Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

УДК 575.16.017.22:582.28

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Поліваріантність онтогенезу міцеліальних мікроміцетів

03.00.14 - біологія розвитку

ГРОМОЗОВА Олена Миколаївна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Підгорський Валентин Степанович, Інститут мікробіології та вірусології НАН України, завідувач відділу фізіології промислових мікроорганізмів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Горовий Леонтій Федорович, Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, завідуючий лабораторією клітинної біології і біотехнології грибів;

доктор медичних наук, професор Войцеховський Валерій Григорович, Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології;

доктор біологічних наук, професор Бєлоусов Лев Володимирович, Московський державний університет ім. М.В. Ломоносова, професор кафедри ембріології.

Провідна установа: Київський Національний університет імені Тараса Шевченка Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться "30" січня 2007 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України (03143, м. Київ, вул. Заболотного, 148).

Автореферат розісланий 27.12. 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Поліваріантність онтогенезу є однією з важливих задач біології розвитку. З одного боку мова йде про макроструктури модульних організмів, їх функціональні та специфічні особливості та необхідность вивчення споріднених архитектурних моделей різного рівня організації. З іншого боку, питання формоутворення, як на етапі утворення окремих модулів, так і на стадії формування цілих структур, представляють значний інтерес для вивчення проблеми морфогенезу.

Літературні дані свідчать про те, що при усій специфічності подій формоутворення у біологічних об'єктів різної складності, безперечно, є загальні принципи та механізми, дослідження яких легше здійснити на більш простих моделях. На думку С. Шноля (1979), особливо актуальними є дослідження морфогенезу на рівні клітини та складно організованих одноклітинних організмів. Поряд з цим ми вважаємо перспективним вивчення відносно простих організмів, що розглядаються як перехід до багатоклітинних утворень. Такою моделлю може бути процес формоутворення міцелію мікроміцетів в умовах глибинного культивування.

Новизна та актуальність роботи визначаються також тим, що механізми формоутворення та особливості функціонування міцелію в глибинних умовах ще недостатньо вивчені. Більшість робіт, як свідчать літературні дані [Gibbs et al., 2000], мають описувальний характер та мало уваги приділяють причинам цього явища. Хоча відомо, що формі росту грибів відповідає певна спрямованість біосинтетичних процесів, вибір форми для біотехнологічного впровадження частіше за все здійснюється емпірично. Констатуючи наявність пелетного або нитчастого міцелію при зміні умов культивування, дослідники приділяють увагу коагуляційному шляху появи пелет, не пропонуючи модель молекулярного механізму цього явища, у більшості випадків заперечуючи його біологічну природу [Masanori et al., 1994]. Основні дослідження, що присвячені формоутворенню міцелію у глибинних умовах культивування, пов'язані з проблемами масообміну, обростання обладнання, фільтрації біомаси, впливу змішування на подрібнення міцелію тощо. В той же час деякі літературні дані свідчать на користь можливого біологічного морфогенезу [Wold, Suzuki, 1973; Gerin et al., 1993; Ziyu Dai et al., 2004]. В оглядах літератури Metz, Kossen, 1977; Seviour, Schmid, 2000] вказується на те, що невирішеними залишаються питання фізіолого-біохімічної та ультраструктурної гетерогенності окремих частин гіф, механізму фізико-хімічних впливів на метаболічні та морфологічні особливості мікроміцетів та інше. Визнаючи багатофакторний, і тому важко вивчаємий, характер формоутворення глибинного міцелію, Znidarsic, Pavko (2001) вважають, що без цього неможливо наблизитися до ефективного використання грибів в біотехнологічних процесах. Питання регуляції формоутворюючих процесів як на рівні сприйняття та передачі морфогенного сигналу, так і на рівні клітинної відповіді, не вивчено. За думкою Gadd (1994), передача сигналу є складною інтегральною системою багатьох процесів, що відбуваються в клітині, які у нитчастих мікроскопічних грибів мало досліджені на фізіологічному, клітинному та молекулярному рівнях.

Мета роботи: встановити роль адаптаційних процесів у поліморфному розвитку міцелію деяких мікроміцетів в умовах глибинного культивування та розробити модель механізмів керування їх морфогенезом на етапі передачі зовнішнього сигналу на внутрішньоклітинний регулятор.

Для досягнення вказаної мети були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Визначення впливу зовнішніх факторів на процес формування міцеліальних структур та їх типологізація на прикладі мікроміцетів з різною екологічною стратегією розвитку.

2. Вивчення механізмів взаємодії конідій на початкових стадіях формоутворення і регуляторних процесів, які забезпечують розвиток певної форми міцелію відповідно до умов культивування

3. Вивчення ролі ендогенних регуляторів: цАМФ, цГМФ, іонів кальцію в морфогенезі Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain.

4. Порівняльне дослідження фізіолого-біохімічних та енергетичних особливостей функціонування модульних та унітарних грибних об'єктів.

5. Розробка молекулярної моделі поліморфізму глибинного міцелію на прикладі T. terrestris.

Об'єкт дослідження: регуляторні механізми морфогенезу.

Предмет дослідження: формоутворення міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування.

Методи дослідження: вивчення особливостей пелетного та нитчастого міцелію проводили за допомогою комплексу мікробіологічних фізико-хімічних методів в умовах періодичного та безперервного культивування. Для дослідження поверхневих властивостей конідій застосовували методи атомно силової та електронної мікроскопії, з використанням лектинів мічених колоїдним золотом.

Наукова новизна. Вперше на основі комплексного вивчення структурних, функціональних та регуляторних аспектів запропоновано розглядати пелетну форму росту міцелію поряд з нитчастою, як прояв поліваріантності онтогенезу мікроміцетів, що розвиваються в умовах глибинного культивування. Вперше теоретично обґрунтовано та експериментально підтверджено механізм початкових етапів регуляції пелетного та нитчастого росту T. terrestris, що включає зміну роботи аденілатного комплексу шляхом варіації значень зовнішніх факторів середовища (рН, температура, тощо) та концентрації інокулюму або впливом високої концентрації глюкози, теофіліну, екзогенного цАМФ, агентів, що деполяризують мембрану. Доведено, що пелетна форма існування міцелію є проявом адаптивних реакцій організму на несприятливі умови існування. Вперше на підставі результатів комплексних фізіолого-біохімічних досліджень показано відповідність пелетного міцелію T. terrestris поведінці одноклітинних мікроорганізмів в умовах неспецифічного стресу, що підтверджує положення про функціональну подібність макроморфологічних структур модульних організмів з системами популяційного рівня.

Вперше встановлена стадія компетентності в морфогенезі грибів, що має чіткі часові межі та відповідає аналогічному періоду в ембріогенезі вищих організмів. Підтверджено положення про значну детермінуючу роль середовища у поліваріантності онтогенезу модульних організмів.

Вперше за допомогою методу атомно-силової мікроскопії виявлено відмінності в ультраструктурі поверхні та силах молекулярної взаємодії конідій з різною спрямованістю формоутворюючих процесів.

Вперше, на підставі порівняння одержаних експериментальних даних з літературними відомостями про класичний гіфально-дріжджовий диморфізм, запропоновано розширити це поняття до „поліморфізму вегетативних форм розвитку грибів”, залучивши до нього пелетну форму.

Вперше запропоновано використовувати процеси формоутворення міцелію у глибинних умовах культивування як експериментальну модель для вивчення регуляторних механізмів морфогенезу.

Практична цінність роботи. Одержані результати можуть бути використані при розробці біотехнологічних процесів за участю мікроміцетів (одержання білкових продуктів, біологічно активних речовин, у технології очистки стічних вод тощо), а також при викладанні курсу біології розвитку міцеліальних грибів. Виявлені закономірності дозволяють здійснити спрямоване культивування тієї чи іншої міцеліальної форми з відповідним типом метаболізму і тим самим підвищити ефективність біотехнологічних процесів отримання важливих для народного господарства продуктів. Отримані дані дозволяють розглядати пелетну форму T. terrestris, Chaetomium globosum Kunze et Fr. та темнозабарвлених мікроміцетів як індикатор на несприятливі умови культивування.

Розроблено методичні підходи на основі методів атомно-силової мікроскопії, хемілюмінесценції та механоемісії до вивчення механізмів клітинних взаємодій у лаг-фазі. Дані про роль лаг-фази як важливого періоду визначення морфофізіологічних особливостей росту мікроскопічних грибів мають враховуватися для активізації синтезу біологічних продуктів.

Зв'язок роботи з науковими програмами та темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планами наукових досліджень ІМВ НАНУ 01.9.10057657, а також наукових програм з фундаментальних та прикладних досліджень Міністерства освіти та науки України: 0195VO277711, 11-05-95-5.3/74, 5/89. Форма участі автора у цих проектах: науковиий керівник або відповідальний виконавець.

Конкретна особиста участь автора в одержаних результатах. Автору належить ідея адаптивності форм міцелію у глибинних умовах культивування до факторів зовнішнього середовища та механізму їх формоутворюючих процесів як прояву поведінки самоорганізуючої системи. Здобувач розробив та виконав програму комплексних досліджень, здійснив аналіз та обробку одержаних даних, виконав теоретичні роботи та відповідні розрахунки, сформулював висновки, узагальнення та наукові положення. Експериментальні матеріали, що викладені в дисертації, отримані автором особисто та разом зі співробітниками очолюваної автором групи відділу фізіології промислових мікроорганізмів. Вивчення енергетичної ефективності росту, вміст АТФ и ІК-спектрометрію проводили в Інституті мікробіологіі ім. А. Кирхенштейна АН Латвії разом з д.б.н. Швидке Ю., к.б.н. Галининою Н., к.б.н. Загребою Е., к.б.н. Грубе М. Розділ 3.2 виконано сумісно з д.б.н. Садовським М. - співробітником Інституту біофізики Сиб. відд. АН Росії, атомно-силову мікроскопію проведено за допомогою к.ф-м.н. Литвина П.М. (Інститут фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України), электронну мікроскопію - за участю Степанка В.В. (ІМВ ім. Д.К. Заболотного НАНУ). Електромагнітне випромінювання досліджувалося за допомогою обладнання фізико-технічної лабораторії Інституту онкології МОЗ України, під керівництвом проф., д.б.н. Орла В.Е. Автор висловлює подяку д.б.н., проф. Ждановій Н.М. та к.б.н. Захарченко В.А. за допомогу у питаннях мікології.

Апробація роботи. Матеріали та основні положення дисертації доповідалися на IV Всесоюзній конференції "Управляемое культивирование микроорганизмов", Пущино, 1986 р., Всесоюзних конференціях: "Теоретические основы микробной конверсии", 1988 p., м. Рига, "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов", Пущино, 1989 р. "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды", м. Київ, 1990 р., VII, VIII з'їздах Українського мікробіологічного товариства (Чернівці, 1989 р., та Одеса, 1994 р.), на 9-му з'їзді Українського ботанічного товариства, Дніпропетровськ, 1992 р., на семінарі з проблем морфогенезу, МДУ, Москва, 1996 р., на 8-му Європейському конгресі по біотехнології, Будапешт, 1997 р., на конференції "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" МДУ, 1998 р., на 2-й Міжнародній конференції "Неравновесные когерентные системы в биологии, биофизике и биотехнологии", Москва, 1999 р., на II-му Міжнародному конгресі "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине", Санкт-Петербург, 2000 р. на III-му Міжнародному семінарі: "Минералогия и жизнь: биоминеральные гомологи", Сиктивкар, 2000 р., на Міжнародній конференції "Микробиология и биотехнология ХХ1 столетия", Мінськ, 2002 р., на І-му та IV-му Всеросійському конгресі з медичної мікології, Москва, 2002 - 2006 рр., на засіданні ботанічної секції в Інституті ботаніки НАНУ, неодноразово на конференціях та семінарах ІМВ НАНУ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 43 наукових праці, у тому числі 30 статей у фахових журналах, 13 тез доповідей на наукових конференціях та з'їздах.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку цитованої літератури (396 першоджерел). Робота викладена на 306 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 23 таблицями, 99 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури складається з 2 підрозділів. В першому підрозділі дана загальна характеристика сучасного стану проблеми морфогенезу. Розглянуто його основні положення та механізми. Представлено складність і багатофакторність проблеми, яка не зводиться лише до вивчення генетичних аспектів при поясненні розвитку просторової конфігурації живих об'єктів. Дана характеристика основних механізмів розвитку організмів різних ступенів складності. Обгрунтовано проведення досліджень щодо аспектів морфогенезу на більш простіших моделях.

В підрозділі два розглянуто як модель морфогенезу поліморфізм міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування. Особлива увага приділяється дискусійним питанням щодо процесу пелетоутворення і механізмів цього явища. Розглянуто фізичні причини агрегації конідій та їх поведінка як колоїдних часток.

Матеріали та методи дослідження. Предметом дослідження є формоутворення міцелію мікроскопічних грибів в умовах глибинного культивування. Дослідження проводили на прикладі Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain (оптим. темп. 37 - 42 ^оС, рН 4,0), продуцент кормового білка [Билай и др., 1985], Cladosporium cladosporioides (Fresen) de Vries - продуцент меланіну та його alb-мутант, одержаний при опроміненні батьківського штаму високими дозами -променів [Жданова и др., 1985], а також Cladosporium gerbarum (Pers.) Lk: S.F. Gray, 1453, Cladosporium sphaerospermum Penzig, 1059, Arthrinium state of Apiospora montagnei Sacc., 2416, Ulocladium botrytis Press, 2075 (опт. темп. 25 - 28 ^оС, рН 7,0) з колекції відділу фізіології та систематики мікроміцетів ІМВ НАНУ та Chaetomium globosum Kunze et Fr., № 209 з ВКМ (оптим.темп. 25 - 28 ^оС, рН 7,0).

Культивування грибів проводилося в качалочних колбах, у ферментерах "АНКУМ-2" і "Вiotec", на рідкому середовищі Чапека в періодичних та безперервних умовах. Стаціонарний стан контролювали за концентрацією кисню.

Фізіологічні показники (економічний, метаболічний коефіцієнти, коефіцієнт підтримання, питома швидкість росту, константа насичення та інгібування) розраховували, базуючись на отриманих експериментальних даних за відомими формулами [Перт, 1978]. Апікальну швидкість росту визначали при проростанні конідій, що були орієнтовані на нитчастий чи пелетний ріст, у препараті "висяча крапля" шляхом вимірювання довжини гіфи через певні часові інтервали за допомогою мікроскопу МБІ-15 (ЛОМО). Дослідження, що пов'язані з визначенням енергетичної ефективності росту, проводили при трьох типах С-ліміту: в стаціонарній фазі періодичної культури, при лімітуванні вуглецевим субстратом у режимі хемостату та в умовах глибокого лімітування після зупинки протоку та виходу СО₂ у постійний режим. Енергетичну ефективність росту () розраховували за описаним [Бабурин и др., 1987] способом. Експериментальні дані для розрахунків одержували, використовуючи імпульсний метод підживлення різними джерелами вуглецю (по 5 - 10 мл 5 %-го розчину глюкози, лактози, ксилози, ацетату та етанолу), вимірюючи при цьому концентрацію кисню в повітрі, що виходить з ферментера. Вимірювання інтенсивності дихання проводили газо-балансовим методом за допомогою пульту газоаналізаторів ПГА (виробництва експриментального електромеханічного заводу фізико-енергетичного інституту, Латвія). Біологічне споживання кисню визначали шляхом інтегрування кривої інтенсивності змін його концентрації.

Ростові характеристики T. terrestris на твердому поживному середовищі досліджували, використовуючи платівки кремньокислого гелю, що були насичені рідким середовищем Чапека з різною концентрацією глюкози (0,005 - 40 г/л). Відповідні розрахунки здійснювали загальновідомими методами [Тrinci, 1971]. Периферійну зону росту визначали морфометричним методом з покривними скельцями [Bainbridge, 1976].

В умовах глибинного культивування пелетний та нитчастий ріст отримували шляхом зміни рН-середовища, температури, концентрації інокулюму. Біомасу визначали ваговим методом. Вміст вуглецю в біомасі та культуральній рідині встановлювали шляхом спалювання зразків у кисні з наступним вимірюванням об'єму вуглецевого газу в аналізаторі АН 7560 (Гомельский завод вимірювальних приладів). Вміст метаболітів визначали з урахуванням неспожитої глюкози.

Для руйнування агломератів конідій спорову суспензію обробляли за допомогою установки УЗДН-2 при силі струму 0,2 мА, частоті 22 кГц впродовж 1; 3; 5; 8 хвилин. Підрахунок конідій проводили в камері Горяєва.

З метою визначення тотипотентності конідій T. terrestris спорову суспензію вносили в середовище Чапека при рН 4,0. Через 24 години інкубації при оптимальній для цього гриба температурі біомасу відокремлювали від культуральної рідини фільтруванням. Конідії, що не проросли в цих умовах, осаджували центрифугуванням, поділивши навпіл, та інкубували як за умов "пелетного" (рН 7,0), так і "нитчастого" росту (рН 4,0). Усі операції проводили в стерильних умовах. Підрахунок конідій здійснювали у камері Горяєва та статистично обробляли. Результати експериментів фіксували візуально.

При виконанні робіт по визначенню впливу передісторії посівного матеріалу, на формоутворення T. terrestris проводили на середовищі Чапека з відповідними стосовно рН умовами розвитку пелетної чи нитчастої форми. Посівний матеріал для наступного культивування одержували шляхом гомогенізації дводобового міцелію за допомогою гомогенізатора MPW-302 та в різній кількості вносили в середовище Чапека. Через 48 годин культивування гриба фіксували форму росту та визначали кількість біомаси.

При дослідженні впливу поживних речовин на морфологію міцелія в середовище вносили азотнокислий амоній в концентрації від 0,025 до 2 % , та глюкозу - від 0,05 % до 8 %. В дослідах з визначення впливу кисню на формоутворення перші 10 годин культивування проводили з використанням аргону. Вплив механічної дії оцінювали при зміні швидкості обертання мішалки (120 - 140 оберт/хв.) та в системі барботажу. Оцінка міцелію проводилася як візуально, так і при мікроскопіюванні (у тому числі конідій на різних етапах проростання) у світловому, фазово-контрастному, електронному та атомно-силовому мікроскопах. Ультратонкі зрізи конідій фіксували КМnО₄ и 1 %-им розчином ОsO₄ у веронал-ацетатному буфері з рН 6,3 [Степанюк, Квасников, 1981]. У процесі дегідратації конідії обробляли 2 %-вим розчином уранілацетату та контрастували, використовуючи цитрат свинцю. Аналізували конідії в електронному мікроскопі "JEOL", Японія, при збільшенні у 10 - 40 тис. разів.

Дослідження структури поверхні конідій, а саме адгезійних та в'язкопружних її властивостей, провадили методом атомно-силової мікроскопії (АСМ) [Binnig et al., 1986] за допомогою AСM DI NanoScope a, серії Dimention 3000. Вимірювання здійснювали у резонансному режимі (tapping mode) з використанням стандартних зондів з нітриду кремнію (Si₃N₄). Радіус кривизни вістря зонду складав  10 нм, довжина консолі - 125 м, частота механічного резонансу - 300 - 340 кГц, швидкість сканування дорівнювала 4,2 м/с. При АСМ одночасно з картографуванням висоти рельєфу (топографії) фіксувалася зміна коливань зонда, що дозволяло після обробки на ЕОМ кількісно визначати адгезійні та в'язкопружні властивості досліджуваної поверхні.

Візуалізацію приклітинних вуглеводів при розвитку конідій T. terrestris здійснювали за допомогою лектинів, що мічені колоїдним золотом. Зразки досліджували в електронному мікроскопі ЕМВ-БР (Суми, Україна) при збільшенні у 10 - 20 тис. разів. Підготовка проб здійснювалася за методикою [Скрипаль и др., 1996]. Використовували рослинні лектини сої, картоплі, пшениці, фасолі, конканавалін А виробництва "Лектинотест" (Львів, Україна).

Визначення АТФ проводили біолюмінесцентним методом на LKB-люмінометрі, попередньо відмивши інтактний міцелій від культуральної рідини та обробивши його 5%-им розчином трихлороцетової кислоти [Lundin et al., 1976]. Пул ендогенного цАМФ и цГМФ визначали, використовуючи набір реактивів "Amersham". Підготовка проб міцелію та конідій проводилася згідно з методикиою [Scott, Solomon, 1975]. Дію екзогенного цАМФ вивчали, вносячи 0,1 - 1,6 мМ на початку культивування конідій та на стадії експоненціального росту гриба. Теофілін вносили в ті самі строки в концентрації 10 мМ. Дія солей кальцію на формоутворення міцелію вивчалася при внесенні кальцію: хлористого 1 - 100 мМ, оцетовокислого 1 - 30 мМ, сірчанокислого 0,1 - 100 мМ, вуглекислого 1 - 100 мМ та азотнокислого 1 - 500 мМ. Морфогенні концентрації хлористого кальцію (завбільшки 30 мМ) вносили на різних стадіях розвитку гриба: в стадії набряку конідій, в період їх проростання, в період створення септ та на початку розгалуження. З метою інгібування кальмодуліну застосовували хлорпромазин (5 - 200 мМ), а для інгібування кальцієвих каналів - веропаміл (1 мМ).

Дослідження дії одно- та двохвалентних солей на характер росту T. terrestris проводили, використовуючи хлористий калій, натрій, амоній, кальцій, магній, стронцій, нікель, цинк у концентрації від 10 до 100 мМ.

Участь цитоплазматичної мембрани (ЦПМ) у процесах формоутворення досліджували методом інгібіторного аналізу, використовуючи ністатин (3 мкг/мл), 2,4-динітрофенол (60 мкМ/мл), фторцианід-м-хлорфенілгідразон (FCCP) (6 мкМ/мл) та високі концентрації хлористого калію (від 100 до 900 мМ). Інгібітори вносили на різних стадіях культивування. Експозиція складала від 15 хвилин до 1 години. Проби ретельно відмивали, тричі центрифугуючи при 4000 оберт/хв. 5 хв., та продовжували культивування у свіжому поживному середовищі без інгібітору. Вплив інгібіторів оцінювали за морфологією міцелію, візуально та при його мікроскопії.

Інтенсивність ендогенного дихання визначали полярографічним методом (полярограф LP-7) у 0,2 М фосфат-цитратному буфері в діапазоні рН 2,5-8,0. Рівень ендогенного дихання відбивали в н.г-атомах О₂ мг^-1 білка хв.^-1. Досліди проводили в термостатованій комірці при температурі 37 С для T. terrestris и 28 С для C. globosum у 0,2 М натрій-фосфатному буфері.

Як хімічні та функціональні аналоги мембранотропних ауторегуляторів використовували 4-н-гексилрезорцин (аналог d1) та олеїнову кислоту (аналог d2) [Єль-Регістан, 1988] (у концентраціях: 6·10^-3; 6·10^-4; 6·10^-6; 6·10^-7; 6·10^-8; 6·10^-9 М, та - 0,01; 0,1 - 1,0 об.% відповідно). Для підрахунків діаметру та кількості агломератів використовували мікроскоп типу МПБ-2.

Електричні властивості конідій досліджували методом мікроелектрофорезу [Глоба, Гордієнко, 1980]. Ступінь гідрофобності конідій визначали у пробах з додаванням н-гексадекану [Rosenberg et al., 1980]. Наявність лектинів досліджували за реакцією гемаглютинації кролячих еритроцитів [Луцик и др., 1980].

Дію поверхнево-активних речовин на агрегацію конідій та ріст Cladosporium cladosporioides встановлювали при внесенні в поживне середовище катіонної ПАР (ацетилтриметиламонію броміду) в концентраціях 0,001 - 0,1 %, аніонної ПАР (додецилсульфату натрію) в концентрації від 0,001 % до 0,01 % та не іонних ПАР (стеарокс-920, гідронол -200, твін-80) у концентраціях від 0,01 до 0,1 %.

Клітинні стінки пелетного та нитчастого міцелію одержували шляхом гомогенізації препаратів на гомогенізаторі MPW-302 впродовж 2, 4, 6 хвилин та обробки міцелію ультразвуком при 22 кГц 5 - 7 хвилин з наступним відмиванням зразків, тричі центрифугуючи їх при 5000 оберт/хв. впродовж 5 хв.

Склад клітинних стінок та біомаси міцелію аналізували методом ІК-спектроскопії на приладі UR-20 (Німеччина). Результати кількісного аналізу окремих компонентів відображено у відсотках від ваги абсолютно сухої біомаси. Вміст амінокислот у біомасі визначали за допомогою амінокислотного аналізатора ААА-339 Т "Мікротехніка" після гідролізу міцелію при 105 ^оС 6 N соляною кислотою впродовж 24 - 48 годин. Енергетичні витрати при біосинтезі амінокислот розраховували по коефіцієнтах, запропонованих у роботах [Stouthamer, 1973; Иванов, Стабникова, 1987].

Вплив інгібіторів генної експресії на формоутворення T. terrestris досліджували додаючи до середовища культивування: актиноміцин Д (20; 50 мкг/мл "Rеanal" Угорщина), рибонуклеазу В (РНКаза В) (0,02; 0,2; 2,0; 20,0 мкг/мл) ICN "Biomedical" USA, DL-етіанін (0,1; 1,0; 10,0; 20,0 мкг/мл) ICN "Biomedical", пуроміцин (0,1; 1,0; 10,0; 20,0 мкг/мл) "Fluka" (Switzerland).

Протопласти одержували з різних ділянок нитчастого та пелетного міцелію шляхом обробки його комплексом літичних ферментів травного соку виноградних равликів. Особливості протопластування детально викладено в роботі [Блажчук и др., 1991]. Фракціонування протопластів досягали шляхом різної експозиції досліджуваного міцелію у літичному середовищі з наступним відокремленням їх шляхом центрифугування.

Вимірювання спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ) у діапазоні 200 - 650 нм проводили за допомогою хемілюмінометру ХЛМЦ-О1 (Україна) за методикою [Барабой и др., 1991]. Вимірювання механоемісії (МЕ) у діапазоні 100 Гц - 0,1 МГц було проведено на приладі ТРА-3 зі застосуванням методики, що описана [Орел и др., 1994]. Побудову фазового портрету МЕ спор проведено за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 7,0.

Розрахунки енергії взаємодії конідій у рідкому середовищі Чапека було проведено за відповідними формулами, поданими в роботах [Кройт, 1955; Seaman, 1967; Napper, 1983; Bell et al., 1984;]. Значення вихідних параметрів одержано експериментально та з літературних джерел. Усі розрахунки та графічні роботи проводили за допомогою комп'ютерної програми Microsoft Excel 2000.

Статистична обробка даних проведена загальноприйнятими методами [Ашмарін, Воробйов, 1961].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Вивчення дії системи формоутворюючих факторів у мікроміцетів.

Для перевірки висунутої нами гіпотези щодо адаптивності форми міцелію до умов культивування ми дослідили характер росту меланінсинтезуючих грибів, а також термофільного мікроміцету T. terrestris (Apinis) Malloch et Cain (T 37 - 42 ^oC) та мезофільного Chaetomium globosum (T 25 - 28 ^oC). Ці мікроорганізми відрізнялися також оптимальними для життєдіяльності значеннями кислотності середовища (рН 4,0 для T. terrestris, рН 7,0 для C. globosum).

На прикладі T. terrestris та C. globosum показано, що кислотність середовища, температура інкубації та концентрація посівного матеріалу є морфогенними факторами, які визначають форму міцелію. Відмінність одержаних нами результатів за відомими з літератури даними полягає в тому, що в оптимальних для життєдіяльності мікроміцетів умовах фіксували нитчасту форму росту, а у несприятливих - пелетну. З даних таблиць 1 та 2 видно, що форма міцелію залежить від початкових значень рН середовища, але перш за все вона визначається фізіологічними особливостями мікроміцетів. Низькі значення рН, висока температура та концентрація посівного матеріалу сприяють розвитку нитчастої форми термофільного гриба T. terrestris, тоді як пелетний ріст відмічався при високих значеннях рН, низькій температурі та концентрації інокулюма. Для мезофільного організму C. globosum нитчаста форма відповідає високим значенням рН, низькій температурі, у той час як пелетна низьким значенням рН та високій температурі.

Ці дані вказують на адаптивний характер формоутворення грибів. Разом з тим впливу кисню, вуглерод- та азотвміщуючих субстратів (0,5 - 2 %) на морфологію не виявлено. Виключення становлять високі концентрації глюкози (більше 3 %), котрі призводять до розвитку нитчастого міцелію у презумптивно пелетному рості. Додавання глюкози при культивуванні конідій з "нитчастою" стратегією росту не впливало на форму розвинутого міцелію, залишаючи її нитчастою.

Показано, що пелетоутворення C. cladosporioides, у першу чергу, обумовлено високим (99,8 0,17 %) ступенем гідрофобності конідій та нерівністю їх поверхні, що пов'язано з наявністю меланінового пігменту. Обробка спорової суспензії ультразвуком впродовж 7 хвилин призводила до повного руйнування агломератів. Але після цього спори знов коагулювали з утворенням у перші хвилини дрібних, а через деякий час - великих (до 100 - 200 од.) агрегатів. З метою гідрофілізації поверхні конідій у середовище вносили катіонні, аніонні та неіоногенні поверхнево-активні речовини (ПАР).

Як показали наші дослідження, їх дія була неефективною. Гідрофобність вдалося знизити лише до 70 %, Усі ПАР відзначалися токсичністю по відношенню до C. cladosporioides. З метою зниження ступеня обростання грибом обладнання та одержання більш однорідної за розмірами та формою біомаси можна рекомендувати вводити в середовище Твін-80 (0,001 %). Пелетна форма C. cladosporioides, на наш погляд, є наслідком високої резистентності цього гриба до умов зовнішнього середовища, про що свідчить характер росту alb-мутанту, гідрофобність поверхні якого дорівнює 14  0,7 %. Незважаючи на відсутність меланіну при зміні умов культивування (рН, температуру, концентрацію інокулюму та ін.), мутантний штам розвивався тільки у пелетній формі.

Дослідження, проведені з іншими темнозабарвленими грибами: C. gerbarum, C. sphaerospernum, A. montagnei, U. botrytis, підтвердили ці висновки та продемонстрували, що за допомогою факторів зовнішнього середовища регулюються біосинтетичні процеси, розміри пелет та морфологія гіф, ступінь конідіації, адгезивні властивості. Однак всі ці зміни відбуваються у межах единої програми пелетного росту.

Експериментально було показано, що передбаченість розвитку інкубованих конідій в нитчасту або пелетну форми відсутня, тобто вони тотипотентні.

На прикладі T. terrestris доведена відсутність початкової запрограмованості розвитку конідій у нитчасту чи пелетну форми, тобто їх тотипотентність. Показано, що крім факторів зовнішнього середовища велике значення має передісторія посівного матеріалу. Форма міцелію, що використовується як посівний матеріал впливає на форму наступного покоління, визначаючи як точку переходу від однієї форми до іншої, так і межі її розповсюдження. Тобто, якщо інокулюм представлено подрібненим нитчастим міцелієм, то нитчаста форма розвивається в межах рН 3,0 - 5,0 при різних концентраціях інокулюму. У цьому випадку пелетна форма проявляється при рН 6,0 та рН 5,0 лише при низьких концентраціях посівного материалу. Межі існування гриба за фактором рН звужуються. При рН 7,0 - 8,0 спостерігається мізерний ріст, що морфологічно фіксується як суспензія.

У випадку пелетної передісторії у широких межах рН фіксується ріст у вигляді кульок. Нитчастий ріст зафіксовано лише при рН 4,0, концентрації інокулюму 1410^-4 г/100мл. При рН 3,0 (концентрація інокулюму 7-14 10^-4 г/100мл ) та при рН 5,0 відмічається змішаний ріст. Гриб розвивається при рН 7,0 - 8,0, створюючи пелети та "крупу".

Значення рН при якому здійснюється перехід від однієї форми міцелію до іншої позначимо як точку переходу. Скориставшись прийнятою нами формалізацією, позначимо явище зміни форми міцелію по відношенню до попереднього росту при певних умовах культивування як "ціна переходу". Припустимо, що мікроміцети розвивалися у вигляді нитчастих форм, тобто в умовах S₁.

Потім обривки міцелію було інокульовано в умови S₂ , отже з них повинні розвиватися пелети. Вводимо величину Р_2,1?0 та назвемо її "ціною переходу" від нитчастої до пелетної стратегії росту. Зміст її полягає в тому, що при позначеному переході КР буде дорівнювати не К₂(S), а

K₂(S)exp[-P_2,1]. (1)

Витрати на "переключення" програм, що відображені в частках КР формулою (1), означають, що реально перехід здійсниться не при переході зовнішних умов через точку S^?, а при переході їх через точку S₊, що визначається рівнянням:

K₂(S₊) = K₂(S^?)exp [-P_2,1], S₊?S^?. (2)

Аналогічна картина спостерігається при зворотньому переході від пелет до нитчастого росту. Інтервал (S_-,S₊) визначається певним фізіологічним статусом міцеліальних клітин та при фіксованих внутрішніх станах не змінюється. Природньо назвати його інтервалом гістерезису при переході від однієї адаптивної форми до другої:

По обидва боки від точки перетину логарифму відношення коефіцієнтів розмноження двох різних АФ повинні мати різний знак. Ця ситуація називається структурно-стійкою.

Одержані дані дозволяють обгрунтувати явище гістерезису в переходах між адаптивними формами, що є одним з доказів прояву самоорганізації.

Встановлено, що програма формоутворюючих процесів сприймається клітиною в стадії набряку конідій, котра відповідає на кривій росту лаг-фазі. Це період компетентності в морфогенезі глибинного міцелію. Саме в цей час, за нашими даними, проявляється чітка часова залежність сприйняття конідіями гриба морфогенного сигналу. Як у випадку пелетної, так і нитчастої стратегії росту зміна умов культивування у період появи ростової трубки сприяє змішаному росту, що можна пояснити неодночасним проростанням конідій. Зміна умов культивування на більш піздніх етапах розвитку мікроміцетів впливала на морфологію міцелію тільки у межах кожної форми (пелетної чи нитчастої). міцеліальний грибний біохімічний енергетичний

Порівняння одержаних даних з літературними відомостями про дріжджово-гіфальний диморфізм дозволяє зробити висновок про загальні закономірності цих процесів та пояснити необхідність зупинки клітинного циклу для "включення" програм з морфогенезу з позицій теорії саморозвитку.

Вивчення ультраструктури та сил молекулярної взаємодії поверхні конідій T. terrestris методом атомно-силової мікроскопії показало, що зміна цих показників відбувається не тільки внаслідок їх набряку, але й залежно від спрямованості формоутворюючих процесів. На початку культивування поверхня конідій (у режимі картографування зміни фази коливань зонда) виглядає як зерниста структура (рис. 5). Поряд з хаотично розподіленими зернами (розміром близько 50 нм) фіксуються ланцюжки з окремих зерен довжиною 100 - 200 нм. Ця картина відрізняється від так званих "rodlet", білкових структур, які за даними літератури [Dufrene et al., 1999; Белозерская, 2001] визначають гідрофобність поверхні у більшості мікроміцетів. Їх відсутність на поверхні конідій T. terrestris співпадає з показниками її гідрофільності (61,1  7,2 %).

У процесі набряку конідій структура поверхні змінювалася. Поверхня конідій з нитчастою стратегією росту на протязі 8 - 10 годин культивування демонструвала лише зернисту структуру (30 - 80 нм) та відрізнялася від початкової більш рідким покриттям поверхні. Фібрилярні структури з'являлися на поверхні конідій, що не проросли лише через 18 годин. У випадку презумптивно пелетного росту на поверхні конідій відмічено фібрилярні структури шириною близько 10 нм та довжиною до 260 нм.

Поруч з ними спостерігалися зернисті утворення з латеральними розмірами 100 х 60 нм. При культивуванні на протязі 10 годин довжина фібрилярних структур збільшувалась до 1000 нм. Кількість зернистих утворень зменьшувалась (з 20 до 5 од/нм), але їх розміри збільшувалися до 300 - 400 нм.

У цей період спостерігається зниження адгезивних та в'язко-пружних властивостей конідій (рис. 8), більш виражене у нитчастому варіанті. Це може бути пов'язано з тим, що у процесі набряку поверхня конідій набуває більшої пластичності. Але на фоні загального зниження сил взаємодії в окремих ділянках поверхні сили адгезії можуть збільшуватися [Dufrene et al., 1999].

Одержані розрахункові дані підтвердили висновки, зроблені Геріном та співавторами [Gerin at al., 1993, 1999], про можливу участь полісахаридних містків в агрегації конідій та неспроможність припущень про провідну роль у пелетоутворенні електричних властивостей поверхні конідієспор.

Аналіз енергетичних кривих показав, що сили ван-дер-ваальсового тяжіння домінують над силами електростатичного відштовхування незалежно від значення електрокінетичного потенціалу поверхні конідій. Це означає, що на основі врахування тільки електростатичної взаємодії конідії грибів у поживному середовищі Чапека повинні завжди коагулювати. Значення -потенціалу конідій T. terrestris при рН 4,0 наближаються до ізоелектричної точки, однак саме в цих умовах ми спостерігаємо нитчастий міцелій.

У дійсності поряд з розвитком пелетного ми спостерігаємо розвиток нитчастого міцелію та утворення пелет з поодиноких конідій. Випадки відсутності агрегації спор при дотриманні відповідних умов за електростатичними характеристиками можуть бути пов'язані з наявністю певного прошарку біомолекул на поверхні конідій, наприклад полісахариду (так звана стерична складова). З її урахуванням характер взаємодії конідій суттєво змінюється. При цьому має значення як відстань між конідіями, так і об'єм сегменту макромолекул, котрі утворюють адсорбовані прошарки навколо клітини.

Наявність полісахариду при набряку конідій було підтверджено нами експериментально. Як видно з рис. 10, навколо взаємодіючих конідій спостерігається фаза з відмінними пружними характеристиками. При обробці зразків конканаваліном А, міченим колоїдним золотом, на електронограмі було виявлено оточуючі конідію контрастні частинки (рис. 11). Це може свідчити про наявність вуглеводів у складі яких: Д-глюкоза, Д-маноза та N-ацетіл-D-глюкозамін.

Рис. 10. АСМ-зображення взаємодіючих у лаг-фазі конідій T. terrestris у режимі регістрації висоти (ліворуч) та зміни фази коливань зонду (праворуч).

У межах низьких концентрацій полімеру домінує ефект флокуляції за містковим типом, тобто структурно-механічний тип взаємодії. Цей механізм може визначати взаємодію конідій при пелетоутворенні. При більш високих концентраціях полімеру спостерігається стерична стабілізація, що забезпечує розвиток окремих конідій, тобто нитчастого міцелію. Ми вважаємо, що вказаний механізм адгезії є специфічним. Біополімер синтезується самою клітиною за певних умов існування та у певні періоди розвитку. Тобто це дає змогу розглядати механізм пелетоутворення як прояв процесу адаптації.

Вивчаючи механізм рецепції та передачі в клітину морфогенного сигналу, ми дослідили участь у цьому процесі аналогів мембранотропних, універсальных для різних мікроорганізмів [Ель-Регістан, 1989], ауторегуляторів (4-н-гексилрезорцину та олеїнової кислоти). Показано, що вони впливають на синтез біомаси, діаметр та кількість пелет, але це відбувається в межах заданої фенотипової програми розвитку.

Участі лектинів у процесах формоутворення міцелію T. terrestris на стадії набряку конідій та їх проростання не виявлено. Гемаглютинуюча активність культуральної рідині і на поверхні клітин у випадку презумптивно нитчастого або пелетного міцелію не встановлена.

Аналізуючи стан конідій у лаг-фазі культивування, слід зазначити їх відмінності у характері електромагнітного випромінювання. З представлених на рис. 12 результатів виміру спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ) конідій видно, що у випадку презумптивно- нитчастого росту інтенсивність оптичного випромінювання вище (в середньому на 17 %) від пелетного.

Найбільш відчутна різниця у випроміненні відмічена при зміні температури та концентрації в середовищі глюкози. Природньо, що досліджувані параметри впливали на характер випромінювання, але, як видно з контрольних вимірів (при відсутності конідій у пробах), ця тенденція була зворотньою (рис. 13). Виключення складали виміри СХЛ під дією температури (з підвищенням температури інтенсивність випромінювання збільшується).

За сучасними уявами, низькоінтенсивна люмінесценція біологічних об'єктів є безпосереднім результатом релаксації електронно-збуджених станів окремих молекул, що були активовані при проходженні вільнорадикальних окисних реакцій. Причиною більш низького рівня СХЛ конідій з презумптивно пелетною формою в порівнянні з нитчастою може бути інгібування продуктів вільнорадикального окислення як захисної реакції на неоптимальні умови зовнішнього середовища [Веселова и др., 1993]. Якщо взяти до уваги, що процеси формоутворення можуть бути обумовлені колективними механохімічними факторами, а зараз цей науковий напрям активно розробляється [Белоусов, Миттенталь, 1992], то доцільно було дослідити механоемісію (МЕ) конідій при різних параметричних впливах середовища культивування.

Аналізуючи одержані дані, слід відмітити більш хаотичний характер випромінювання у конідій з пелетною стратегією, в порівнянні з нитчастою (рис. 14). Площа атрактора у передбачених пелет була на 25 % більше. Ця тенденція зберігалася через 20 годин після початку культивування, хоча не в такій мірі.

Беручи до уваги той факт, що інокулюм для одержання нитчастого та пелетного міцелію був однаковим за хімічним складом (конідіі при культивуванні гриба на твердому середовищі), відмінності у характеристиках випромінювання можна віднести до різної спрямованості метаболічних процесів у клітинах з різною морфологічною стратегією росту.

Для розуміння механізму дії зовнішних морфогенних факторів необхідно знати особливості метаболічних та молекулярних змін, специфічних для процесів формоутворення. Пошуки регулюючих молекул починаються з вивчення цАМФ, цГМФ та іонів кальцію як основних універсальних вторинних посередників, що відомі для цілого ряду процесів як у про-, так і в еукаріотичних клітинах.

Дослідження ендогенного пулу цАМФ та виявлений вплив екзогенного цАМФ на морфогенез T. terrestris показали ключову роль цАМФ у процесах формоутворення цього гриба в умовах глибинного культивування. Реалізація "нитчастої " стратегії розвитку відбувається при більш високому рівні цАМФ у період лаг-фази, ніж у випадку пелетного міцелію (рис. 15, 16). Регулювання його концентрації високим вмістом глюкози (більш ніж 3 %), теофіліном, екзогенним цАМФ та агентами, що деполяризують мембрану (FCCP, 2,4-динітрофенол, ністатин), дозволило здійснити спрямоване культивування тієї чи іншої форми. Зміна презумптивно пелетного на нитчастий ріст відбувалася лише при втручанні у лаг-фазі. При внесенні вказаних реагентів у лог-фазі розвитку міцелію його форма не змінювалася.

Показано, що внесення в середовище культивування хлористого кальцію в концентраціях 15 - 30 мМ впливає на морфогенез T. terrestris, переключаючи програму розвитку з “пелетної” на “нитчасту”. Специфічність морфогенної дії іонів кальцію підтвердилася в дослідах з веропамілом, а також часовою залежністю його впливу на форму міцелію.

Так само як рН, температура, цАМФ іони кальцію змінювали презумптивно пелетний ріст на нитчастий, діючи на конідії у стадії набряку. Аніонна частина теж впливала на морфогенну дію кальцію. Встановлено, що серед солей кальцію (оцетовокислого-, вуглекислого-, азотнокислого) тільки сірчанокислий у концентрації 10 - 50 мМ діяв аналогічно хлористому кальцію.

Результати досліджень, що проведені за участю одно- та двохвалентних катіонів підтвердили особливу роль кальцію в морфогенезі T. terrestris. Показано, що хлористий натрій, калій, амоній, магній та стронцій в концентраціі до 100 мМ впливають на морфологію міцелію в межах морфологічних варіантів. Прямий зв'язок ендогенного цГМФ з формоутворенням T. terrestris не встановлено.

Показано, що деполярізація цитоплазматичної мембрани, під впливом роз'єднувачів (FCCP, 2,4-ДНФ), мембраноактивного антибіотика (ністатину) та високих концентрацій калію в лаг-фазі призводить до зміни програми розвитку з перзумптивно пелетної на нитчасту (табл. 6). Це може свідчити про участь цитоплазматичної мембрани завдяки зміні ступеня її енергізації у сприйнятті та передачі морфогенного сигналу в T. terrestris.

Дослідження дії актиноміцину Д, РНКази, етіоніну та пуроміцину на процеси формоутворення T. terrestris продемонстрували зв'язок між морфогенезом міцелію та генним апаратом клітини. У випадку презумптивно нитчастого росту додавання інгібіторів призводило до зміни форми розвитку міцелію. Таким чином, регуляція формоутворення міцелію T. terrestris може здійснюватися на генному рівні.

Таблиця 6. Вплив концентрації KCl на форму міцелію T. terrestris при різних значеннях рН середовища

KCl, мМ	рН 4,0	рН 7,0
6,6 (контроль)		_
25		_
50		_
100		_ **
200		**
300		**
500
700
900
_ пелетний тип міцелію; ** міцелій типу “крупа”; нитчастий тип міцелію; _ ** ; ** змішаний тип росту.

Особливості функціонування різних форм міцелію
на прикладі Thielavia terrestris

Порівняльний аналіз кінетики та стехіометрії росту T. terrestris на твердому та в рідкому середовищі дозволив оцінити ці умови за ступенем сприятливості для розвитку гриба. Найбільш оптимальні для росту слід вважати умови культивування на твердому середовищі. У цих умовах штам характеризується високою спорідненостю зі субстратом (К_s = 0,026 г/л) та різким інгибуванням при збільшенні концентрації глюкози (К_і = 0,929 г/л).

В той самий час проведені дослідження показали, що пелетний ріст за фізіологічними показниками відповідає поведінці організму в умовах неспецифічного стресу. Збільшуються витрати енергії на підтримку культури (0,047  0,007 г/г·год. проти 0,024  0,007 г/г·год. для нитчастого), економічний коефіцієнт меньше (30,5  1,9 % проти 43,6  2,5 %), а метаболічний - більше, ніж у нитчастого міцелію (0,41  0,08 г^-1 проти 0,16  0,01 г^-1). Підвищується пул АТФ.

У пелетному міцелії спостерігається зниження білку, нуклеїнових кислот та збільшення резервних речовин (ліпідів, вуглеводів) (табл. 7). Нитчаста форма відзначається більшим рівнем конструктивних процесів, але меншою стійкістю до несприятливих факторів зовнішнього середовища (К_s = 0,19  0,01 г/л проти 0,09  0,01 г/л; K_i = 112,7  6,4 г/л проти 30,0  5,0 г/л).

Таблиця 7. Макромолекулярний склад міцеліальних структур T. terrestris на різних стадіях розвитку

Характеристика проби	Біополімер, % до АСБ
	Білок	Нуклеїнові кислоти	Вуглеводи	Ліпіди
Кінець лаг-фази	нитки	44,01,5	14,00,7	30,01,0	6,00,5
	пелети	45,01,8	14,004	29,00,5	5,00,5
Експоненціальна фаза	нитки	38,21,5	9,20,4	42,41,1	7,80,8
	пелети	31,21,7	7,40,2	49,60,9	9,80,9
Стаціонарна фаза	нитки	29,81,1	3,40,5	52,41,0	8,80,7
	пелети	19,71,3	3,30,5	65,80,9	9,20,4
Безперервне культивування ...

Подобные документы

• Молекулярні механізми кросинговеру

  Кросинговер як явище обміну ділянками гомологічних хромосом після кон’югації у профазі-1 мейозу. Аналіз проміжних структур в сумчастих грибів. Основні способи розділення структур Холлідея. Розгляд особливостей молекулярних механізмів кросинговеру.
  
  курсовая работа [1,8 M], добавлен 12.03.2013
  

• Характеристика бактерій Proteus mirabilis та їх вплив на організм людини

  Вивчення морфолого-культуральних та фізіолого-біохімічних ознак бактерії Proteus mirabilis; розгляд сфери поширення. Дослідження патогенності та практичного значення; спричинення захворювання сечостатевих органів: простатиту, циститу, пієлонефриту.
  
  курсовая работа [2,6 M], добавлен 26.04.2014
  

• Вплив антропогенного навантаження на функціонування глутатіонової системи у насінні представників роду Acer L

  Основні джерела антропогенного забруднення довкілля. Вплив важких металів на фізіолого-біохімічні процеси рослин, зміни в них за впливу полютантів. Структура та властивості, функції глутатіон-залежних ферментів в насінні представників роду Acer L.
  
  дипломная работа [950,6 K], добавлен 11.03.2015
  

• Морозостійкість родини Пасльонових

  Види пошкодження рослин при низьких температурах. Фізіолого-біохімічні особливості морозостійкості рослин. Процес загартування, його фази. Загальна характеристика родини Пасльонових, дія низьких температур на рослини. Метод дослідження морозостійкості.
  
  курсовая работа [72,0 K], добавлен 05.04.2014
  

• Структурно-функціональні особливості легень у людини на етапах онтогенезу

  Вивчення ембріогенезу легень та періодизації їх формування на основі даних макро-, мікро морфологічного і гістохімічного аналізів. Основні етапи розвитку легень у людини в постнатальному періоді, їх функціональні зміни. Легені на пізніх етапах онтогенезу.
  
  курсовая работа [56,0 K], добавлен 06.11.2010
  

• Цитокіни в центральній нервовій системі

  Механізми дії та функції цитокінів у нервовій системі, їх взаємодії на рівні головного мозку. Рецептори цитокінів в межах центральної нервової системи (ЦНС). Стимуляція гіпоталамо-гіпофізарно-адреналової системи як доказ прямого впливу цитокінів на ЦНС.
  
  реферат [5,7 M], добавлен 13.11.2013
  

• Механізми раннього ембріонального розвитку

  Будова і рівні регуляції репродуктивної системи ссавців. Доімплантаційний розвиток та роль стероїдних гормонів в імплантаційних процесах. Фізіологічні та молекулярні механізми імплантації. Роль білкових ростових факторів у становленні вагітності.
  
  реферат [48,8 K], добавлен 09.02.2011
  

• Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації

  Потенціал дії клітин. Особливості фази швидкої деполяризації, реполяризации, слідових потенціалів. Дослідження впливу входу натрію на внутрішньоклітинну концентрацію. Безперервне та сальтаторне розповсюдження нервового імпульсу. Фіксація потенціалу.
  
  реферат [452,1 K], добавлен 19.06.2010
  

• Мінливість як властивість життя і генетичне явище

  Загальнобіологічна здатність організмів у процесі онтогенезу набувати нових ознак. Роль генетичних і середовищних факторів у проявах спадкової і неспадкової (фенотипової) мінливості. Епігенетика, модифікації, фенокопії, морфози; класифікація мутацій.
  
  презентация [2,1 M], добавлен 04.01.2015
  

• Структура теоретичних знань

  Характеристика абстрактних об'єктів теорії і їхньої системної організації. Дослідження особливостей основного емпіричного матеріалу, на який опирається методологія при аналізі структури теоретичного знання - текстів історично сформованих наукових теорій.
  
  реферат [25,0 K], добавлен 27.06.2010
  

• Біохімічне дослідження процесу стомлення у підлітків

  Біологічне значення стомлення, методи його дослідження. Вивчення біохімічних основ стомлення у підлітків та його діагностування доступними засобами. Виявлення зміни в активності слини учнів внаслідок стомлення під час фізичних та розумових навантажень.
  
  курсовая работа [116,8 K], добавлен 21.01.2017
  

• Життєві форми організмів

  Життєва форма як пристосованість організмів до певного способу життя, загальна характеристика впливу екологічних факторів на їх основні види. Аналіз поглядів різних вчених-ботаніків (у тому числі і Серебрякова) на класифікацію життєвих форм організмів.
  
  курсовая работа [591,5 K], добавлен 21.09.2010
  

• Вплив міського урбанізованого середовища на ріст, розвиток та фізіолого-біохімічний стан газонних трав

  Класифікація газонів. Джерела забруднення та забруднюючі речовини міського середовища. Газонні трави в озелененні промислових територій. Правила утримання зелених насаджень сучасних міст. Функціонування систем життєдіяльності газонних видів рослин.
  
  курсовая работа [154,1 K], добавлен 28.03.2015
  

• Анатомо-морфологічна будова хвойних рослин України

  Історія еволюційного розвитку та систематика Голонасінних. Особливості анатомічної будови хвойних рослин України. Морфологічна будова представників хвойних. Дослідження впливу різних екологічних факторів на анатомічну та морфологічну будову хвойних.
  
  курсовая работа [11,5 M], добавлен 04.06.2014
  

• Метаболічні особливості фізіології та біохімії водоростей

  Розгляд особливостей фізіології та властивостей зелених та синьо-зелених водоростей. Визначення їх ролі в балансі живої речовини та кисню, в очищенні оточуючого середовища і еволюції Землі. Опис участі водоростей в біохімічних процесах фотосинтезу.
  
  курсовая работа [56,1 K], добавлен 21.09.2010
  

• Поняття системи як наукового терміну

  Поняття системного дослідження предметів і явищ навколишнього нас миру як частини або елементи певного цілісного утворення. Система як безліч об'єктів разом з відносинами між об'єктами й між їхніми атрибутами. Специфіка системного методу дослідження.
  
  реферат [26,6 K], добавлен 21.06.2010
  

• Історія розвитку зоології в ХІХ-ХХ в

  Аналіз розвитку зоології в першій половині 19 століття. Розвиток зоології в 20 столітті. Характеристика періоду розвитку теорії Дарвіна та значення її для зоології. Розвиток порівняльної анатомії та ембріології. Дослідження в ембріології та фізіології.
  
  курсовая работа [45,1 K], добавлен 21.09.2010
  

• Людина як система з позиції валеологічної науки

  Позиція валеології – людина як система. Три рівні побудови цієї системи. Біологічне поле людини. Індійська та китайська системи. Механізми валеогенезу - автоматичні механізми самоорганізації людини задля формування, збереження та закріплення здоров’я.
  
  контрольная работа [20,9 K], добавлен 09.01.2009
  

• Інфекційні хвороби рослин

  Характеристика шкідників і збудників захворювань рослин та їх біології. Дослідження основних факторів патогенності та стійкості. Аналіз взаємозв’язку організмів у біоценозі. Природна регуляція чисельності шкідливих організмів. Вивчення хвороб рослин.
  
  реферат [19,4 K], добавлен 25.10.2013
  

• Геоботанічне районування України

  Вплив внутрішніх та зовнішніх факторів на характер геоботанічного районування, конфігурація і структура ареалу. Фізико-географічне районування України. Біоценотична класифікація, картографування та районування за аналогічними та гомологічними ознаками.
  
  курсовая работа [44,6 K], добавлен 21.09.2010
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам