Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Кальцієва регуляція гальмівної синаптичної передачі між нейронами культури гіпокампу

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Кравченко Микола Олександрович

УДК 577.353.5:612.822

Київ 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Федулова Світлана Анатоліївна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідуюча лабораторією біофізики синаптичної передачі

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Малишева Маргарита Костянтинівна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

ст. науковий співробітник, зав. відділом нейрохімії

кандидат біологічних наук

Пархоменко Микола Тимофійович

Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України

пров. науковий співробітник відділу нейрохімії

Провідна установа: Національний Університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, м. Київ

Захист відбудеться "30" травня 2006 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ 01024.

Автореферат розісланий 28 квітня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Нейрони обмінюються між собою інформацією переважно за допомогою хімічних синапсів. У таких синаптичних з'єднаннях потенціал дії, який генерується поблизу соми, розповсюджується вздовж аксона до пресинаптичної терміналі, де відкриває потенціал-керовані Са2+-канали. Іони кальцію, потрапляючи при цьому всередину нервових терміналей, запускають швидке вивільнення везикул, що містять нейротрансмітер, молекули якого зрештою й сприймаються рецепторами на постсинаптичній клітині. Практично всі типи синапсів регулюються цілою низкою коротко- та довготривалих процесів, з яких деякі сприяють зменшенню, а інші - збільшенню амплітуди постсинаптичного сигналу (синаптичної сили). В деяких синапсах при повторюваному використанні відбувається синаптичне підсилення і домінує полегшення нейропередачі; в інших наслідком є зменшення синаптичної сили і розвивається депресія (Zucker and Regehr, 2002). У більшості випадків, імовірно, має місце накладання великої кількості регуляторних процесів, і результуючий вплив являтиме собою комбінацію полегшення та депресії, причому зміни синаптичної сили істотно залежатимуть від особливостей часових характеристик синаптичної активації.

Добре відомо, що основним джерелом вільних іонів кальцію, які ініціюють викликане надходженням потенціалу дії вивільнення нейромедіатора з пресинаптичних закінчень, виступає позаклітинне середовище. Однак, показано, що пресинаптичні кальцієві депо, зокрема, депо ендоплазматичного ретикулуму, безсумнівно приймають участь у запуску вивільнення медіатора (Verkhratsky, 2002). Припущення про кальцій-опосередкований контроль регуляторних процесів з постсинаптичного боку також знайшли експериментальне підтвердження у працях різних авторів (Savic and Sciancalepore, 1998). Таким чином, питання про існування та внесок різних пре- та постсинаптичних механізмів у регуляцію пластичності синаптичної передачі на тому чи іншому експериментальному об'єкті наразі залишається відкритим.

У більшості робіт з дослідження короткочасної синаптичної пластичності увага акцентується на вивченні лише однієї з її форм - або депресії, або полегшення. Одне з дискусійних питань, пов'язаних з синаптичною пластичністю, торкається здатності нервових клітин змінювати притаманний їм характер пластичності. З огляду на наявність у гіпокампі різних типів ГАМК-ергічних інтернейронів, які є ключовою ланкою у формуванні специфічних для гіпокампу ритмів електричної активності (Poncer et al., 2000) і, за останніми літературними даними, зумовлюють коротко- та довгострокові зміни гальмівної передачі, актуальність має також порівняння різних типів пластичності, спостережуваних на одному й тому самому об'єкті, а також можливих переходів між ними.

З іншого боку, накопичення знань про синаптичну передачу в цілому спонукає до поглибленого вивчення її особливостей на якомога більш елементарному рівні. На сьогодні більшість авторів використовує непрямі методи для дослідження синаптичної пластичності на рівні поодинокої терміналі. Тому особливий інтерес представляє не тільки аналіз кальцій-залежної регуляції короткочасної синаптичної пластичності, а й порівняння її властивостей при одночасній активації різної кількості синаптичних терміналей.

Усе вищезгадане й визначило необхідність дослідження особливостей кальцій-залежної регуляції короткочасної пластичності гальмівних синаптичних зв'язків між культивованими нейронами гіпокампу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано в рамках наукових тем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця “Дослідження молекулярних механізмів - проявів функціонування геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем організму в нормі та патології” (Державний реєстраційний номер 0102U002472), “Вивчення ролі Са2+ як внутриклітинного посередника у активності синапсів холінергічних вегетативних нейронів та ГАМК-ергічних нейронів гіпокампу” (Держ. реєстр. № 0102U000830), “Дослідження збуджуючої та гальмівної синаптичної передачі центральних та периферичних нейронів в залежності від функціональних властивостей їх пре- та постсинаптичних мембран” (Держ. реєстр. № 0105U003232) та наукового проекту Державного фонду фундаментальних досліджень “Шляхи регуляції синаптичної передачі через впливи на субмікронну структуру синапсів” (Держ. реєстр. № 05.07/00237).

Мета дослідження. Метою роботи було вивчити короткочасні зміни синаптичної сили ГАМК-ергічної передачі між культивованими нейронами гіпокампу при впливі на кальцій-опосередковані регуляторні механізми на рівні поодинокої терміналі та при інтегральній активації багатьох синаптичних закінчень одного аксона.

Завдання дослідження.

1. Визначити характер впливу, зумовленого активаторами вивільнення кальцію з депо ендоплазматичного ретикулуму, на синаптичну передачу між нейронами гіпокампу в культурі.

2. Проаналізувати короткочасні зміни ефективності синаптичної передачі при парній стимуляції за умов спустошення кальцієвих депо під дією агоністів ріанодинових рецепторів.

3. Дослідити залежність параметрів короткочасної синаптичної пластичності від величини деполяризації поодинокої синаптичної терміналі та зовнішньоклітинної концентрації іонів кальцію.

4. Порівняти властивості синаптичного зв'язку, сформованого поодинокою терміналлю та кількома закінченнями одного аксона при спустошенні кальцієвих депо.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі описана одна з форм короткочасної синаптичної пластичності - зміна ефективності синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів. Показано, що в умовах культивування можуть існувати два типи нейронів, які здатні проявляти суттєво відмінні типи такої пластичності - депресію та полегшення при парній стимуляції.

Показано, що речовини, які ініціюють вивільнення кальцію з депо ендоплазматичного ретикулума, складним чином регулюють синаптичну передачу - за рахунок впливу як на пре-, так і на постсинаптичні механізми. Також виявлено, що поодинокі ГАМК-ергічні синапси здатні не лише варіювати ступінь короткочасної пластичності, а й радикально змінювати її характер в залежності від кількості іонів кальцію, присутніх у зовнішньому середовищі.

Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення стосовно механізмів, відповідальних за кальцій-залежну регуляцію ефективності гальмівних синаптичних зв'язків у ЦНС.

Теоретичне та практичне значення роботи. Результати дисертаційної роботи представляють передусім фундаментальний інтерес, оскільки отримано нові дані стосовно короткочасної пластичності гальмівної синаптичної передачі та її регуляції за допомогою кальцій-опосередкованих механізмів. Отримані відомості щодо змін ефективності синаптичної передачі на рівні поодинокої терміналі та інтегрального синаптичного з'єднання дозволяють глибше проаналізувати процеси, які відіграють фундаментальну роль в нормальному функціонуванні ЦНС та розвитку нейрональних мереж. Результати роботи дозволяють наблизитись до розуміння феномену пам'яті в цілому, оскільки нейронна мережа гіпокампу вважається місцем локалізації процесів, які регулюють здатність до навчання та формують основи пам'яті.

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з налагодження установки для електрофізіологічних досліджень та системи локальної аплікації, з отримання та обробки експериментальних даних, з аналізу та узагальнення результатів досліджень була виконана особисто автором. В розробці загальної концепції роботи, її обговоренні та редагуванні брали участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення дисертаційної роботи було викладено на семінарах Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАНУ (Київ, 2003, 2005 р.) та наступних наукових конференціях: Second Kiev Symposium "Smooth Muscle Physiology and Biophysics" (28-31 жовтня 2003 р., Київ, Україна), Конференція для молодих вчених "Перспективні напрямки наукових досліджень" (17-18 листопада 2003 р., Київ, Україна), "First Ukrainian Congress for Cell Biology" (25-28 квітня 2004 р., Львів, Україна), International Workshop in Cell Physiology "Transport Mechanisms Across Cell Membranes: Channels and Pumps" (13-17 жовтня 2004 р., Санкт-Петербург, Росія).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових фахових журналах та тезах 5 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 269 найменувань. Роботу викладено на 154 сторінках та ілюстровано 27 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження короткочасної синаптичної пластичності, внутрішньоклітинних кальцієвих депо і поодиноких гальмівних синапсів, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено відомості про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів дисертації.

Розділ Огляд літератури присвячений висвітленню основних понять мембранної теорії збудження; опису складу, типів, функцій ГАМК-рецепторів; огляду внутрішньоклітинних кальцієвих депо та їх взаємодії з механізмом вивільнення нейротрансмітера; класифікації типів синаптичної пластичності.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано використані матеріали та методи досліджень, а саме:

1. Приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампу низької щільності;

2. Методика фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” для реєстрації постсинаптичних струмів;

3. Методика позаклітинної електричної стимуляції аксона пресинаптичного нейрона;

4. Методика локальної позаклітинної суперфузії для аплікації фармакологічних речовин;

5. Методика позаклітинної електричної стимуляції поодинокої терміналі пресинаптичного нейрона;

6. Статистична обробка отриманих результатів за допомогою стандартних методів аналізу.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампу. Для отримання культури використовувались новонароджені щури лінії Вістар. Тварин декапітували, головний мозок вміщували в мінімальне середовище Ігла ("Sigma", США) с додаванням 20 мМ буфера HEPES, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. За допомогою скальпеля гіпокамп відокремлювали від решти відділів мозку і розрізували у поперечному напрямку на частини 1 ч 2 мм завтовшки. Ферментативну обробку здійснювали 0,05%-м розчином трипсину (тип XII-S, "Sigma", США) при кімнатній температурі (23 ч 25С) протягом 5-6 хвилин. Потім тканину промивали чотири рази розчином для культивування, до складу якого входили: мінімальне середовище Ігла, 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл інсуліну, 2,3 мг/мл бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату. Суспензію клітин отримували за допомогою механічної дисоціації набором пастерівських піпеток з діаметрами кінчиків, які послідовно зменшувались. Кількість клітин в одиниці об'єму вихідної суспензії підраховувалась за допомогою камери Горяєва. Шляхом додавання розчину для культивування кількість клітин в одиниці об'єму кінцевої суспензії доводилось до такого рівня, при якому щільність клітин при висіванні становила 30000 од/см2.

Клітини висаджували на чашку Петрі, яка була попередньо оброблена полі-L-орнітином. В скляне кільце діаметром 9 мм, яке обмежувало площину посадки, наливалось 250 мкл суспензії. Чашки Петрі з суспензією вміщувались в інкубатор ("Jouan", Франція) з контрольованим вмістом двоокису вуглецю (5% СО2) в повітряно-газовій суміші, контрольованим температурним режимом (37С) та постійним пасивним зволоженням. На третій день культивування для пригнічення проліферації гліальних клітин в середовище додавали цитозин-в-D-арабіно-фуранозид (5 мкМ). Режим обробки культури цитозин-в-D-арабіно-фуранозидом підбирався таким чином, щоб пригнітити проліферацію гліальних клітин на такій стадії, коли кількість астроцитів була достатньою для утворення гліального моношару. Повторна повна заміна розчину для культивування проводилась через 20 ч 24 години.

Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих протягом 14 - 28 днів, при кімнатній температурі (20 ч 23С). На цей час клітини формували необхідну для досліджень кількість синаптичних контактів, також можна було чітко ідентифікувати типи клітин. Для експериментів відбирались не тільки нейрони, які мають виражену пірамідальну форму, а також і мультиполярні. Їх розмір складав приблизно 20 ч 30 мкм.

Електрофізіологічні методи. Для вимірювання трансмембранних струмів, які відводились від культивованих нейронів гіпокампу, було застосовано метод фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани ("patch-clamp"), який було описано Неєром та Сакманом (Neher and Sakmann, 1976; Hamill et al., 1981). Підтримуваний потенціал в експериментах становив -75 мВ. Значення природного потенціалу спокою культивованих нейронів гіпокампу, за нашими вимірюваннями, коливались в межах -50 ч -60 мВ.

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного складу (мМ): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза 30. Піпеточний розчин містив (мМ): К-глюконат 100, KCl 50, EGTA 10, MgCl2 5, HEPES 20. При дослідженні гальмівних постсинаптичних струмів у зовнішньоклітинний розчин безпосередньо перед початком дослідів додавали блокатори іонотропних глутаматних рецепторів NMDA- та не-NMDA-типів: відповідно DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанову кислоту (DL-AP5) и 6,7-динітрохіноксалін-2,3-діон (DNQX) у концентрації 20 мкМ кожен. У дослідах, де проводилась стимуляція поодинокої пресинаптичної терміналі, до складу зовнішньоклітинного розчину включався також блокатор натрієвих каналів тетродотоксин (TTX) у концентрації 0,5 мкМ. Заповнені розчином, піпетки мали опір 8-10 МОм. Експериментальна установка була зібрана на базі інвертованого мікроскопу Axiovert 35 (Carl Zeiss, ФРН), який при використанні фазовоконтрасного об'єктиву з масляною імерсією забезпечував 1000-кратне оптичне збільшення. В експериментах використовувався підсилювач електричних сигналів Axopatch-1D (Axon Instruments, США). Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП LabMaster TL-1 та програмного пакету pClamp 6.0 (Axon Instruments, США) з частотою дискретизації 10 кГц. Електричні сигнали, які відводились від нервових клітин, піддавались фільтрації за допомогою апаратного високочастотного фільтру Бесселя з частотою зрізу 2 кГц.

Локальна електрична стимуляція проводилась за допомогою стимулятора з ізольованим виходом ISO-Flex (AMPI, Ізраїль); стимулятор було заземлено на спільний з підсилювачем індиферентний електрод. Стимуляційна мікропіпетка з діаметром отвору близько 2 мкм, яку виготовляли за технологією аналогічно піпеткам для реєстрації струмів, заповнювалась стандартним зовнішньоклітинним сольовим розчином і з'єднувалась з виходом стимулятора. Опір такої піпетки, заповненої розчином, становив 5 ч 7 МОм.

Струми реєстрували при подразненні аксона прямокутними імпульсами напруги негативної полярності тривалістю 300 мкс. Частота стимуляції становила 0,2 Гц. Амплітуда напруги на вході стимуляційної піпетки змінювалась в межах від 30 до 60 В, зміна стимулюючого сигналу на виході була лінійною в межах всіх вхідних напруг. Інтервал між імпульсами в парі (при вивченні короткочасної синаптичної пластичності) становив 150 мс.

Методика локальної стимуляції, яка була застосована в цій роботі, детально описана в роботі Федулової та співавт. (Fedulova et al., 1999). Суть методики полягає у тому, що стимуляція відбувається за рахунок локального зміщення потенціалу у зовнішньоклітиннному розчині в безпосередній близькості від стимулюючої піпетки (Рис. 1). На відміну від методики електричної стимуляції аксону тривалість прямокутного імпульсу напруги в даному випадку повинна становити не менше 3 мс. Це дозволить напряму активувати потенціалкеровані кальцієві канали в пресинаптичній терміналі і запустити каскад реакцій, що призведуть до вивільнення нейромедіатора.

Аплікація фармакологічних речовин здійснювалась за методикою швидкої локальної суперфузії (Veselovsky et al., 1996).

Аналіз даних. Кінетичні параметри викликаних постсинаптичних струмів визначались за допомогою програмного пакета Clampfit 9.0 (Axon Instruments, США). Результати представлені в тексті як середнє значення ± похибка середнього.

У розділі Результати викладено результати досліджень змін характеристик гальмівних ГАМК-ергічних струмів, зареєстрованих при спустошенні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулума.

Спочатку було проведено серію дослідів з визначення іонної природи постсинаптичних струмів та їхньої чутливості до специфічного агоністу ГАМКА-рецепторів. З рівняння Нернста рівноважний хлорний потенціал при використанні описаних вище розчинів (концентрація іонів хлору в зовнішньо- та внутрішньоклітинному середовищах становить відповідно 150 та 58 мМ) за кімнатної температури (23 °С = 296 К) буде дорівнювати -24,2 мВ. В експериментальних умовах, використовуючи стимуляцію аксона пресинаптичної клітини, при різних значеннях підтримуваного потенціалу в межах від -100 до 0 мВ було зареєстровано викликані постсинаптичні струми, для яких було побудовано вольт-амперні характеристики. За характеристиками було розраховане усереднене значення потенціалу реверсії, яке виявилось рівним -28,2 ± 4 мВ (n = 3). Також було використано комбінацію методик швидкої локальної суперфузії та іонофоретичної аплікації для безпосереднього прикладання агоніста ГАМК-рецепторів (10 мМ) на сому нейрона.

Усереднене значення потенціалу реверсії становило -24,3 ± 1 мВ (n = 4). Як видно з Рис. 2, потенціали реверсії струмів, викликаних електричною стимуляцією та аплікацією ГАМК (на малюнку, відповідно -28,7 та -24,9 мВ), мають досить близькі значення.

На основі порівняння отриманих експериментальних даних з теоретично розрахованими було зроблено висновок про те, що розглянуті струми переносяться переважно іонами хлору.

Для ідентифікації рецепторів, які приймають участь у проведенні зареєстрованих струмів, було застосовано локальну аплікацію відомого селективного антагоністу ГАМКА-рецепторів бікукуліну метоброміду в концентрації 10 мкМ. Як видно з Рис. 3, бікукулін майже повністю
(до 8 ± 1% від контрольної) пригнічував амплітуду ГПСС, викликаних стимуляцією аксона. Ефект зменшення амплітуди був достовірним (t-тест Ст'юдента, n = 4) і зворотнім.

Оскільки бікукулін майже повністю та зворотно блокував зареєстровані вГПСС, струми були віднесені до таких, що опосередковуються ГАМКА-рецепторами.

Участь кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму в регуляції гальмівної синаптичної передачі між культивованими нейронами гіпокампу. Після остаточного визначення природи викликаних ПСС було досліджено пластичність синаптичної передачі при стимуляції парами імпульсів.

В якості кількісної міри синаптичної пластичності було обрано т.зв. коефіцієнт парної стимуляції (КПС, paired-pulse ratio, PPR). Цей коефіцієнт обчислюється як відношення амплітуди другої відповіді у парі до першої. В залежності від значення КПС при стимуляції парою імпульсів може спостерігатись депресія (КПС < 1) або полегшення (КПС > 1).

Популяція нейронів виявилась суттєво неоднорідною за характером короткочасної синаптичної пластичності при парній стимуляції аксонів. Клітини (точніше, пари клітин) демонстрували як полегшення (КПС > 1, Рис. 4 А), так і депресію при парній стимуляції (КПС < 1 Рис. 4 Б). Слід відмітити, що, хоча коефіцієнт парної стимуляції й міг змінюватись під час реєстрації, для кожної окремої клітини його значення було або завжди більшим, або завжди меншим за одиницю (тобто в процесі дослідів ми не спостерігали переходів від депресії до полегшення і навпаки).

З досліджених 25 нейронів в контрольних умовах n = 16 виявляли депресію (в середньому КПС = 0,77 ± 0,02), n = 9 - полегшення при парній стимуляції (в середньому КПС = 1,12 ± 0,04). Окрім зазначеної особливості, відмінностей між двома підгрупами постсинаптичних клітин ідентифікувати не вдалось - за морфологічними, віковими, електрофізіологічними ознаками, а також за всіма характеристиками викликаних постсинаптичних струмів популяція нейронів була однорідною. Спираючись на літературні дані, було зроблено припущення про те, що якісна різниця у характері синаптичної пластичності пов'язана з гетерогенністю популяції пресинаптичних нейронів.

В першій серії експериментів було розглянуто короткочасну пластичність гальмівної синаптичної передачі за умови вичерпання запасів іонів кальцію у ретикулярних депо. За рахунок зовнішньоклітинного прикладання кофеїну чи ріанодину (10 мМ та 50 нМ відповідно) ініціювався кальцій-активований викид кальцію (CICR) з депо ендоплазматичного ретикулуму. Результатом було спустошення кальцієвих депо і, як наслідок, виключення їх з участі у процесі генерації кальцієвого сигналу в пресинаптичний терміналях.

Кофеїн (10 мМ) значно знижував амплітуди постсинаптичних відповідей при парній стимуляції (Рис. 5 А, Б). Зменшення амплітуди вГПСС було характерне для всіх 10 досліджених нейронів (з них у n = 6 випадках було зафіксовано депресію та у n = 4 випадках - полегшення при парній стимуляції). Такі ж самі експерименти (Рис. 5 В, Г) були проведені з додаванням ріанодину (50 нМ) на n = 15 клітинах. Якісно однакові зворотні зміни амплітуд викликаних гальмівних постсинаптичних струмів спостерігали в обох підгрупах нейронів: як для клітин з характерною депресією (n = 10), так і з полегшенням (n = 5) при парній стимуляції.

В таблиці 1 наведені значення усереднених відносних (у порівнянні з контролем - 100%) показників викликаних струмів, зареєстрованих на клітинах з двох підгруп при прикладанні активаторів вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних депо. Статистичну достовірність відмінностей вказано як:* P < 0,05, *** P < 0,001 (t-тест Ст'юдента).

Таблиця 1