Мінливість геному пшениці Triticum aestivum при віддаленій гібридизації її з Aegilops cylindrica

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології та генетики

УДК 577.21:575.222.73:632:57.082.13

Мінливість геному пшениці Triticum aestivum при віддаленій гібридизації її з Aegilops cylindrica

03.00.22 - молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Галаєв Олексій Володимирович

Київ 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН та МОН України (м. Одеса).

Науковий доктор біологічних наук, професор, академік УААН

керівник Сиволап Юрій Михайлович,

Південний біотехнологічний центр у рослинництві, директор.

Офіційні доктор біологічних наук, професор

опоненти Терновська Тамара Костянтинівна,

Національний університет “Києво-Могилянська академія”,

завідувач кафедри біології;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Спірідонова Катерина Василівна,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу генетики клітинних

популяцій.

Провідна Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, установа м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “ 20 ” _ жовтня _2006 р. о 10.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ 18 ” _вересня_ 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О. В. Підпала

мінливість геном гібридизація пшениця

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. М'яка пшениця Triticum aestivum L. (AABBDD; 2n = 42) є однією з основних продовольчих культур та об'єктом інтенсивних генетичних досліджень. У зв'язку з тривалою селекцією і розповсюдженням обмеженої кількості високопродуктивних генотипів, культивовані сорти характеризуються відносно низьким генетичним різноманіттям та втратою важливих генів стійкості до стресів. Для поповнення генного пулу втраченими генами широко використовується віддалена гібридизація з дикими злаками-донорами агрономічно важливих генів. Інтрогресія агрономічно цінних ознак від Aegilops cylindrica Host (CCDD; 2n = 28) у геном м'якої пшениці успішно практикується для поліпшення даної культури. Ефективному використанню в селекційних програмах форм пшениці, що отримані від віддаленої гібридизації, суттєво перешкоджає недостатність знань особливостей мінливості геному в процесі формування генотипів пшениці віддаленого гібридного походження та відсутність ДНК-маркерів до генів стійкості, які перенесені від диких злаків.

У зв'язку з цим теоретичний та практичний інтерес становить молекулярно-генетичний аналіз особливостей організації рекомбінантних генотипів, тестування інтрогресивних фрагментів і маркування генів стійкості в генетичному матеріалі гібридного походження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної генетики Південного біотехнологічного центру у рослинництві (ПБЦ) УААН та МОН України в межах програми (НТП) УААН “Сільськогосподарська біотехнологія 2001-2005 рр.” (№ держ. реєстрації: 318/92 від 24.10.01), підпрограми 1 “Новітні біотехнології в рослинництві” (№ держ. реєстрації в УкрІНТЕІ: 0104U003557) за напрямом 03 “Використання молекулярно-біологічних методів в генетико-селекційній роботі”, завдання 3.1.2.5. “Підвищення ефективності селекції високоінтенсивних сортів пшениці за допомогою ДНК-технології” (№ держ. реєстрації в УкрІНТЕІ: 0104U003559).

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи - охарактеризувати мінливість геному пшениці, яка спричинена віддаленою гібридизацією з Ae. cylindrica.

Для досягнення поставленої мети вирішували такі завдання:

1. Пошук молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів батьківських форм інтрогресивних ліній - сорту м'якої пшениці Одеська напівкарликова та Ae. cylindrica.

2. Генотипічний аналіз інтрогресивних ліній м'якої пшениці.

3. Порівняльний молекулярно-генетичний аналіз інтрогресивних ліній.

4. Вивчення стабільності виявлених інтрогресій у гібридних форм на різних етапах бекросування та самозапилення.

5. ДНК-маркування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Aegilops cylindrica в геном м'якої пшениці.

Об'єкт дослідження: інтрогресія генетичного матеріалу геному з Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці, ДНК-маркування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного в геном м'якої пшениці від Ae. cylindrica.

Предмет дослідження: геном інтрогресивних ліній м'якої пшениці T. aestivum/Ae. cylindrica.

Методи дослідження: ПЛР-аналіз (SSR, ISSR, RAPD), гібридологічний аналіз, цитологічний аналіз (підрахунок кількості хромосом у метафазі мітозу в корінцях паростків), методи біологічної статистики, біометричні методи маркування та картування (із використанням картувальної функції Козамбі та Холдейна).

Наукова новизна одержаних результатів. Проведено детекцію чужорідного генетичного матеріалу в геномі м'якої пшениці та виявлено генетичну гетерогенність генотипів гібридного походження від гібридизації м'якої пшениці з Ae. cylindrica. Показано ефективність використання SSR-маркерів м'якої пшениці для детекції фрагментів геному Ae. cylindrica в геномі форм віддаленого гібридного походження. Із використанням мікросателітних маркерів вперше виявлено особливості мінливості геному пшениці, що відбулися внаслідок гібридизації з Ae. cylindrica.

Проведено аналіз стабільності виявлених змін геному пшениці у форм гібридного походження на різних етапах бекросування та самозапилення. Виявлено мікросателітні маркери до стабільних інтрогресивних фрагментів геному Ae. cylindrica в геномі м'якої пшениці. Показано ефективність використання виявлених маркерів до стабільних інтрогресивних фрагментів для генотипування популяції, що розщеплюється, з метою виявлення продуктів інтрогресії, які несуть ген (гени) стійкості до фітопатогенів, перенесених від егілопсу до пшениці. Виконано маркування та картування на молекулярно-генетичній карті м'якої пшениці гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica до інтеркалярної ділянки довгого плеча хромосоми 1В пшениці дистальніше маркера Xgwm 259.

Практичне значення одержаних результатів полягає в отриманні маркерів до стабільних інтрогресивних фрагментів геному Ae. cylindrica, які можна використовувати для маркування генів стійкості до фітопатогенів, що перенесені від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці, а також для відновлювання генотипу рекурентного батька. SSR-маркер Xgwm 259 можна використовувати як тестерний маркер гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica до геному м'якої пшениці.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційну роботу було виконано під керівництвом д.б.н., професора, академіка УААН Ю.М. Сиволапа. Здобувачем особисто проаналізовано літературні дані за темою дисертаційної роботи, виділена ДНК та генотиповані батьківські форми, інтрогресивні лінії та 170 рослин популяції (378/2000 x Лютесценс 23397) F₂-F₃, що розщеплюється. Детектовано молекулярно-генетичний поліморфізм батьківських форм сорту м'якої пшениці Одеська напівкарликова та Ae. cylindrica. Проведено генотипний аналіз інтрогресивних ліній м'якої пшениці 5/20-91 BC₁F₉ та 5/55-91 BC₁F₉, в походженні яких брав участь вид Ae. cylindrica. Визначено особливості мінливості геному пшениці, що відбулися в наслідок гібридизації з Ae. cylindrica. Вивчено стабільність виявлених змін геному пшениці у гібридних форм на різних етапах бекросування та самозапилення. Виконано молекулярне маркування та картування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці. Фенотипічне виявлення стійкості до твердої сажки популяцій F₂ та F₃ (378/2000 x Лютесценс 23397), що розщеплюються, визначали самостійно в польовому інфекційному розсаднику Селекційно-генетичного інституту (СГІ).

Здобувач висловлює подяку за допомогу в плануванні селекційних дослідів к.б.н., п.н.с. відділу ентомології та фітопатології Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН (м. Одеса) Л.Т. Бабаянцу, за проведення цитологічних аналізів н.с. лабораторії культури тканин ПБЦ О.Л. Шестопал, за надання праймерів до мікросателітних локусів м'якої пшениці к.б.н., с.н.с. відділу молекулярної генетики ПБЦ С.В. Чеботар.

Обговорення, аналіз, а також підготовку публікацій до друку проводили разом із д.б.н., професором, академіком УААН Ю.М. Сиволапом, к.б.н., с.н.с. Л.Т. Бабаянцем, к.б.н. О.І. Рибалком, яким автор висловлює щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були презентовані на Всеукраїнській конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (Київ, 2002); на 2-й Міжнародній конференції молодих вчених “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (Харків, 2003); на 4-й Міжнародній конференції “Геном растений” (Одеса, 2003); на Міжнародній конференції “Biotech approaches to Engineering plant growth” (Ялта, 2004); на Міжнародній науковій конференції “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (Мінськ, Білорусь, 2004); на Міжнародній науково-практичній конференції “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (Оброшино, 2005); на Міжнародній науковій конференції “Современные проблемы генетики” (Мінськ, Білорусь, 2005).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у чотирьох статтях і тезах восьми доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, експериментальної частини, яка має 2 розділи, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, який налічує 205 найменувань. Матеріал дисертації викладено на 128 сторінках машинописного тексту, містить 12 таблиць і 24 рисунки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. У роботі було використано такий рослинний матеріал: 1) сорти м'якої пшениці (Triticum aestivum L., AABBDD, 2n = 42): Одеська напівкарликова, Ніконія і лінія Лютесценс 23397, що не мають ефективних генів стійкості до фітопатогенів, люб'язно передані Л.Т. Бабаянцем; 2) зразки місцевої популяції виду Ae. cylindrica Host (CCDD; 2n = 28), люб'язно надані О.І. Рибалком; 3) гексаплоїдні інтрогресивні лінії м'якої пшениці 5/20-91¹ та 5/55-91¹ з генетичним матеріалом Ae. cylindrica, створені Л.Т. Бабаянцем, такого походження: ¹[(Одеська напівкарликова x Ae. cylindrica) x Одеська напівкарликова]F₉ (2n = 42); 4) гексаплоїдні інтрогресивні лінії м'якої пшениці 237/2000² та 378/2000³, створені Л.Т. Бабаянцем, такого походження: ²(5/20-91¹ x Одеська напівкарликова)F₅ (2n = 42), ³(5/55-91¹ x Одеська напівкарликова)F₅ (2n = 42); 5) гібриди F₂ та F₃ одержано в процесі виконання дисертаційної роботи від схрещування лінії 378/2000³ з лінією м'якої пшениці Лютесценс 23397; 6) різновиди виду Ae. tauschii (DD, 2n = 14) (включаючи представників підвиду ssp. strangulata та ssp. eusquarrosa), які передані О.І. Рибалком; 7) зразки виду Ae. caudata (CC, 2n = 14), які передані О.І. Рибалком; 8) 24 сорти м'якої пшениці СГІ і три сорти - селекції Миронівського інституту пшениці ім. В.І. Ремесла УААН; 9) гібриди F₂ одержано в процесі виконання дисертаційної роботи від схрещування лінії 378/2000³ з сортом м'якої пшениці Ніконія.

Інтрогресивні лінії 5/20-91 та 5/55-91 характеризуются комплексною стійкістю до низки грибних захворювань, переданою від егілопсу. Розрізняються вказані лінії між собою ступенем стійкості та кількістю генів, які контролюють стійкість до того чи іншого фітопатогену.

Молекулярно-генетичне маркування та картування гена стійкості до твердої сажки здійснювали на основі аналізу популяції F₂, що одержана від схрещування лінії 378/2000 (стійка) з лінією м'якої пшениці Лютесценс 23397 (чутлива). Стійкість популяцій F₂ та F₃ (378/2000 x Лютесценс 23397), що розщеплюється, і F₂ (378/2000 x Ніконія) до твердої сажки оцінювали за дев'ятибальною шкалою РЕВ в польовому інфекційному розсаднику СГІ. Цитологічний аналіз метафазних пластинок мітозу здійснювали за загальноприйнятою методикою на тимчасових ацетокармінових давлених препаратах клітин меристеми кореня (Паушева, 1988). Мікрофотографії одержували за допомогою фотонасадки на мікроскопі Axiophot фірми Opton.

Виділення ДНК. ДНК виділяли з етиольованих паростків. Паростки розтирали в епендорфі з 0,5 мл лізуючого буфера (1,4 M NaCl; 20 mM Na₃EDTA; 100 mM трис-HCl pH 8,0 (25⁰C), 2 % CTAB). Інкубували на водяній бані протягом 1 год при 60⁰С. Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформу та ізопентанолу (24:1). Центрифугували протягом 4 хв у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000 об/хв, водяну фазу (не зачіпаючи інтерфази) переносили у новий епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом 5 хв при 12000 об/хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали двічі 0,3 мл та додатково 0,2 мл 70 % етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 300 мкл розчину ТЕ (10мM трис-HCl, pH 8,0; 1 мM Na₃EДTA) з РНК-азою (1 мкг/мл ). Інкубували при 37⁰С 2 год.

Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі ТКО Hoefer-100 у розчині 1 х TNE (10 мM трис-HCl, pH 7,4 (25С); 100 мM NaCl; 1 мM Na₃ЕДTA) з 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258 та 4 мкл зразка ДНК.

Умови ампліфікації ДНК. Реакційна суміш ПЛР об'ємом 20 мкл (RAPD, ISSR) та 25 мкл (SSR) містила: 50 мМ KCl, 20 мМ трис-HCl (рН 8,4 при 25⁰С); 2-3-4 мМ MgCl₂ (залежно від типу праймерів); 0,01% Tween-20; 0,15 мМ кожного dNTP; 0,2 мкМ праймера; 10-20 нг ДНК; 0,8-1 од. Tag-полімерази. Для ампліфікації використовували прилад “Терцик” (“ДНК-технология”, Росія). Температурні режими для ампліфікації продуктів RAPD- та ISSR-локусів різняться етапом гібридизації: початкова денатурація - 94⁰С 2 хв, далі 30 с, гібридизація - 47-52⁰С (залежно від кількості нуклеотидів у послідовностях RAPD-праймерів), - 53-58⁰С (ISSR) 30 с, елонгація - 72⁰С 1 хв, повторення цих етапів 35 разів, остання елонгація - 5 хв. Умови ПЛР для SSR-праймерів: початкова денатурація - 94⁰С 2 хв, далі 30 с, гібридизація - 50-55-60⁰С (залежно від праймерів) 30 с, елонгація - 72⁰С 1 хв, повторення цих етапів 35 разів, остання елонгація - 5 хв.

Фракціонування та візуалізація продуктів ампліфікації ДНК. Продукти ампліфікації фракціонували електрофорезом у агарозних та поліакриламідних гелях. Електрофорез проводили в 2 % агарозному гелі в 1 x TBE буфері. Умови електрофорезу: 2-2,5 годин при 2 В/cм. Фрагменти ДНК в гелі забарвлювали бромистим етидієм. Фотографували гелі у УФ-промені крізь червоний світлофільтр на плівку “Мікрат-300” чи “127-ТАСМА-2-81-Б”. Для кращого розподілу RAPD-, ISSR-локусів та SSR-алелів між собою застосовували поліакриламідні гелі (ПАА гелі). Склад ПАА гелів для розподілу RAPD- та ISSR-локусів - 8 % акриламід, 1 x TBE, для розподілу SSR-алелей - 10 % акриламід, 1 x TBE, 8 М сечовина. Для нанесення зразків використовували буфер: 0,25 % бромфеноловий синій; 0,25 % ксилолціанол. Електрофорез проводили на обладнанні Hoefer SE600, при напрузі 2 В/см при 55⁰С. Забарвлення продуктів ампліфікації у ПАА гелях проводили 0,012 М AgNO₃. Документували отримані електрофореграми за допомогою відеосистеми VDS (Pharmacia Biotech). Для визначення розміру фрагмента ампліфікації ДНК (в п.н.) використовували маркери молекулярної маси - pGEM (фрагменти маркера у п.н.: 2645, 1605, 1198, 676, 517, 480, 396, 350, 222, 179, 126, 75, 65, 51, 36), л/Pst 1 (11497, 5077, 4749, 4507, 2838, 2560, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15), pUC18 (19)/MspI (501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 110, 67, 34, 26) и pBR322/MspI (621, 520, 404, 309, 242, 217, 201, 180, 160, 147, 123, 110, 90, 76, 67), за допомогою комп'ютерної програми “Image Master 1D Elite”. Фотографії з агарозних та ПАА гелів робили класичним методом.

Визначення зчеплення та картування маркерних локусів. Для ідентифікації маркерів, що зчепленні з геном стійкості, використовували bulked segregant analysis (BSA). Вивчення зчеплення та рекомбінаційний аналіз між геном стійкості до твердої сажки і молекулярними маркерами виконано за допомогою комп'ютерної програми “МАРМАКЕR” ver. 3.0. Для встановлення зчеплення ДНК маркера з генетичним локусом використовували двоточковий аналіз. Для перерахування значення частоти рекомбінації у відстані на генетичній карті (сМ, сантиморганід) використовували картувальну функцію Козамбі. Молекулярне картування маркерних локусів здійснювали з використанням комп'ютерної програми “JOINMAP” ver. 2.0 з картувальною функцією Козамбі та Холдейна. Для встановлення групи зчеплення ДНК маркерів з геном стійкості до твердої сажки застосовували багатоточковий аналіз. Відповідність емпіричних співвідношень фенотипічних класів теоретичним визначали за допомогою методу ч². Для оцінки генетичної мінливості використовували стандартні методи та показники: поліморфність локусів, частота алелів.

Результати дослідження та їхнє обговорення.

Молекулярно-генетичний поліморфізм генотипів батьківських форм визначений з використанням ISSR-аналізу. Попереднім етапом детекції чужорідного генетичного матеріалу у геномі інтрогресивних ліній пшениці є пошук фрагментів геному за якими різняться батьківські форми. Для виявлення молекулярно-генетичного поліморфізму між сортом м'якої пшениці Одеська напівкарликова та зразками виду Ae. cylindrica використано 7 ISSR-праймерів. Всі ISSR-праймери детектували поліморфізм між батьківськими формами - сортом Одеська напівкарликова та Ae. cylindrica. При цьому поліморфними серед них були: за праймером isr 5 - 14 локусів, isr 7 - 13 локусів, isr 9 - 13 локусів, isr 12 - 6 локусів, isr 17 - 13 локусів, isr 21 - 14 локусів, isr 23 - 10 локусів.

На цьому етапі роботи за допомогою ISSR-аналізу вдалось виявити 83 потенційних маркерних локуси, які можуть детектувати інтрогресивні фрагменти в рекомбінантних геномах.

Молекулярно-генетичний поліморфізм генотипів батьківських форм визначений з використанням SSR-аналізу. Детальну інформацію про протяжність інтрогресивного фрагмента та його локалізацію в певній гомологічній групі хромосом, можливо отримати за допомогою мікросателітних (МС) чи SSR маркерів. МС та межуючі з ними ділянки ДНК диких і культурних родичів пшениці мають високу гомологію з аналогічними послідовностями геному T. aestivum (Pestsova et al., 2000; Sourdille et al., 2001; Бильданова и др., 2003), тому для дослідження брали мікросателітні маркери з відомою локалізацією на хромосомах м'якої пшениці (Rцder et al., 1998). Для детекції інтрогресії використали МС маркери, що локалізовані не тільки у геномі D гомеологічному геному D Ae. cylindrica, але і у А та В геномі пшениці, бо відомо, що геном С Ae. cylindrica подібно геному С Ae. caudata (Сечняк, Симоненко, 1999) здатний частково пригнічувати систему диплоїдизації пшениці, яка контролюється Ph-генами, а в умовах часткової супресії Ph-генів хромосоми геному D Ae. cylindrica можуть кон'югувати з хромосомами геному А та В пшениці, хромосоми геному С Ae. cylindrica - з хромосомами пшениці геному А (Авсенин и др., 2003).

Для пошуку молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів батьківських форм сорту Одеська напівкарликова та виду Ae. cylindrica використано 98 пар SSR-праймерів до 119 МС локусів пшениці. Вісім пар праймерів до 12 МС локусів не дозволили отримати виразних продуктів ампліфікації. Використання 21 пари праймерів до 23 МС локусів показало однаковий алельний стан у досліджених батьківських форм. Для 84 локусів виявили поліморфні продукти ампліфікації, з них по 39 МС локусах пшениці відсутні фрагменти ампліфікації у Ae. cylindrica. В процесі дослідження виявили, що 63,5 % МС локусів присутні у геномі Ae. cylindrica, при цьому 42,0 % МС локусів дозволили виявити поліморфізм між пшеницею та Ae. cylindrica, з них 4,7 % картовані у геномі А, 16,8 % - у геномі В та 20,5 % - у геномі D пшениці (рис. 1).

Найбільший процент мономорфності та ампліфікованості алелів МС локусів між батьківськими формами, які локалізовані у геному D пшениці, свідчить про високу гомологію геному D пшениці та егілопсу і низький рівень гетерогенності D геному злаків. Цікаво, що деякі МС локуси, які локалізовані на хромосомах А та В пшениці, присутні також у геномі Ae. cylindrica. Даний факт свідчить про гомеологію МС локусів геномів А та В пшениці з геномами С та D Ae. cylindrica.

За допомогою SSR-аналізу батьківських форм вдалось виявити локуси, які можуть бути використані як маркери для детекції мінливості геному пшениці в результаті гібридизації з Ae. cylindrica.

Виявлені поліморфні ISSR- та SSR-локуси є основою для подальшого дослідження спрямованого на детекцію чужорідного генетичного матеріалу у гібридному геномі.

Аналіз кількості хромосом у інтрогресивних ліній 5/20-91, 5/55-91 (BC₁F₉) та 237/2000, 378/2000 (BC₂F₅). З літературних джерел відомо, що формам пшениці, які отримані від віддаленої гібридизації, притаманна цитологічна нестабільність. Тому необхідно визначити рівень цитологічної нестабільності використаних у наших дослідженнях інтрогресивних ліній, бо у випадку їхньої нестабільності при розщепленні у поколіннях можливі відхилення у співвідношенні фенотипових класів, що ускладнить пошук ДНК-маркерів зчеплених з чужорідним геном.

Для встановлення кількості хромосом у меристемних клітинах первинних корінців паростків від кожної батьківської форми та інтрогресивної лінії брали по 10 зерен. Проведений цитологічний аналіз не виявив порушень у кількості хромосом у інтрогресивних ліній. Уся вивчена вибірка інтрогресивних ліній складалася з 42-хромосомних рослин.

ISSR-аналіз інтрогресивних ліній 5/20-91 та 5/55-91. За допомогою семи ISSR-праймерів, які виявили поліморфізм між батьківськими формами, досліджували інтрогресивні лінії 5/20-91 та 5/55-91, що добрані у BC₁F₉. В індивідуальних рослинах лінії 5/20-91 виявлено 17 інтрогресивних локусів, що належать Ae. cylindrica. В генотипах індивідуальних рослин лінії 5/55-91 детектовано шість інтрогресивних ISSR-локусів. Всього в генотипах 30 рослин BC₁F₉ двох інтрогресивних ліній детектовано 19 ISSR-локусів, що характерні для Ae. cylindrica.

Високій рівень гетерогенності за інтрогресивними локусами свідчить про збереження значної варіабельності геномної ДНК у гібридних рослинах, що добрані у BC₁F₉.

У спектрі продуктів ампліфікації індивідуальних рослин ліній 5/20-91 та 5/55-91 виявлено сім ISSR-локусів, які не характерні для батьківських форм. При порівнянні вивчених ліній виявлено специфічні та спільні для них інтрогресивні ISSR-локуси геному Ae. cylindrica.

Генотипування інтрогресивних ліній методом ISSR-аналізу підтвердило наявність генетичного матеріалу геному Ae. cylindrica в геномі вивчених інтрогресивних ліній та дозволило виявити такі зміни геному пшениці у гібридних рослинах: 1) відсутність фрагмента ампліфікації, що характерний для сорту Одеська напівкарликова, і наявність фрагмента, що характерний для Ae. cylindrica (інтрогресія фрагмента геному егілопсу в геном пшениці); 2) поява нових фрагментів ампліфікації, що відсутні в обох батьків.

SSR-аналіз інтрогресивних ліній 5/20-91 та 5/55-91. Відсутність продуктів ампліфікації МС локусу пшениці, наявність алелів МС локусу, що характерний для Ae. cylindrica, появу нових алелів, які відсутні в батьківських формах, оцінювали як зміни геному пшениці у форм гібридного походження.

Генотипування інтрогресивних ліній 5/20-91 та 5/55-91 методом SSR-аналізу дозволило виявити такі зміни геному пшениці у гібридних рослин: 1) відсутність фрагмента ампліфікації МС локусу, що характерний для сорту Одеська напівкарликова, і наявність фрагмента, що характерний для Ae. cylindrica; 2) поява нових фрагментів ампліфікації МС локусу, що відсутні в досліджених рослинах батьківських форм; 3) повна відсутність фрагментів ампліфікації МС локусу (даний тип зміни можна пояснити делецією МС локусу пшениці у гібридних рослин, мутацією сайту праймування, внаслідок чого неможлива ампліфікація фрагмента ДНК, чи транслокацією фрагмента геному егілопсу, який не містить МС локус у пшениці). SSR-аналіз показав відсутність заміщень будь-якої хромосоми м'якої пшениці гомеологічною хромосомою егілопсу.

Найбільш частий тип зміни, що спостерігається у гібридних рослин, - інтрогресія фрагмента геному егілопсу. Делеція МС локусу пшениці спостерігається рідше. Наявність в інтрогресивних лініях нових алелів, які відсутні в батьківських формах, свідчить: 1) про високий рівень поліморфізму вихідних батьківських форм; 2) про реорганізацію батьківських геномів у гібридних рослин, що відбулася в результаті віддаленої гібридизації, чи 3) про перезапилення досліджених інтрогресивних ліній іншими сортами м'якої пшениці.

В генотипах лінії 5/20-91 детектовано дев'ять інтрогресивних фрагментів (рис. 2 I), при цьому один фрагмент локалізували на хромосомах пшениці геному А, три - геному В та п'ять - геному D. МС аналіз семи локусів пшениці дозволив виявити фрагменти, які не характерні для батьківських форм.

В генотипах лінії 5/55-91 ідентифіковано дев'ять інтрогресивних фрагментів (рис. 2 II), з них два фрагменти локалізували на хромосомах пшениці геному А, чотири - геному В та три - геному D. МС аналіз семи локусів пшениці генотипів лінії 5/55-91 дозволив виявити фрагменти, які не характерні для батьківських форм. При порівнянні вивчених ліній виявлено специфічні та спільні для них інтрогресивні фрагменти геному Ae. cylindrica.

Таким чином, використання МС маркерів м'якої пшениці дозволило детектувати чужорідний генетичний матеріал у геномі інтрогресивних ліній і виявити генетичну гетерогенність генотипів, що отримані на основі гібридизації м'якої пшениці та Ae. cylindrica.

SSR-аналіз інтрогресивних ліній 237/2000 та 378/2000. МС маркери, які виявили зміни в інтрогресивних лініях BC₁F₉, було використано для дослідження бекросних нащадків лінії 5/20-91 - лінія 237/2000 та 5/55-91 - лінія 378/2000, що виділені у п'ятому поколінні самозапилення бекросної рослини BC₂ (2n = 42). МС аналіз ліній 237/2000 та 378/2000 дозволив виявити такі зміни гібридного геному: 1) збереження інтрогресивних фрагментів геному егілопсу; 2) елімінацію виявлених інтрогресивних фрагментів; 3) зменшення розміру інтрогресивного фрагмента при повторному бекросуванні; 4) збереження нових фрагментів, що відсутні в досліджених рослинах батьківських форм; 5) елімінацію виявлених нових фрагментів у гібридних рослинах.

Дослідження бекросних нащадків пшенично-егілопсних гібридів дозволило виявити зменшення кількості інтрогресивних фрагментів у рослин більш глибоких бекросів, що свідчить про поступову елімінацію чужорідного генетичного матеріалу Ae. cylindrica у пшенично-егілопсних гібридів при кожному наступному зворотному схрещуванні з м'якою пшеницею.

У зв'язку з тим, що бекросні рослини BC₁ та BC₂ у подальших самозапиленнях супроводжувались добором на стійкість до фітопатогенів, слід чекати зміни спектра інтрогресивних фрагментів геному егілопсу в пшеничному геномі: стабільність у поколінні BC₂ одних інтрогресій, які зв'язані з переданою комплексною стійкосттю, та елімінація інших - незв'язаних з переданою стійкістю. Так, в рослинах ліній 237/2000 та 378/2000 за допомогою дев'яти МС локусів виявлено стабільну інтрогресію. З них чотири присутні в обох лініях (Xgwm 18 - 1BS, Xgwm 33 - 1DS, Xgwm 389 - 3BS, Xgwm 182 - 5DL), дві - тільки у лінії 237/2000 (Xgwm 174 - 5DL, Xgwm 261 - 2DS) та три - у лінії 378/2000 (Taglut - 1AS, Xgwm 259 - 1BL, Xgwm 314 - 3DL). Дані МС маркери можуть бути використані для генотипування популяцій, що розщеплюються, з метою виявлення продуктів інтрогресії зчеплених з геном (генами) стійкості до фітопатогенів, що перенесені від егілопсу до пшениці.

Таким чином, використання МС маркерів пшениці дозволило охарактеризувати мінливість, що викликана інтрогресією чужорідного генетичного матеріалу Ae. cylindrica у геном T. aestivum. Показано стабільність виявлених інтрогресій у гібридних форм на різних етапах бекросування та локалізацію інтрогресивних фрагментів у геномі м'якої пшениці, що дозволить використовувати вивчені лінії у генетичному аналізі.

Детекція інтрогресії ділянок геномів C та D Ae. cylindrica у геноми А, В і D м'якої пшениці за допомогою мікросателітів. Інтрогресивні лінії пшеничного типу, що отримані від схрещування T. aestivum з Ae. cylindrica, є зручним модельним об'єктом в генетичних та молекулярно-генетичних дослідженнях, а також для оцінки передачі окремих послідовностей ДНК з генофонду диких видів у геном м'якої пшениці.

Вивчення питання геномної приналежності інтрогресивних МС послідовностей геному С чи D Ae. cylindrica, які виявлені в геномах A, B та D м'якої пшениці, проводили шляхом порівняльного МС аналізу T. aestivum (сорт Одеська напівкарликова) (геномний склад AABBDD), Ae. cylindrica (CCDD) та його вірогідних предків Ae. caudata (CC) і Ae. tauschii (DD) за допомогою семи пар праймерів, що детектували інтрогресивні фрагменти у ліній 378/2000 та 237/2000. З літературних джерел відомо, що вид Ae. tauschii складається з великої кількості різновидів (Knaggs et al., 2000), які характеризуються високою генетичною гетерогенністю (Dvorak et al., 1998; Песцова и др., 2000). В нашому дослідженні використовували чотири різновиди даного диплоїдного виду, включаючи підвид ssp. eusquarrosa та ssp. strangulata, який за даними деяких авторів (Konarev et al., 1979; Jaaska, 1980) є донором геному D у T. aestivum.

Рис. 1 Схематичне зображення хромосом ліній I - 5/20-91 BC₁F₉ та II - 5/55-91 BC₁F₉ з розподілом МС маркерів, що виявили зміни геному пшениці. Схема локалізації МС маркерів базується на генетичній МС карті пшениці згідно (Rцder et al., 1998). С - центромера;

- нові фрагменти ампліфікації МС локусів, відсутні у батьківських форм;

- інтрогресивний фрагмент;

- делеція МС локусу пшениці

Размещено на http://www.allbest.ru/

Показано присутність МС маркерів, які виявили інтрогресивні фрагменти в геномі В (Xgwm 259-1BS, Xgwm 389-3BS) та в геномі D досліджених ліній (Xgwm 174-5DL, Xgwm 182-5DL, Xgwm 261-2DS, Xgwm 325-6DS) у чотирьох зразків Ae. tauschii. Порівняльний МС аналіз виявив присутність маркерів Xgwm 18-1BS та Taglut-1AS у Ae. caudatа.

Таким чином, підтвердили перенесення чужорідного генетичного матеріалу у геном м'якої пшениці не тільки з геному D Ae. cylindrica, гомологічного геному D T. aestivum, а також і з геному С.

Успадкування стійкості до твердої сажки. Фенотипічний прояв стійкості до твердої сажки визначали на 170 рослинах популяції BC₃F₂, що отримана від схрещування стійкої інтрогресивної лінії 378/2000 з чутливою до твердої сажки лінією м'якої пшениці Лютесценс 23397. Використаний як рекурентний і у подальших бекросах сорт м'якої пшениці Одеська напівкарликова, чутливий до твердої сажки. Стійкість успадковувалась як моногенно домінантна ознака 3:1, з розщепленням у F₂ 138 стійких та 32 чутливих рослин (ч² = 3,16). З 138 стійких рослин F₂ в F₃: 34 сім'ї - гомозиготні за стійкістю до твердої сажки та 104 - гетерозиготні. Однак співвідношення класів розщеплення F₂ не відповідає очікуваному 1:2:1 (ч² = 7,66). В даному випадку спостерігається відхилення теоретичних класів від емпіричних: нестача обох типів гомозигот та надлишок гетерозигот. Чинник, що спотворює розщеплення, можливо, поєднаний з розташуванням гена стійкості в складі чужорідної транслокації, внаслідок чого можуть виникати певні відхилення в співвідношенні розщеплення за досліджуваною ознакою.

Базуючись на реакції до твердої сажки F₂ та F₃ сімей, добрані рослини покоління F₂ гомозиготні за стійкістю (34 рослини) і за чутливістю (32 рослини).

Використання ISSR- та SSR-аналізу для маркування гена стійкості до твердої сажки. Для з'ясування можливого зчеплення інтрогресивних ISSR-локусів, що виявлені у лінії 5/55-91, з геном стійкості до твердої сажки проводили порівняння електрофоретичних спектрів ДНК батьківських форм: сорту Одеська напівкарликова, лінії Лютесценс 23397, Ae. cylindrica та інтрогресивної лінії 5/55-91, а також рослин популяції BC₃F₂, що розщеплюється. BSA проводили на ДНК 66 відібраних гомозиготних рослин популяції BC₃F₂. ISSR-аналіз з трьома праймерами, які детектували шість інтрогресивних локусів у лінії 5/55-91, не дозволив виявити поліморфізм ДНК між стійкими та чутливими гомозиготними рослинами популяції BC₃F₂.

SSR-аналіз батьківських форм та популяції BC₃F₂ проводили з використанням семи МС маркерів пшениці, які детектували інтрогресивні фрагменти, і п'яти МС маркерів, що виявили нові алелі у лінії 378/2000, нащадка лінії 5/55-91. З МС маркерів використаних для маркування гена стійкості до твердої сажки тільки Xgwm 259 (алель 99 п.н.) виявив поліморфізм між батьківськими генотипами та між стійкими і чутливими гомозиготними рослинами популяції BC₃F₂. За допомогою комп'ютерної програми “МАРМАКЕR” ver. 3.0 визначили відстань МС маркера Xgwm 259 від гена стійкості до твердої сажки, яка склала на хромосомній карті пшениці 8,3 сМ. Згідно з даними про розташування локусу Xgwm 259 на мікросателітній карті м'якої пшениці (Rцder et al., 1998) вдалося локалізувати даний ген в теломерній ділянці довгого плеча хромосоми 1В пшениці.

Молекулярне картування гена стійкості до твердої сажки, що перенесений від Ae. cylindrica в м'яку пшеницю. Для локалізації гена стійкості до твердої сажки на молекулярно-генетичній карті хромосоми 1В м'якої пшениці досліджували вибірку рослин BC₃F₂ (170 рослин) з МС маркерами, що детектували поліморфізм в даній популяції. Такими МС маркерами є Xgwm 33-1BS, Xgwm 18-1BS, Xgwm 131-1BL, Xgwm 259-1BL, які виявили інтрогресивні та нові алелі в батьківської лінії 378/2000. Отримані результати гібридологічного та МС аналізу наведено у таблиці 1.

Отримані дані генотипування рекомбінантів BC₃F₂ і фенотипового прояву стійкості до твердої сажки аналізували за допомогою програми “JOINMAP” ver. 2.0 з картувальною функцією Козамбі (рис.3 а) та Холдейна (рис. 3 б). Згідно даних мікросателітної карти м'якої пшениці (Rцder et al., 1998) маркер Xgwm 259 локалізовано в теломерній ділянці довгого плеча хромосоми 1В пшениці (рис. 3 в). За нашими даними вказаний маркер локалізований в інтеркалярній ділянці довгого плеча хромосоми 1В. На основі результатів картування можна припустити, що відбулася: транслокація термінального інтрогресивного фрагмента в інтеркалярну ділянку довгого плеча хромосоми 1В м'якої пшениці; інверсія фрагмента хромосоми 1В; чи локалізація маркера Xgwm 259 в інтеркалярній ділянці характерна для аналізованих сортів одеської селекції.

Перевірка маркувальної здатності локусу Xgwm 259 зчепленого з геном стійкості до твердої сажки. Маркувальну здатність виявленого локусу Xgwm 259 перевіряли на популяції BC₃F₂, що розщеплюється, яка отримана від схрещування лінії 378/2000 з сортом м'якої пшениці Ніконія. З 360 рослин BC₃F₂ 85 чутливі до твердої сажки, що відповідає розщепленню 3:1 (ч² = 0,37). У зв'язку з тим, що у BC₃F₂ виявляються тільки гомозиготні чутливі до твердої сажки рослини, проводили оцінку здатності виявленого маркера ідентифікувати чутливі рослини. 85 чутливих за фенотипом рослин маркер Xgwm 259 ідентифікував як 83 чутливих гомозиготнихі два стійких гетерозиготних генотипи. З 275 стійких за фенотипом рослин популяції BC₃F₂ маркер Xgwm 259 ідентифікував 16 чутливих гомозиготних генотипів. Сумарна помилка маркера щодо виявлення чутливих рослин склала 5 %.

Таблиця 1 Розщеплення у комбінації схрещування 378/2000 (стійка) x Лютесценс 23397 (чутлива), отримане гібридологічним та SSR-аналізами

Р, при df=2	Ген чи МС маркер	Кількість генотипів BC3F2	Фактично спостережене	Теоретично очікуване	ч2
0,025-0,010 0,750-0,500 0,250-0,100	Ген стійкості до твердої сажки Xgwm 259 Xgwm 131 Xgwm 18 Xgwm 33	170 170 170 170 170	341 : 1042 : 323 40 : 92 : 38 33 : 96 : 41 30 : 102 : 38 31 : 102 : 37	421 :862 : 423 42 :86 : 42 42 :86 : 42 42 :86 : 42 42 :86 : 42	7,6 0,9 3,1 6,8 6,5



Алель 99 п.н. за локусом Xgwm 259, що маркує стійкі до твердої сажки генотипи, присутні в усіх 12 інтрогресивних лініях м'якої пшениці (BC₁F₉), які отримані як лінії 5/20-91 та 5/55-91 від схрещування сорту Одеська напівкарликова з Ae. cylindrica, і яким властива також стійкість до твердої сажки. При тестуванні 24 сортів м'якої пшениці СГІ і трьох сортів Миронівського інституту пшениці ім. В.М. Ремесла УААН не виявили алель 99 п.н. локусу Xgwm 259. Даний факт свідчить, що алель 99 п.н., який маркує стійкість до твердої сажки, специфічний для Ae. cylindrica та інтрогресивних ліній, які його несуть.

Таким чином, ДНК-маркування та картування гена стійкості до твердої сажки, що перенесений від Ae. cylindrica в м'яку пшеницю, дозволили локалізувати даний ген в інтеркалярній ділянці довгого плеча хромосоми 1В пшениці на відстані 7.6 - 8.5 сМ дистальніше від МС маркера Xgwm 259. Даний маркер може бути використаний в селекції при поліпшенні генотипів пшениці за стійкістю до твердої сажки.

ВИСНОВКИ

Вперше охарактеризовано за допомогою ПЛР-методів мінливість геному пшениці, яка спричинена віддаленою гібридизацією з Ae. cylindrica.

1. Детектовано за допомогою ISSR- та SSR-методів чужорідний генетичний матеріал в геномі інтрогресивних ліній м'якої пшениці та виявлено генетичну гетерогенність у генотипів гібридного походження.

2. З використанням мікросателітних маркерів вперше виявлено мінливість геному пшениці, яка спричинена віддаленою гібридизацією з Ae. cylindrica.

Віддалена гібридизація призвела до:

а) інтрогресії фрагментів геному егілопсу в хромосоми м'якої пшениці 1AS (Taglut), 1BS (Xgwm 18), 1BL (Xgwm 259), 2ВL (Xgwm 619), 2DS (Xgwm 261), 3BS (Xgwm 389), 3DL (Xgwm 314 и Xgwm 383), 5DL (Xgwm 174 и Xgwm 182) та 6DS (Xgwm 325);

б) делеції субтеломерних ділянок хромосом м'якої пшениці 1DS (Xgwm 33) та 6AL (Xgwm 427 и Xgwm 617);

в) появи нових фрагментів ДНК, які відсутні у батьківських форм.

3. Отримано мікросателітні маркери до стабільних інтрогресивних фрагментів геному Ae. cylindrica в геномі м'якої пшениці. Показано ефективність використання даних маркерів для детекції інтрогресивних фрагментів ліній-донорів, які використовуються в селекційних програмах.

4. За допомогою SSR-аналізу локалізовано на молекулярно-генетичній карті м'якої пшениці ген стійкості до твердої сажки, що перенесений від Ae. cylindrica, в інтеркалярній ділянці довгого плеча хромосоми 1В пшениці на відстані 7.6 - 8.5 сМ дистальніше від маркера Xgwm 259.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Виявлені ДНК-маркери до стабільних інтрогресивних фрагментів геному Ae. cylindrica рекомендується використовувати для маркування генів стійкості, що перенесені від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці, а також для відновлення генотипу рекурентного батька.

2. Маркер Xgwm 259, який виявлений в цьому дослідженні, може бути використаний як тестерний для гена стійкості до твердої сажки, що перенесений від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Галаев А.В., Бабаянц Л.Т., Сиволап Ю.М. Детекция интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrica Host в геном Triticum aestivum L. с помощью ISSR- анализа // Цитология и генетика. -2003. - Т. 37, № 3. - С. 3-8.

Особистий внесок здобувача - проведено порівняльний ISSR-аналіз інтрогресивних і батьківських форм для виявлення ділянок геному донора в пшениці, в яку залучені нові локуси стійкості до грибкових захворювань.

Галаев А.В., Бабаянц Л.Т., Сиволап Ю.М. Детекция интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrica Host в геном Triticum aestivum L. с помощью ISSR- и SSR-анализа // Генетика. - 2004. - Т. 40, № 12. - С. 1654-1661.

Особистий внесок здобувача - проведено ISSR- та SSR-генотипування рослин інтрогресивних ліній 5/55-91 і 5/20-91 добраних у BC₁F₉, в походженні яких брав участь Ae. cylindrica.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетический анализ генома пшеницы (T. aestivum L.) с интрогрессией генетических элементов Ae. cylindrica Host // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, № 3. - С. 57-66.

Особистий внесок здобувача - проведено детекцію молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів батьківських форм за допомогою 104 мікросателітних маркерів; охарактеризовано мінливість геному м'якої пшениці, що відбулася при віддаленій гібридизації з егілопсом; показано стабільність виявлених інтрогресивних фрагментів у гібридних форм.

Галаев А.В., Бабаянц Л.Т., Сиволап Ю.М. Молекулярное картирование и маркирование гена устойчивости к твердой головне, перенесенного от Aegilops cylindrica в мягкую пшеницу // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40, № 2. - С. 3-11.

Особистий внесок здобувача - генотипування рекомбінантів популяції F₂ (378/2000 x Лютесценс 23397) за допомогою 351 RAPD-, 60 ISSR-, 95 пар SSR-праймерів; проведено ДНК-маркування та картування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. ISSR-анализ интрогрессии фрагментов генома эгилопса в геном мягкой пшеницы // Матеріали Всеукраїнської конференції молодих вчених “Засади сталого розвитку аграрної галузі” (28-30 жовтня 2002 р.) Київ, Україна. - 2002. - С. 62-63.

Особистий внесок здобувача - генотипування рослин інтрогресивної лінії 5/20-91 BC₁F₉, в походженні якої брав участь Ae. cylindrica, за сімома ISSR-локусами.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Детекция интрогрессии элементов генома эгилопса в геном гексаплоидной пшеницы с помощью микросателлитного анализа // Сборник тезисов 2-й Международной конференции молодых ученых “Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений” (19-23 мая 2003 г.) Харьков, Украина. - 2003. - С. 21-22.

Особистий внесок здобувача - проведено детекцію інтрогресивних фрагментів геному Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці за 40 SSR-локусами; виконано порівняльний SSR-аналіз інтрогресивних ліній.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Особенности интрогрессии элементов генома Aegilops cylindrica Host в геном Triticum aestivum L. // Сборник тезисов IV Международной конференции “Геном растений” (10-13 июня 2003 г.) Одесса, Украина. - 2003. - С. 14.

Особистий внесок здобувача - проведено ISSR- та SSR-генотипування рослин інтрогресивних ліній 5/55-91 і 5/20-91 добраних у BC₁F₉, в походженні яких брав участь Ae. cylindrica; виконано порівняльний молекулярно-генетичний аналіз інтрогресивних ліній.

Galaev A.V., Sivolap Yu.M. Introgression detection of Aegilops cylindrica Host DNA into Triticum aestivum L. genome // Ukrainian - U.K. Workshop on Plant biotechnology “Biotech approaches to Engineering plant growth” (14-16 March 2004) Yalta, Ukraine. - 2004. - P. 14-19.

Особистий внесок здобувача - проведено ISSR- та SSR-генотипування рослин інтрогресивних ліній 5/55-91 і 5/20-91 добраних у BC₁F₉; вивчено стабільність виявлених інтрогресивних фрагментів у гібридних форм.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. ДНК маркирование гена устойчивости к твердой головне, перенесенного от Aegilops cylindrica в мягкую пшеницу // Международная научная конференция “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (24-26 ноября 2004 г.) Минск, Беларусь. - 2004. - С. 41-42.

Особистий внесок здобувача - генотипування рослин популяції (378/2000 x Лютесценс 23397) F₂ за RAPD-, ISSR- та SSR-локусами; проведення ДНК-маркування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Особенности интрогрессии фрагментов генома Aegilops cylindrica Host в геном Triticum aestivum L. // Международная научная конференция “Молекулярная генетика, геномика и биотехнология” (24-26 ноября 2004 г.) Минск, Беларусь. - 2004. - С. 42-44.

Особистий внесок здобувача - проведено детекцію молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів батьківських форм за допомогою 76 мікросателітних маркерів; показано стабільність виявлених інтрогресивних фрагментів у гібридних форм на різних етапах бекросування та самозапилення.

Галаєв О.В., Бабаянц Л.Т., Сиволап Ю.М. Маркування методом SSR гена стійкості до твердої сажки, що перенесений від Aegilops cylindrica Host до м'якої пшениці // Міжнародна науково-практична конференція “Генетичні ресурси для адаптивного рослинництва: мобілізація, інвентаризація, збереження, використання” (29 червня - 1 липня 2005 р.) Оброшино, Україна. - 2005. - С. 241-242.

Особистий внесок здобувача - генотипування рослин популяції (378/2000 x Лютесценс 23397) F₂ за допомогою SSR-маркерів; проведено ДНК-маркування гена стійкості до твердої сажки, перенесеного від Ae. cylindrica в геном м'якої пшениці.

Галаев А.В., Сиволап Ю.М. Способность передачи микросателлитных последовательностей из геномов C и D Ae. cylindrica в геномы А, В и D мягкой пшеницы // Международная научная конференция “Современные проблемы генетики” (21-23 ноября 2005 г.) Минск, Беларусь. -2005. - С. 75.

Особистий внесок здобувача - з'ясовано геном на належність інтрогресивних мікросателітних послідовностей геному С чи D Ae. cylindrica, які виявлені в геномах А, В та D м'якої пшениці.

АНОТАЦІЇ

Галаєв О.В. Мінливість геному пшениці Triticum aestivum при віддаленій гібридизації її з Aegilops cylindrica. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2006.

Дисертація містить теоретичний та експериментальний матеріал з детекції ISSR- та SSR-маркерів до інтрогресивних фрагментів у ліній м'якої пшениці, що отриманні внаслідок віддаленої гібридизації з Ae. cylindrica, та використання їх для маркування гена стійкості до твердої сажки, що перенесений від егілопсу. За допомогою маркерів до мікросателітних локусів геному м'якої пшениці вперше визначені особливості мінливості геному пшениці, що відбулися внаслідок гібридизації з Ae. cylindrica, та їх стабільність у форм гібридного походження на різних етапах бекросування та самозапилення. За допомогою SSR-аналізу рекомбінантів популяції F₂ (378/2000 x Лютесценс 23397) визначили зчеплення мікросателітного локусу Xgwm 259 з геном стійкості до твердої сажки. ДНК маркування та картування дозволило локалізувати даний ген в інтеркалярній ділянці довгого плеча хромосоми 1В пшениці на відстані 7.6 - 8.5 сМ дістальніше від мікросателітного локусу Xgwm 259. Даний маркер може бути використаний в селекції при доборі генотипів пшениці, стійкість яких до твердої сажки контролюється цим геном.

Ключові слова: м'яка пшениця, Ae. cylindrica, інтрогресивні лінії, ПЛР, мікросателіти, інтрогресивні фрагменти, ген стійкості до твердої сажки.

Галаев А.В. Изменчивость генома пшеницы Triticum aestivum при отдаленной гибридизации ее с Aegilops cylindrica. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация содержит теоретический и экспериментальный материал по детекции ISSR- и SSR-маркеров к интрогрессивным фрагментам в линиях мягкой пшеницы, полученных от отдаленной гибридизации с Ae. cylindrica, и использованием их для маркирования гена устойчивости к твердой головне, перенесенного из эгилопса в мягкую пшеницу.

С помощью ISSR- и SSR-методов детектирован чужеродный генетический материал в геноме мягкой пшеницы и выявлена генетическая гетерогенность у генотипов гибридного происхождения от гибридизации мягкой пшеницы и Ae. cylindrica.

Генотипирование интрогрессивных линий BC₁F₉ (5/20-91 и 5/55-91) методом ISSR-анализа с использованием семи праймеров позволило выявить следующие изменения генома пшеницы у гибридных растений: 1) отсутствие фрагмента амплификации, характерного для сорта Одесская полукарликовая, и наличие фрагмента, характерного для Ae. cylindrica (интрогрессия фрагмента генома эгилопса в геном пшеницы); 2) появление новых фрагментов амплификации, отсутствующие у родительских форм.

Генотипирование интрогрессивных линий BC₁F₉ (5/20-91 и 5/55-91) с помощью SSR-анализа позволило обнаружить и классифицировать следующие изменения генома пшеницы у гибридных растений: 1) отсутствие фрагмента амплификации микросателлитного (МС) локуса, характерного для сорта Одесская полукарликовая, и наличие фрагмента, характерного для Ae. cylindrica; 2) появление новых фрагментов амплификации МС локуса, отсутствующих в исследованной выборке родительских форм; 3) полное отсутствие фрагментов амплификации МС локуса (данный тип изменения можно объяснить делецией МС локуса пшеницы у гибридных растений, мутацией сайта праймирования в результате чего невозможна амплификация фрагмента ДНК либо транслокацией фрагмента генома эгилопса, не содержащего МС локус пшеницы). Не выявлено замещений хромосом мягкой пшеницы гомеологичными хромосомами эгилопса.

МС анализ интрогрессивных линий BC₂F₅ (237/2000 и 378/2000) потомков линий 5/20-91 и 5/55-91 показал: стабильное внедрение генетических элементов эгилопса в растения пшеницы; элиминацию отдельных перенесенных участков генома эгилопса в процессе беккроссирования; уменьшение размера интрогрессивного фрагмента при повторном беккроссировании; сохранение новых фрагментов амплификации, отсутствующих у родительских форм; и элиминацию обнаруженных новых фрагментов амплификации у гибридных растений.

...