резистентність гетеротрофних морських бактерій Одеського прибережжя до важких металів

03.00.17 - гідробіологія

Бухтіяров Андрій Євгенович

Севастополь - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Одеському національному університеті ім. І. І. Мечникова МОН України, м. Одеса.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Іваниця Володимир Олексійович Одеський національний університет ім. І. І. Мечникова МОН України, завідувач кафедрою мікробіології та вірусології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Рябушко Віталій Іванович Інститут біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України, завідувач відділом біологічного тестування;

кандидат біологічних наук, професор Гудзь Степан Петрович Львівський національний університет ім. Івана Франка МОН України, завідувач кафедрою мікробіології

Провідна установа: Інститут гідробіології НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться “22” вересня 2006 р. о “10” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 Інституту біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахимова, 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахимова, 2.

Автореферат розісланий “10 ” серпня 2006 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 доктор біологічних наук, професор А.В. Гаєвська.

Загальна характеристика роботи

Проблема забруднення морського середовища багато в чому пов'язана з надходженням важких металів у прибережні райони моря, утворенням високотоксичних металорганічних комплексів і з акумуляцією металів гідробіонтами (у тому числі мікроорганізмами) у концентраціях, небезпечних для їхньої життєдіяльності.

Впливаючи на генетичний апарат, токсиканти сприяють збільшенню частоти й накопиченню індукованих мутацій, що призводить до техногенної мікроеволюції, зміни чисельності мікроорганізмів, структури мікробних ценозів і еколого-фізіологічних властивостей бактерій (Iваниця, 1996; Kenarova, Bogoev, 2001).

Застосування молекулярно-біологічних методів у систематиці бактерій сприяло переміщенню деяких таксонів (насамперед родів і видів) у системі класифікації прокаріот, що призвело до знецінювання великого масиву даних і зробило неможливим проведення порівняльного аналізу видового складу бактеріального населення Чорного моря.

У зв'язку з цим планомірні дослідження допоможуть розширити знання про закономірності поширення, складу й чисельності бактеріопланктону й внести ясність у розуміння процесів зміни як на рівні гетеротрофного ценозу, так і на рівні окремих представників під дією важких металів.

Актуальність теми визначається необхідністю опису біологічного різноманіття мікробіоти Одеського прибережжя з урахуванням сучасної систематики бактерій.

Розуміння механізмів взаємодії представників бактеріопланктону з токсичними металами й закономірностей реакції мікробіоти на їхній вплив дозволить прогнозувати зміну екологічної ситуації в умовах забруднення морського середовища й використовувати резистентність гетеротрофних бактерій до металів як інтегрального показника у комплексному моніторингу водних екосистем.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі мікробіології та вірусології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова й увійшла складовою частиною в держбюджетні теми “Вивчення взаємовідносин мікроорганізмів з полютантами та їх адаптивної мінливості в природних і штучних умовах” (№ ДР 0100U001493) і “Збереження мікробних ресурсів шляхом підтримування колекцій культур мікроорганізмів та їх використання в екологічній біотехнології” (№ ДР 0103U003804). Автор брав участь у дослідженнях як виконавець.

Робота відзначена стипендією Кабінету Міністрів України для молодих учених за 2001- 2002 роки (розпорядження Кабінету Міністрів України від 26.06.01 № 2).

Мета й завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у визначенні кількісного та якісного складу гетеротрофного бактеріопланктону Одеського прибережжя і вивчення взаємодії домінуючих представників морських бактерій з важкими металами: свинцем, кадмієм і ртуттю.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

– встановити вміст Pb, Cd, Hg у воді на станціях Нафтова гавань, Дача Ковалевського і Дельфін Одеського прибережжя;

– з використанням тест-системи Salmonella typhimurium TA 98 визначити рівень мутагенного впливу Pb, Cd, Hg і морської води Одеського прибережжя;

– визначити мінімальні інгібуючі концентрації цих металів і сезонну динаміку рівня резистентності до них гетеротрофного бактеріопланктону досліджуваних районів;

– із прибережних вод поблизу м. Одеси ізолювати гетеротрофні бактерії, що мають найбільшу резистентність до Pb, Cd, Hg, установити їх видовий склад;

– створити колекцію культур гетеротрофних морських бактерій з фоновим і високим рівнями резистентності до Pb, Cd, Hg і встановити закономірності мінливості цього показника під впливом важких металів і без них;

– оцінити здатність морських бактерій Одеського прибережжя з фоновим і високим рівнями резистентності до Cd акумулювати його;

– визначити можливість практичного використання показника стійкості гетеротрофного бактеріопланктону до Pb, Cd, Hg як інтегрального показника реакції мікробіоти морських біоценозів на антропогенне забруднення морського середовища.

Об'єкт дослідження - резистентність гетеротрофних морських бактерій Одеського прибережжя до важких металів.

Предмет дослідження - домінуючі гетеротрофні бактерії мікробних ценозів вод Одеського прибережжя.

Методи досліджень - використані комплексні методи гідрохімії й аналітичної хімії (для визначення рівня забруднення важкими металами морського середовища й акумуляції кадмію морськими бактеріями), морської мікробіології (для виділення з морського середовища гетеротрофних бактерій з високим і фоновим рівнями резистентності до важких металів), загальної мікробіології (для оцінки морфологічних, тінкторіальних, культуральних, фізіолого-біохімічних ознак отриманих штамів і їхньої ідентифікації, для зберігання культур морських бактерій на живильному середовищі й визначення рівня стійкості до токсичних металів), математичної статистики (для аналізу й оцінки вірогідності отриманих даних).

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше встановлено, що вміст Pb і Cd у воді Одеського прибережжя перевищує мінімальну мутагенну концентрацію. З використанням тест-бактерії Salmonella typhimurium TA 98 показано, що проби морської води мають мутагенну активність, що корелює із присутністю важких металів у дослідженій акваторії. Встановлено сезонну динаміку вмісту гетеротрофного бактеріопланктону у воді Одеського прибережжя. Отримано нові дані про природну резистентність представників гетеротрофного мікробного ценозу до важких металів. Уперше встановлена сезонна динаміка стійкості представників бактеріопланктону Одеського прибережжя до Pb, Cd, Hg. З урахуванням сучасної номенклатури визначено видовий склад домінуючих бактерій у районах Одеського прибережжя з різним антропогенним навантаженням, установлена видова різноматність представників бактеріального ценозу, резистентних до досліджених металів. Виявлено зміни резистентності виділених бактерій з вихідним фоновим і високим рівнями стійкості до Pb, Cd, Hg у процесі їхнього підтримки на середовищі з металами й без них. Установлено здатність морських мікроорганізмів акумулювати Cd.

Практична значимість отриманих результатів. Створено колекцію культур гетеротрофних морських бактерій, що характеризуються фоновим і високим рівнями резистентності до Pb, Cd, Hg. Отримані результати дають підставу рекомендувати використання резистентності бактеріопланктону до Pb, Cd, Hg як інтегрального показника реакції мікробіоти морських біоценозів на антропогенне забруднення морського середовища в комплексному екологічному моніторингу морських екосистем. Штами бактерій, резистентних до Pb, Cd, Hg, використовують для розробки біотехнологій очищення води від важких металів. Матеріали дисертаційної роботи використовуються в розділі спеціального практикуму й проведення курсів лекцій на кафедрі мікробіології та вірусології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова.

Особистий внесок здобувача. Планування досліджень, відбір проб морської води, визначення мутагенної активності, чисельності бактерій, виділення чистих культур, вивчення фенотипових ознак і виявлення резистентності бактерій до металів, визначення рівнів акумуляції кадмію мікроорганізмами, а також аналіз і узагальнення отриманих результатів здійснені дисертантом самостійно. Визначення вмісту важких металів у пробах морської води й акумулятивного потенціалу кадмію морськими бактеріями виконано разом з к.х.н., доцентом А. М. Захарією (Одеський національний університет ім. І. І. Мечникова), визначення гідрологічних і гідрохімічних показників проб морської води - разом зі співробітниками СЕС порту м. Іллічівська.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації були представлені на конференції молодих учених “Pontus Euxinus 2000” (Севастополь, 2000), III (X) з'їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), Міжнародній науковій конференції “Екологія й біогеохімічна діяльність мікроорганізмів” (Одеса, 2001), 6 і 8-й Пущинських школах-конференціях молодих учених “Біологія - наука XXI століття” (Пущино, 2002; 2004), Ювілейній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих учених, присвяченій 180-річчю від дня народження Л. С. Ценковського (Одеса, 2003), 1st Congress of European Microbiologists (Ljubljana, Slovenia, 2003), конференції молодих учених “Современные проблемы экологии” (Запорожье, 2004), International Marine Biotechnology Conference, (Newfoundland, 2005), IV з'їзді Товариства гідроекологів України (Феодосія, 2005), на наукових конференціях професорсько-викладацького складу й науковців Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова (2001, 2003), наукових семінарах кафедри мікробіології та вірусології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 14 друкованих праць, у тому числі у виданнях, рекомендованих ВАК України - 6 статей, 8 - у матеріалах наукових конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 6 розділів, заключення, висновків, списку використаних джерел (98 вітчизняних видань і 84 іноземних), додатку. Робота викладена на 165 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 36 таблицями й 10 малюнками. Автор висловлює глибоку вдячність науковому керівникові д.б.н., проф. Володимиру Олексійовичу Іваниці, к.х.н., доц. Олександру Миколайовичу Захарії, співробітникам СЕС порту м. Іллічівська, а також усьому колективу співробітників кафедри мікробіології та вірусології Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова за допомогу, що була надана в процесі виконання роботи.

Зміст роботи

Огляд літератури. У розділі проаналізовані сучасні літературні дані про взаємодію гетеротрофних морських бактерій з важкими металами. Розглянуто основні шляхи надходження токсикантів, дана оцінка рівню забруднення важкими металами екосистеми Чорного моря. Проведено ретроспективний аналіз робіт з вивчення кількісного і якісного складу чорноморського гетеротрофного мікробного співтовариства, описані основні механізми резистентності до важких металів і їхньої акумуляції у мікроорганізмів. Обґрунтовано необхідність виконання досліджень по темі дисертаційної роботи.

Матеріал і методи досліджень. Основним матеріалом дослідження були проби морської води, відбір яких проводили з урахуванням сезонності гідрологічних і гідробіологічних елементів Одеського прибережжя у червні, листопаді 1999 р., січні й квітні 2000 р. Проби морської води відбирали на трьох станціях у районі Нафтової гавані Одеського порту, пляжів Дельфін і Дача Ковалевського, що відрізнялися екологічними умовами, з поверхневого шару води (0 - 50 см) на відстані 50 м від берега за допомогою стерильного скляного посуду (0,75 л). Обробку проб здійснювали через 1,5 - 2 години з моменту відбору.

Чисельність гетеротрофних бактерій визначали методом прямого посіву на модифіковане щільне агаризоване живильне середовище в трьох повторностях (Горбенко, 1961).

Діапазон концентрацій важких металів підбирали на підставі попередніх досліджень, проведених у 1998 р., і даних літератури (Авакян, 1967; Iваниця, 1996). У чашку Петрі вносили 9 мл ростового середовища й додавали 1 мл концентрованого розчину токсиканта в досліді, щоб одержати обрані концентрації (0,1; 0,5; 1; 1,5 ммоль/л Pb(NO3)2, 0,05; 0,1; 0,5; 1 ммоль/л CdCl2, 0,005; 0,01; 0,05; 0,1 ммоль/л HgCl2). Контролем служила штучно приготовлена морська вода (Справочник биохимика, 1991).

Вміст Pb і Cd у пробах (n = 3) визначали методом атомної спектрофотометрії в полум'ї ацетиленово-повітряної газової суміші, у якості аналітично обраної найбільш чутливої спектральної лінії використовували 283,3 нм для Pb і 228,8 нм для Cd. Визначення концентрації Hg проводили методом холодних парів (Карякин, Грибовская, 1987).

Культивування бактерій проводили при температурі 22 ^оС. Облік кількості колоній, що виросли, здійснювали через 2 доби.

Із колоній, що виросли після посіву проб морської води на живильний агар з важкими металами й без них, була створена колекція, що включає 94 штами гетеротрофних бактерій. З них 32 штами з фоновим рівнем резистентності були ізольовані з живильного середовища, що не містить токсикантів, а 62 штами бактерій, резистентних до важких металів, - із середовищ з максимальною концентрацією металу, при якій спостерігався ріст колоній. Із всіх досліджених штамів 29 виділені з води у районі Нафтової гавані, 27 - у районі станції Дача Ковалевського й 38 - в районі станції Дельфін.

У ході ідентифікації ізольованих штамів бактерій вивчали морфологічні ознаки, тип клітинної стінки за методом Грама (у модифікації Ковача) і в тесті з 3 % KOH, розташування джгутиків, наявність пігментів, відношення до О₂, тип метаболізму на середовищі Хью-Лейфсона (О/Ф тест), модифікованому для морських бактерій (Baumann, Baumann, 1986), здатність до росту при 4 ^оС, 20 ^оС, 30 ^оС, 35 ^оС, 40 ^оС, 45 ^оС, 50 ^оС, затримку росту колоній мікроорганізмів у зоні диска фільтрувального паперу, просоченого ВА (150 мкг) на МПА, потребу в іонах натрію на рідкому синтетичному середовищі ВМ із глутаматом натрію (0,1 %) як джерелом вуглецю (Смирнов, Киприянова, 1990), наявність каталази, оксидази (ортi-тест), в-галактозидази. Як єдине джерело вуглецю використані такі сполуки: L-арабіноза, D-глюкоза, лактоза, мальтоза, D-манноза, L-рамноза, сахароза, дульцитол, мезо-інозитол, D-маннітол, D-сорбітол і цитрат натрію (середовище Симмонса). У досліджених мікроорганізмів виявляли наявність аргініндигідролази, лізиндекарбоксилази, орнітиндекарбоксилази, тирозиндекарбоксилази, триптофандезамінази. Визначали здатність бактерій продукувати газ із D-глюкози, нітрити з нітратів, NH₃, H₂S, індол, ацетоїн, гидролізувати сечовину, желатин, крохмаль, агар. Фізіолого-біохімічні властивості виділених бактерій додатково вивчалися за допомогою аналізатора BactoScan - 4 з використанням сухих панелей типу “Gram Negative Dried MIC/Combo panels Type 5” (Dried gram ..., 1995).

Видова приналежність була встановлена для 39 гетеротрофних бактерій за допомогою IX видання Визначника Бергі (Bergey's manual of ..., 1984).

Ступінь резистентності бактерій до важких металів визначали методом стандартних серійних розведень у щільному живильному середовищі за допомогою штамп-репликатору на 62 культури (Методы общей..., 1983). Визначення МІК Pb, Cd і Hg для підтримуваних у лабораторії штамів проводили через 3, 6, 9 і 12 місяців з моменту виділення бактерій із природних умов. Живильні середовища містили важкі метали в спектрах концентрацій: для Hg - від 0,005 до 0,5 ммоль/л (із кроком 0,005 ммоль/л), для Pb - від 0,1 до 2,5 ммоль/л (із кроком 0,1 ммоль/л) і для Cd - від 0,01 до 2,0 ммоль/л (із кроком 0,01 ммоль/л). Культури морських бактерій з високим рівнем стійкості до свинцю, кадмію й ртуті розділили на дві групи. Одну продовжували зберігати без токсиканта, а іншу - з важким металом, вміст якого в живильному середовищі відповідав тій найбільшій концентрації, при якій ще відзначався ріст.

Вивчення здатності бактерій акумулювати кадмій проводили відповідно до методики McEldowney (1994). У дослідах застосовували концентрацію кадмію, рівну 0,27 ммоль/л (30 мкг/мл).

Для оцінки мутагенної активності й токсичності проб морської води застосовували тест Еймса (1973) з використанням бактерій Salmonella typhimurium TA 98.

Статистичну обробку отриманих даних виконували, базуючись на загальноприйнятих методах (Лакин, 1990), використовуючи статистичні пакети програм “STATGRAPHICS PLUS 3.0”, “Microsoft Excel 97” (Тюрин, Макаров, 1995; Лапач и др., 2001).

Мутагенна активність важких металів і забруднення морської води Одеського прибережжя

Для визначення рівня негативного впливу важких металів і хімічного забруднення морської води на генетичний апарат бактерій використовували мутантний штам S. typhimurium TA 98, що є дефектним по гістидину. Проведені дослідження показали, що окремо взяті токсичні метали свинець, кадмій і ртуть виявляли мутагенну дію на штам (табл. 1). Мутагенний ефект продемонстрували свинець, кадмій й ртуть в концентраціях 0,5; 0,4; 2,5 нмоль/л відповідно і більше. Мінімальні мутагенні концентрації (ММК) кадмію й свинцю виявилися значно нижчими (в 19,8 і 312,5 разів відповідно) від ГДК цих металів, які визначені для поверхневих вод.

Таблиця 1 Мінімальні концентрації свинцю, кадмію й ртуті, що спричиняють мутагенну дію на бактерії штаму Salmonella typhimurium TA 98

Метал	ГДК у воді (мг/л)	ГДК у воді (нмоль/л)	MМК (нмоль/л)	ГДК/ММК
Pb	0,03	150,0	0,5	312,5
Cd	0,001	8,9	0,4	19,8
Hg	0,0005	2,5	2,5	1,0

Хімічний аналіз проб морської води показав, що вміст у них токсичних металів (Pb, Cd і Hg) мінімальний і не перевищує рівні ГДК у досліджені місяці року. В усі сезони, крім осені, найбільшому забрудненню свинцем піддавалася акваторія станції Нафтова гавань (8,7 - 15,5 нмоль/л). Концентрація кадмію коливалася у воді станцій Нафтова гавань від 2,1 до 2,8 нмоль/л, Дачі Ковалевського - 2,0 - 2,8 нмоль/л, Дельфін - 1,8 - 2,2 нмоль/л. У пробах морської води виявлені важкі метали (свинець і кадмій) у концентраціях, які можуть індукувати мутації у штаму з досить високою частотою. Вміст кадмію перевищував ММК в 4,0 - 6,2 рази, а свинцю в 14,2 - 32,3 рази. Проведений аналіз не дозволив установити наявність ртуті у воді досліджуваних станцій у концентраціях, здатних спричинити мутагенну дію.

Проби морської води індукують у S. typhimurium TA 98 вихід мутацій, середні значення яких перевищують рівень спонтанних мутацій в 1,2 - 7,2 рази (табл. 2).

Таблиця 2 Мутагенна дія забруднення морської води на Salmonella typhimurium TA 98

Сезон	Нафтова гавань	Дача Ковалевського	Дельфін	Контроль
Літо	6,8	4,6	1,3	1,0
Осінь	7,2	4,7	1,4	1,0
Зима	6,1	4,6	1,3	1,0
Весна	6,9	4,6	1,2	1,0

Найбільший показник мутагенної активності встановлено для морської води, відібраної з Нафтової гавані. Хімічне забруднення в цьому районі індукувало утворення мутацій, рівень яких перевищував фоновий в 6,1 - 7,2 рази.

Середні показники мутагенності води в районі станції Дельфін виявлялися близькими до контрольних, а на станції Дача Ковалевського по сезонах варіювали незначно й перевищували фоновий рівень в 4,6 - 4,7 рази.

Встановлено наявність тісних кореляційних зв'язків між мутагенною активністю й присутністю у воді Нафтової гавані й Дачі Ковалевського кадмію (r = 0,99; 0,96 відповідно) і свинцю (r = 0,85; 0,89 відповідно).

Сезонна динаміка чисельності гетеротрофного бактеріопланктону Одеського прибережжя

Вміст бактеріопланктону на всіх станціях був найбільшим у літній період і зменшувався в ряду літо, осінь, весна, зима. Протягом всіх сезонів найменший вміст бактерій установлений на станції Дельфін (від 120 до 2710 КУО/мл), а найбільший - на станції Нафтова гавань (від 490 до 9540 КУО/мл), що пов'язано з наявністю у воді порту високих концентрацій органічних сполук, про що свідчать показники БПК₅ і перманганатного окиснення домішок води. На станції Дача Ковалевського кількість гетеротрофних бактерій коливалася від 170 до 3690 КУО/мл (табл. 3). Показано, що в досліджуваних біоценозах існують бактерії, резистентні до концентрацій токсичних металів, що у багато разів перевищують їхній вміст у морській воді.

В усі сезони року кількість мікроорганізмів, здатних рости в присутності токсикантів, зменшується зі збільшенням концентрації металу в середовищі. Це може бути пов'язано з наявністю природних генетично детермінованих механізмів резистентності бактерій до важких металів.

Значення МІК всіх досліджених токсикантів зменшуються в ряду станцій Нафтова гавань, Дача Ковалевського, Дельфін. МІК свинцю влітку, восени й навесні для представників гетеротрофного бактеріального населення станції Дельфін й узимку Дачі Ковалевського склала 1,0 ммоль/л, узимку для Дельфіна - 0,5 ммоль/л. В інші сезони МІК свинцю для бактеріопланктону всіх досліджених станцій рівнялася 1,5 ммоль/л.

МІК кадмію для гетеротрофних бактерій досліджених станцій улітку, восени й навесні складала 1 ммоль/л, узимку для бактерій станції Дельфін - 0,5 ммоль/л.

Значення МІК ртуті для бактеріопланктону Дачі Ковалевського взимку, Дельфіна влітку, восени й навесні складало 0,05 ммоль/л, узимку для станції Дельфін - 0,01 ммоль/л. В інші сезони МІК ртуті рівнялася 0,1 ммоль/л.

Частка (співвідношення кількості резистентних до загальної кількості) бактерій, резистентних до різних концентрацій свинцю, кадмію й ртуті, для всіх досліджених районів зменшується зі збільшенням концентрації металу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 3 Кількість бактерій (КУО/мл), резистентних до різних концентрацій свинцю, кадмію й ртуті на станціях Нафтова гавань, Дача Ковалевського, Дельфін

Концентрація металу, ммоль/л

Нафтова гавань

Дача Ковалевського

Дельфін

літо

осінь

зима

весна

літо

осінь

зима

весна

літо

осінь

зима

весна

Контроль

9540±319

3240±448

490±91

1100±93

3690±323

1340±202

170±26

540±193

2710±373

1030±54

120±46

475±102

0,100 Pb

9160±215

3010±310

450±21

1050±48

3150±255

1160±70

130±15

440±44

1400±190

520±36

45±15

200±48

0,500 Pb

4070±200

1260±215

190±8

450±20

1270±210

470±20

40±8

170±11

420±48

140±10

0

60±21

1,000 Pb

2120±195

520±70

80±10

210±16

100±16

50±12

0

10±3

0

0

0

0

1,500 Pb

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0,050 Cd

9200±353

3120±396

420±10

1010±58

3150±299

1120±114

140±12

400±36

1230±251

420±30

48±15

184±33

0,100 Cd

4890±378

1630±72

220±28

560±34

1810±163

610±135

60±10

220±16

690±102

230±20

30±8

105±24

0,500 Cd

1010±117

290±23

40±8

120±18

470±83

110±16

20±3

40±12

20±2

6±2

0

2±1

1,000 Cd

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0,005 Hg

9490±419

3190±199

450±28

1070±75

2550±153

900±99

120±4

350±93

1680±177

580±20

70±26

235±80

0,010 Hg

8720±329

2910±133

390±19

970±64

400±26

100±12

10±3

50±13

10±3

10±1

0

10±1

0,050 Hg

6210±236

2040±60

240±12

660±33

90±9

30±8

0

10±4

0

0

0

0

0,100 Hg

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

Для всіх використаних в експерименті концентрацій металів середні значення частки резистентних бактерій за всі періоди року зменшуються в ряду станцій Нафтова гавань, Дача Ковалевського, Дельфін.

Співвідношення кількості резистентних і чутливих (Nr : Ns) бактерій до свинцю, кадмію й ртуті зменшується в ряду: Нафтова гавань, Дача Ковалевського й Дельфін. Найбільше значення співвідношення (189,8) відзначено для Нафтової гавані влітку на середовищі зі ртуттю в концентрації 0,005 ммоль/л.

Рівень резистентності представників гетеротрофного бактеріопланктону вивчених районів до Pb, Cd і Hg за всіма показниками (значенням МІК, часткою стійких бактерій і співвідношенням Nr : Ns) в усі сезони збільшується в ряді станцій Дельфін, Дача Ковалевського, Нафтова гавань, що цілком узгоджується з рівнем антропогенного забруднення води в цих районах.

Видовий склад домінуючих гетеротрофних бактерій Одеського прибережжя

Переважна більшість виділених мікроорганізмів як з фоновим, так і високим рівнем резистентності, - грамнегативні, каталазопозитивні, неспороносні, рухливі палички, які відносятся до роду Vibrio. Серед гетеротрофних бактерій, виділених з води Нафтової гавані, домінували V. nereis (54,2 %), Дачі Ковалевського - V. campbellii (78,9 %), станції Дельфін - Pseudomonas stutzeri (30,8 %). Серед резистентних до свинцю бактерій на станціях Нафтова гавань переважали V. nereis (42,5 %), Дача Ковалевського - V. campbellii (70,0 %), Дельфін - V. natriegens (51,9 %). Серед резистентної до кадмію мікробіоти у воді Нафтової гавані домінували представники V. nereis (88,0 %), Дачі Ковалевського - V. harveyi (42,6 %), Дельфіна - Enterobacter agglomerans (60,3 %). Серед резистентних до ртуті мікроорганізмів на станціях Нафтова гавань переважали P. nautica (93,9 %), Дача Ковалевського - V. harveyi (44,4 %), Дельфін - V. natriegens (43,0 %).

Більша видова різноманітність домінуючих гетеротрофних бактерій характерна для мікробних ценозів морської води станції Дельфін як при виділенні на середовищі без додавання металу, так і на середовищах зі свинцем та ртуттю.

На відміну від даних, отриманих раніше, не встановлено помітного домінування у водах Одеського прибережжя представників грампозитивних бактерій родів Micrococcus і Bacillus. Підтверджено перевагу грамнегативних бактерій комплексу Vibrio - Aeromonas - Photobacterium - Lucibacterium (Цыбань, 1990; Теплинская и др., 1984).

Зміна стійкості морських бактерій в умовах присутності й відсутності важких металів

Резистентність до свинцю, кадмію й ртуті морських бактерій в умовах відсутності важких металів. Змодельовані в лабораторії умови дозволили відзначити, як відбувається зміна резистентності до важких металів у бактерій з високим рівнем стійкості в порівнянні з мікроорганізмами, що мають фонові значення резистентності.

Під час відсутності впливу свинцю, кадмію й ртуті відзначена схожа картина зниження резистентності до кожного з металів досліджених гетеротрофних бактерій з вихідним фоновим і високим рівнем резистентності.

Найбільш консервативною ознакою виявилася резистентність обох груп досліджених штамів до свинцю, що у ході 12-місячного модельного експерименту зменшилось на 6,7 - 9,8 %. Найбільшою мірою протягом річного спостереження втрачається стійкість до ртуті - на 79 - 92 %.

Бактерії з високим рівнем резистентності, виділені на живильному середовищі із важким металом, після 12-місячної підтримки зберегли більш високі значення МІК металу, ніж бактерії, виділені на середовищі без токсиканту.

Резистентність до свинцю, кадмію й ртуті морських бактерій в умовах присутності важких металів. У модельному експерименті використані бактерії, які підтримувалися на середовищах без важких металів. Через дев'ять місяців після початку експерименту дослідну частину культур морських бактерій, резистентних до свинцю, кадмію й ртуті, перенесли на живильні середовища із відповідним металом, а контрольну групу продовжували зберігати на середовищі без важких металів ще 12 місяців.

У присутності свинцю, кадмію й ртуті в живильному агарі протягом перших 3-х місяців відзначалися адаптивні зміни у бактерій, які проявлялися в підвищенні рівнів резистентності до цих металів, потім до 6, 9 і 12 місяця спостерігалося зниження резистентності, аналогічне тому, що мало місце на середовищах без токсикантів.

Наявність важкого металу в живильному середовищі протягом перших трьох місяців підвищувало резистентність бактерій одночасно й до двох інших досліджених металів. Зниження резистентності бактерій до ртуті й кадмію відбувалося інтенсивніше, ніж до свинцю.

Присутність металу в живильному середовищі призводило до збереження більш високих значень МІК всіх досліджених металів, ніж підтримка без токсикантів.

Акумуляція кадмію гетеротрофними морськими бактеріями. Вивчення здатності акумулювати важкі метали домінуючими бактеріями на прикладі кадмію показово для характеристики еколого-фізіологічних властивостей морських мікроценозів. Накопичення металу мікробними клітинами в природних середовищах з низькою концентрацією токсиканта, як це має місце в дослідженому районі, збільшує його мутагенну й токсичну дію на мікроорганізми. резистентність бактеріопланктон одеський гетеротрофний

Для проведення досліджень була обрана концентрація кадмію 0,27 ммоль/л (30 мкг/мл), близька до максимальних концентрацій, при яких ще спостерігається ріст культур досліджених мікроорганізмів, і відповідному високому рівню забруднення кадмієм природного середовища.

У результаті експерименту встановлено, що досліджені гетеротрофні морські бактерії здатні акумулювати кадмій у межах 1,7 - 7,5 мг/г сухої біомаси з максимальним рівнем накопичення через 10 - 15 хвилин експозиції. Найбільше значення ефективності акумуляції відзначене для E. agglomerans 61/69 - 3,2 % і V. harveyi 63/71 - 3,1 %. Не виявлено статистично достовірних відмінностей у накопиченні кадмію бактеріями з високим і низьким рівнем резистентності до цього металу.

Одержали подальший розвиток уявлення про кількісний і якісний склад гетеротрофних бактерій частини Одеського прибережжя, що доповнює наявні відомості про біологічну різноманітність мікробних ценозів так званих “малих акваторій” з постійно діючими “зливовими” стоками й утрудненим водообміном з відкритою частиною моря. Гетеротрофні бактерії як компонент мікробного співтовариства характеризувалися реакцією на стрес, викликаний токсичними металами, що вказує на можливу наявність природних генетично детермінованих механізмів резистентності бактерій до токсичних металів, що сформувалися у відповідь на зроблений раніше значний антропогенний вплив. Уперше проведена мікробна індикація районів з різним антропогенним навантаженням дозволила підтвердити припущення про використання цього методу в комплексному екологічному моніторингу морських екосистем.

Висновки

1. Вміст Pb і Cd у прибережній воді на станціях Нафтова гавань, Дача Ковалевського й Дельфін перевищує мінімальні мутагенні концентрації в 14,2 - 32,3 і 4,0 - 6,2 рази відповідно.

2. Проби морської води індукують у Salmonella typhimurium TA 98 вихід мутацій, середні значення яких перевищують рівень спонтанних мутацій для Нафтової гавані в 6,8 рази, Дачі Ковалевського - 4,6 рази, Дельфіна - 1,3 рази. Виявлено тісні кореляційні зв'язки між мутагенною активністю й присутністю у воді Нафтової гавані й Дачі Ковалевського Cd і Pb.

3. Вміст бактеріопланктону на всіх станціях був найбільшим у літній період і зменшувався в ряду літо, осінь, весна, зима. Протягом усіх сезонів найбільший вміст бактерій встановлений на станції Нафтова гавань (від 490 до 9540 КУО/мл), найменший - на станції Дельфін (від 120 до 2710 КУО/мл).

4. У морських біоценозах виявлені бактерії, резистентні до концентрацій металів, що у багато разів перевищують їх вміст в морській воді. Абсолютні значення МІК Pb для бактерій всіх досліджених станцій склали 1,5 ммоль/л, Cd - 1 ммоль/л, Hg - 0,1 ммоль/л.

5. Рівень резистентності представників бактеріопланктону вивчених станцій до Pb, Cd, Hg за всіма показниками (значенням МІК, часткою резистентних бактерій і співвідношенням Nr : Ns) в усі сезони зменшується в ряду: Нафтова гавань, Дача Ковалевського, Дельфін, що узгоджується з рівнем антропогенного забруднення цих районів.

6. Серед бактерій, що найчастіше зустрічалися в відібраних пробах, домінували: у районі станції Дельфін - Pseudomonas stutzeri, Vibrio alginolyticus, Vibrio natriegens, Enterobacter agglomerans, Дачі Ковалевського - Vibrio campbellii, Vibrio harveyi і Aeromonas veronii, Нафтової гавані - Vibrio nereis і Pseudomonas nautica.

7. Уперше на досліджених станціях установлена видова різноманітність представників бактеріопланктону, резистентних до Pb, Cd, Hg. Серед бактерій, резистентних до Pb, переважають представники видів Vibrio nereis, Vibrio campbellii, Vibrio natriegens, до Cd - Enterobacter agglomerans, Vibrio harveyi, Vibrio nereis, до Hg - Pseudomonas nautica, Vibrio harveyi, Vibrio natriegens.

8. При підтримці бактерій на середовищі без металів рівень резистентності до них має стабільну тенденцію до зниження. Досліджені штами з фоновим і високим рівнем резистентності до металів за 12 місяців підтримки зменшили вихідні значення МІК Pb відповідно на 9,8 % і 6,7 %, Cd - на 53,7 % і 69,0 %, Hg - на 92,0 % і 79,0 %.

9. При тривалому впливі токсикантів у бактерій відзначалися адаптивні зміни, що у перші три місяці проявились у збільшенні МІК всіх досліджених металів. Згодом, до 12 місяця значення МІК Pb знижувалися на 9,8 %, Cd - на 46,2 %, Hg - на 50,0 %.

10. Ізольовані з морської води бактерії характеризуються здатністю акумулювати Cd у межах 1,7 - 7,5 мг/г сухої біомаси. Статистично достовірної залежності між рівнем резистентності досліджених морських бактерій до Cd і здатністю акумулювати цей метал не встановлено.

11. Отримані результати дають підставу рекомендувати для практичного використання показника резистентності бактеріопланктону до Pb, Cd, Hg як інтегрального показника реакції мікробіоти морських біоценозів на антропогенне забруднення в комплексному екологічному моніторингу.

Роботи, опубліковані по темі дисертації

Ivanitsa V.A., Buchtiyarov A.Ye. Resistance level to heavy metals of microbial coenoses of the Black Sea shoreface // Вісник Одеського державного університету. - 2000. - Т. 5, Вип. 1. - С. 204-208.

Іваниця В.О., Бухтіяров А.Є. Стійкість морських гетеротрофних бактерій до іонів важких металів за умов їх збереження // Вісник Одеського національного університету. - 2001. - Т. 6, Вип. 1. - С. 139-145.

Иваница В.А., Бухтияров А.Е. Резистентность доминирующих морских бактерий к Hg²⁺, Cd²⁺, Pb²⁺ в условиях их хранения // Вісник Одеського національного університету. - 2001. - Т. 6, Вип. 4. - С. 120-124.

Иваница В.А., Бухтияров А.Е., Захария А.Н. Aккумуляция кадмия морскими бактериями // Вісник Одеського національного університету. - 2002. - Т. 7, Вип. 1. - С. 200-204.

Иваница В.А., Бухтияров А.Е. Таксономический состав гетеротрофных бактерий Одесского прибережья, устойчивых к тяжелым металлам // Морской экологический журнал. - 2004. - Т. 3. - С. 49-54.

Иваница В.А., Бухтияров А.Е. Токсическое и мутагенное действие тяжелых металлов на гетеротрофные бактерии Одесского прибережья // Наук. зап. Тернопільського нац. пед. унів. ім. Володимира Гнатюка. Серія: Біологія. Спец. вип. “Гідроекологія”. - 2005. - № 4 (27). - С. 102-103.

Бухтияров А.Е., Иваница В.А. Устойчивость к тяжелым металлам бактерий, выделенных из прибрежных вод Черного моря // Сборник конф. молод. ученых “Понт Эвксинский 2000”. - Севастополь, 2000. - С. 16-17.

Бухтияров А.Е. Воздействие тяжелых металлов на морские бактерии // Тез. докл. 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология - наука XXI века”. - Пущино (Россия), 2002. - Т. 3. - С. 11-12.

Bukhtiyarov A.E., Ivanitsa V.A. Influence of heavy metals on the Black sea bacteria // Abstracts of the 1st Congress of European Microbiologists FEMS 2003. - Ljubljana (Slovenia), 2003. - Р. 367.

Бухтияров А.Е., Иваница В.А. Характеристика доминантных бактерий Одесского залива // Тез. докл. Юбилейной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 180-летию со дня рождения Л. С. Ценковского. - Одесса, 2004. - С. 24.

Іваниця В.О., Бухтіяров А.Є. Вплив важких металів на гетеротрофні морські бактерії Одеської затоки // Вісник Одеського національного університету. - 2004. - № 7. - С. 210.

Бухтияров А.Е. Устойчивость черноморских бактерий к тяжелым металлам в условиях их хранения в коллекции // Тез. докл. 8-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология - наука 21-го века“. - Пущино (Россия), 2004. - С. 143.

Бухтіяров А.Є. Накопичення кадмію гетеротрофними бактеріями Одеської затоки // Тези конференції молодих учених “Сучасні проблеми екології”. -Запоріжжя, 2004. - С. 113-115.

Bukhtiyarov A.E., Ivanytsya V.O. Odessa coast heterotrophic marine bacteria's resistance to heavy metals // Abstracts of the International Marine Biotechnology Conference, St. John's, Newfoundland (Canada), 2005. - P. 118.

Анотації

Бухтіяров А.Є. Резистентність гетеротрофних морських бактерій Одеського прибережжя до важких металів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.17 - гідробіологія. - Інститут біології південних морів ім. О. О. Ковалевського НАН України. Севастополь, 2006.

Дисертація присвячена вивченню видового складу гетеротрофного бактеріопланктону і стійкості домінуючих морських бактерій до важких металів. У прибережній воді визначений вміст Pb, Cd, Hg, оцінена їхня мутагенність. Встановлена кількість гетеротрофних бактерій в усі сезони року і видовий склад домінуючих представників відповідно до сучасної номенклатури. Виявлено, що МІК Pb, Cd, Hg перевищують їхній вміст у морській воді. Резистентність морських бактерій зростає відповідно до рівня антропогенного забруднення. Створена колекція бактерій з різною стійкістю до Pb, Cd, Hg, встановлений їх якісний склад. Вивчена мінливість стійкості вилучених бактерій до Pb, Cd, Hg при підтримці на середовищі з важкими металами і без них. Оцінена здатність акумулювати Cd морськими бактеріями.

Ключові слова: Одеське прибережжя, важкі метали, мутагенність, гетеротрофні бактерії, видовий склад, резистентність, акумуляція.

Бухтияров А.Е. Устойчивость гетеротрофных морских бактерий Одесского прибрежья к тяжелым металлам. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.17 - гидробиология. - Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевского НАН Украины. Севастополь, 2006.

Диссертация посвящена определению количественного и качественного состава гетеротрофного бактериопланктона Одесского прибрежья и изучению взаимодействия доминирующих представителей морских бактерий с тяжелыми металлами.

В прибрежной воде вблизи г. Одессы на станциях Нефтяная гавань, Дача Ковалевского и Дельфин, характеризующихся различной экологической ситуацией, определено содержание свинца, кадмия и ртути. Выявлено, что пробы морской воды индуцируют в тест-системе Salmonella typhimurium TA 98 выход мутаций, среднее значение которых превышает уровень спонтанных мутаций.

Установлено количество гетеротрофных бактерий на всех исследованных станциях во все сезоны годы. Выявлено, что в морских биоценозах существуют микроорганизмы, устойчивые к концентрациям металлов, во много раз превышающим их содержание в морской воде. Определены значения МИК свинца, кадмия и ртути для микробиоты всех исследованных станций во все сезоны года. Определен уровень устойчивости представителей бактериопланктона Одесского прибрежья к изученным тяжелым металлам с использованием комплекса показателей (значение МИК тяжелых металлов, доля устойчивых к ним бактерий и соотношение численности резистентных бактерий к чувствительным). Установлено, что во все сезоны резистентность морских бактерий возрастает в ряду станций: Дельфин, Дача Ковалевского, Нефтяная гавань, что согласуется с уровнем антропогенного загрязнения этих районов.

Изолированные из морской воды исследованных станций доминирующие представители гетеротрофного бактериопланктона с фоновым и высоким уровнем устойчивости были грамотрицательные, каталазоположительные, неспороносные подвижные палочки, в подавляющем большинстве факультативные анаэробы, имеющие цитохромоксидазу и с окислительным и бродильным типом метаболизма. Впервые определен их видовой состав в соответствии с требованиями современной номенклатуры. Преобладающие бактерии в районе станции Дельфин представлены видами Pseudomonas stutzeri, Vibrio alginolyticus, V. natriegens, Enterobacter agglomerans, Дачи Ковалевского - видами V. campbellii, V. harveyi и Aeromonas veronii, Нефтяной гавани - видами V. nereis и P. nautica.

Впервые на исследованных станциях установлено видовое разнообразие представителей бактериопланктона, устойчивых к свинцу, кадмию и ртути. Среди бактерий, устойчивых к свинцу, доминируют V. nereis, V. campbellii, V. natriegens, к кадмию - E. agglomerans, V. harveyi, V. nereis, к ртути - P. nautica, V. harveyi, V. natriegens. Создана коллекция культур гетеротрофных морских бактерий с различными уровнями устойчивости к исследованным токсикантам.

В модельных экспериментах выявлены закономерности адаптации и изменчивости резистентности выделенных бактерий с исходным фоновым и высоким уровнем устойчивости к свинцу, кадмию и ртути в процессе их поддержания на среде с тяжелыми металлами и без них. При содержании микроорганизмов на среде без тяжелых металлов уровень резистентности к ним имеет устойчивую тенденцию к снижению.

Проведенные исследования с группой высокорезистентных к изученным металлам бактерий показали, что при длительном воздействии токсикантов у микроорганизмов отмечались адаптивные изменения, в первые три месяца проявившиеся в увеличении МИК всех исследованных металлов. Впоследствии, к 12 месяцу значения МИК Pb снижались на 9,8 %, Cd - на 46,2 %, Hg - на 50 %. Отмечено, что в течение годичного наблюдения бактерии, хранившиеся на среде с металлом, выявляли большие значения МИК металла, чем при поддержании без него.

На примере кадмия изучена способность к аккумуляции тяжелых металлов морской микробиотой. Изолированные из морской воды Одесского прибрежья представители гетеротрофного бактериопланктона аккумулировали кадмий в пределах 1,7 - 7,5 мг/г сухой биомассы. Статистически достоверной зависимости между уровнем устойчивости исследованных морских бактерий к кадмию и способностью их аккумулировать этот металл не установлено.

Полученные результаты дают основание рекомендовать использование устойчивости бактериопланктона к свинцу, кадмию, ртути как интегрального показателя реакции микробиоты морских биоценозов на антропогенное загрязнение морской среды в комплексном экологическом мониторинге морских экосистем.

Ключевые слова: Одесское прибрежье, тяжелые металлы, мутагенность, гетеротрофные бактерии, видовой состав, резистентность, аккумуляция.

Bukhtiyarov А.Е. The resistance of sea heterotrophic bacteria of Odessa coast to heavy metals. - Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.17 - hydrobiology. - А. О. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas, NAS of Ukraine. Sevastopol, 2006.

The thesis is dedicated to the study of species heterotrophic bacterioplancton content and dominant sea bacteria resistanse to heavy metals. Levels of Pb, Cd, Hg in coastal water and their mutagenity were estimated. The heterotrophic bacteria number in all seasons and the dominant representatives species composition were determined according to modern nomenclature. It was revealed that MICs of Pb, Cd, Hg exceeded their sea water levels. Resistance of sea bacteria grew according to anthropogeneous pollution levels. A collection of bacteria with various levels of resistance to Pb, Cd, Hg was created, their qualitative composition was determined. Changes of the isolated bacteria resistance to Pb, Cd, Hg was studied during their maintenance on media with and without heavy metals. The sea bacteria ability to accumulate Cd was evaluated.

Key words: Odessa coast, heavy metals, mutagenity, heterotrophic bacteria, species composition, resistance, accumulation.

Размещено на Allbest.ru

...