Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

УДК 575.174.015.3:312.32:633.16

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Генетична диференціація культурного ячменю (hordeum vulgare l.) за альтернативними біохімічними ознаками

03.00.15 - генетика

Чапля Андрій Євгенович

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі генетичних основ селекції Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН і в лабораторії селекції сільськогосподарських культур Інституту землеробства і тваринництва західного регіону УААН.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, Нецвєтаєв Володимир Павлович, Бєлгородський науково-дослідний інститут сільського господарства РАСГН, завідувач відділу селекції і насінництва.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, Парій Федір Микитович, Інститут цукрових буряків УААН, провідний науковий співробітник лабораторії селекції цукрових буряків;

кандидат біологічних наук, Антонюк Максим Зиновійович, Національний університет «Києво-Могилянська академія», доцент кафедри біології.

Провідна установа: Одеський національний університет імені І.І. Мечнікова.

Захист відбудеться «26» _жовтня_ 2006 р. о _14⁰⁰_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Акад. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано вересня 2006 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.А. Кравець.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. До сучасних проблем генетики і селекції ячменю належать покращення його пивоварних властивостей, кормової цінності та продуктивності. Пивоварна якість ячменю - комплекс ознак, що пов'язані з вмістом і властивостями білку, крохмалю, рівнем екстрактивності зерна та рядом інших показників. Труднощі селекції сільськогосподарських рослин за цими господарсько цінними ознаками пов'язані з їх складним генетичним контролем, а також значним впливом на їх прояв умов вирощування. Це ускладнює підбір батьківських пар і відбір перспективних генотипів у гібридних комбінаціях. Одним з підходів, що дозволяє забезпечити успішне вирішення цих проблем є використання поліморфних систем білків та ізоферментів як маркерів цінних ознак у селекції, і який здатний значно прискорити отримання перспективних форм рослин (Созинов А.А., 1985).

Дослідженння поліморфізму білків дозволяє розробити методи ідентифікації генотипів. Найбільш широкого використання для генетичного маркування ячменю набули кластери генів гордеїнів - спирторозчинних запасних білків зерна. Генетичний контроль і поліморфізм гордеїнів достатньо вивчені (Созинов А.А. и др., 1978; Поморцев А.А. и др., 1985, 1994). Показано можливості використання гордеїнів як маркерів господарсько цінних кількісних ознак (Jensen J. et al., 1980; Нецветаев В.П. и др., 1984; Нецветаев В.П. и Поморцев А.А., 1989). Описано використання поліморфізму кореневої супероксиддисмутази (локус Sod S) для підвищення продуктивності ячменю на грунтах з низькою кислотністю, та селекції на по сухостійкість (Лінчевський А.А., 1996).

Разом з тим, залишились нерозв'язаними окремі проблеми генетичного контролю кількісних ознак, характеру їх успадкування, а також вивчення впливу кліматичних факторів на рівень прояву тих з них, що визначають продуктивність та пивоварну цінність ячменю. Зокрема, поки-що недостатньо повними є дані щодо маркерів цих ознак серед поліморфних локусів білків та ізоферментів і можливостей їх практичного використання в селекції. Не завжди вдається ідентифікувати деякі алелі гордеїнкодуючих локусів у випадку розділення білків у трубках в крохмальному гелі.

У зв'язку із вище вказаним залишається актуальною можливість застосування методів електрофорезу запасних білків і ізоферментів у поліакриламідному гелі для дослідження їх поліморфізму та пошуку спряженості білкових варіантів з рівнем прояву кількісних господарсько цінних ознак для подальшого їх використання як генетичних маркерів у селекції.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота велась відповідно до теми наукових досліджень відділу генетичних основ селекції Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства і сортовивчення УААН (СГІ - НЦНіС УААН) і лабораторії селекції с.-г. культур Інституту землеробства і тваринництва західного регіону УААН (ІЗіТЗР УААН). Науково-технічна програма «Розробити генетичні основи поліпшення якості продукції сільськогосподарських рослин і шляхи їх селекційного використання», номер державної реєстрації 0194U035090.

Мета і задачі досліджень. Метою даної роботи було дослідити поліморфізм гордеїнів у разі їх розділення в кислому поліактиламідному гелі, вивчити поліморфізм - і -амілазних локусів у ярого ячменю, а також встановити зв'язки між поліморфними білками та господарсько цінними ознаками, що дозволило б розробити маркерні системи біохімічних ознак для пивоварної оцінки та використовувати їх надалі в селекційній практиці.

Об'єкт дослідження - поліморфні системи білків та ізоферментів у ярого ячменю (Hordeum vulgare L.). Предмет дослідження - генетичний контроль і мінливість цих систем у межах відомих локусів запасних білків і ферментів, а також спряженість варіантів з кількісними ознаками. Методи дослідження, що використовувалися у роботі - елекрофорез у поліакриламідному гелі, визначення пивоварної цінності в зерні ярого ячменю згідно відомих методик.

У роботі вирішувались задачі:

виявлення поліморфізму компонентів гордеїнів шляхом розділення їх в кислому поліакриламідному гелі (ПААГ), дослідження генетичного контролю гордеїнів та деяких компонентів глютелінів локалізованих у хромосомі 5 (1Н) ячменю;

вивчення внутрішньосортової гетерогенності та міжсортовго поліморфізму ярого ячменю за гордеїнкодуючими локусами Hrd A, Hrd B, Hrd F методом електрофорезу в ПААГ, а також уточнення генетичних формул сортів;

вивчення внутрішньосортової гетерогенності та міжсортового поліморфізму ярого ячменю за ізоензимами -амілаз, контрольованих локусами Amy 1 і Amy 2;

визначення геногеографії розповсюдження алелів -амілазного локусу Bmy 1 на території східноєвропейських і центральноазіатських країн (колишній СРСР);

виявлення статистичних зв'язків якісних біохімічних ознак з кількісними ознаками якості зерна та елементами продуктивності в ярому ячмені.

Наукова новизна досліджень. Ідентифіковано варіанти гордеїнів у кислому ПААГ, контрольовані алелями локусів Hrd A, Hrd B і Hrd F. Зроблено оцінку різноманітності відповідно до існуючої номенклатури крохмального гелю. Вивчено генетичний поліморфізм -амілази в локусах Amy 1 і Amy 2. Досліджено геногеографію алелів -амілазного локусу Bmy 1 на території східноєвропейських і центральноазіатських країн. Виявлено статистичний зв'язок поліморфних локусів, які контролюють ізофермени з кількісними ознаками пивоварної цінності ярого ячменю та елементами зернової продуктивності.

Практична цінність роботи. Наведені в роботі дані використані та знаходять застосування в генетиці та селекції ячменю за ознаками продуктивності, пивоварної цінності, стійкості до патогенів, для контролю чистоти насіннєвого матеріалу в насінництві районованих сортів, а також для уточнення і вияснення генеології сортів ярого ячменю. З використанням молекулярних білкових маркерів створено сорт ярого ячменю Княжий.

Особистий внесок автора. Основні результати, викладені в дисертаційній роботі, отримані автором самостійно. Формування програми досліджень, лабораторні та лабораторно-польові досліди, збір, опрацювання та аналіз експериментального матеріалу автор вів самостійно, або брав безпосередню участь. У публікаціях, які написані у співавторстві [1-3], автору належать: у роботі [1] - виконання електрофорезів ізоферментів б- і в-амілази та естерази, польова частина дослідів, визначення кількісних показників структури врожаю в окремих лініях модельної популяції ячменю; у праці [2] - електрофоретичне дослідження ізоферментів в-амілази в лініях та селекційних зразках (КСВ) і сортах ярого ячменю (СГІ - НЦНіС УААН та ІЗіТЗР УААН), визначення ознак продуктивності та пивоварної цінності в зразках ячменю; у роботі [3] - визначення варіантів ізоферментів Bmy 1 в сортах ярого ячменю шляхом електрофорезу, аналіз отриманих результатів. Автор брав участь у підготовці публікацій. Крім цього, під час виконання роботи користовувались консультаціями науковців: Поперелі Ф.О., Лінчевського А.А., Рибалки О.І., Хохлова О.М. , Копчика З.М., Марухняка А.Я.

Апробація роботи. Основні результати дисертаційної роботи доповідались на: конференції «Молекулярно-генетичні маркери і селекція рослин» (Київ, 1994); Міжнародній конференції «Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК» (Чабани, 1996); Міжнародній конференції «Актуальні проблеми біотехнології в рослинництві, тваринництві і ветеринарії» (Москва, 1996); Конференції молодих вчених Інституту землеробства і тваринництва західного регіону УААН (Оброшино, 1996); Міжнародній конференції «Молекулярно-генетичні маркери рослин» (Київ, 1996); 7-й Міжнародній конференції «Нетрадиційне рослинництво, екологія і здоров'я» (Сімферополь, 1998); Конференції з генетики та молекулярної біології для студентів та молодих науковців, присвяченої 100-річчю генетики (Львів, 2000); 8-му Міжнародному симпозіумі з генетики ячменю (Аделаїда, Австралія, 2000).

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 13 роботах, з яких: 4 - статті у фахових наукових журналах, 8 - тези доповідей на конференціях, 1 авторське свідоцтво на сорт ярого ячменю Княжий.

Структура та об'єм роботи. Робота викладена на 139 сторінках рукописного тексту, складається з переліку умовних позначень, вступу, п'яти розділів, заключення, висновків, списку використаних джерел (270 назв на 29 стор.) і додатків (43 стор.). Матеріали ілюстровано 33 рисунками на 14 стор. Загальний об'єм роботи - 235 стор.

гетерогенність поліморфізм ячмінь біохімічний

Основний зміст роботи

У вступі подано загальну характеристику роботи, в якій обгрунтовано актуальність, представлено наукову новизну та практичну цінність результатів дисертації, сформульовано мету та задачі досліджень.

У першому розділі проведено аналіз літератури в галузі дослідження генетичного поліморфізму за допомогою альтернативних молекулярних маркерів - запасних білків, ізоферментів і ДНК. Визначено місце досліджень, проведених під час виконання дисертаційної роботи, у розв'язанні проблеми диференціації культурного ячменю за біохімічними ознаками. Подано характеристику білкових маркерів, їх застосування в генетико-селекційних дослідженнях. Вказано на переваги та недоліки використання білків як генетичних маркерів.

У другому розділі подано опис матеріалу, що вивчався, та методики проведення дослідів. Міжсортовий поліморфізм гордеїнів, б- і в-амілази в ярому ячмені (Ноrdeum vulgare L. Emed. Vav. et Bacht.) вивчали у 173, 212 і 557 сортах, відповідно. Більшість з цих сортів походять з колекції, сформованої Нецвєтаєвим В.П. з 1974 по 1995 роки у відділі генетичних основ селекції СГІ - НЦНіС УААН (м. Одеса), а також у сортах з колекції відділу селекції ячменю цього ж інституту. Залучали, крім цього, сорти зібрані Поморцевим А.А. в Інситуті загальної генетики РАН (м. Москва), та Копчиком З.М. в ІЗіТЗР УААН (с. Оброшино). Дані сорти складали колекцію, сформовану переважно з сортозразків, районованих в Україні, Росії, інших східноєвропейських і центральноазіатських країнах (колишній СРСР), а також деяких західноєвропейських і американських регіонах.

Для встановлення генетичного контролю гордеїнів, глютелінів і -амілази в ячменю аналізували поліморфні самозапилювані популяції старших поколінь (F), якими є сорти Красноуфімський 95, Дерибас, Productiv і Trebi, генетичні маркерні ліній - мутанти з пригніченим синтезом гордеїнів Riso 1508 і Riso 56, їх батьківські сорти Вomi та Carlsberg II відповідно, та деякі інші форми і лінії.

Дослідження зв'язку альтернативних біохімічних маркерів з кількісними ознаками пивоварної цінності та продуктивності вели в самозапилених лініях комбінації Одеський 115 Golf (F₇ i F₈); перспективних селекційних лініях та зразках конкурсного сортовипробовування (КСВ) 1994-1995 рр. з відділу селекції ячменю СГІ - НЦНіС УААН (м. Одеса). Аналізували, також, ряд селекційних номерів із ІЗіТЗР УААН (с. Оброшино) та Бєлгородського науково-дослідного інституту сільського господарства РАСГН (м. Бєлгород).

Електрофоретичне розділення гордеїнів у ПААГ (рН 3,1) вели за методикою Поперелі Ф.О., розробленою для гліадинів пшениці (1996), з використанням гелю з параметрами: С=4,0; Т=6,75-8,0. Фракціонування глютелінів вели в ДСН-ПААГ (рН 8,3) за методикою Laemmly U.K. (1970), із урахуванням підходів, описаних Ладогіною М.П. та ін. (1998, 1999). Ізоферменти - і -амілази (Нецветаев В.П., 1993), естерази (Hvid S. and Nielsen G., 1977), кореневої супероксиддисмутази (Нецветаев В.П. и др., 1995) вивчали згідно описаних методів їх розділення.

Сорти колекції та популяції самозапилених ліній пересівали на полях лабораторії селекції ячменю СГІ - НЦНіС УААН (м. Одеса). Ознаки продуктивності рослин ячменю визначали за методичними вказівками для ведення польових експериментів (Доспехов Б.А., 1985). Пивоварну оцінку зерна ярого ячменю вели за рекомендаціями з оцінки якості зерна (Созинов А.А., 1972).

Величину рекомбінації визначали методом максимальної правдоподібності, де критерієм достовірності був ²-тест (Allard R.W., 1956; Серебровский А.С., 1970). У випадку використання для оцінки зчеплення ліній старших поколінь (F) від відповідних комбінацій схрещування використовували формули, наведені в роботі Созінова А.А. та ін. (1978). Частоти зустрічання алелів досліджуваних локусів оцінювали за Рокицьким П.Ф. (1978) та Лі Ч. (1978). Достовірність відмінностей середніх показників якості зерна оцінювали за критеріями Ст'юдента та Фішера (Лакин Г.Ф., 1990).

У третьому розділі розглядаються проблеми використання поліакриламідного гелю для дослідження генетичного контролю і поліморфізму гордеїну та глютеліну. Генетичний контроль гордеїнів здійснюють сім зчеплених локусів, які картовано в короткому плечі хромосоми 5 ячменю. Локуси Hrd A (=Hor 1), Hrd B (=Hor 2) і Hrd F (=Hor 5) кластерні, і визначають блоки компонентів на електрофореграмах (Netsvetaev V.P. et al., 1980). Локуси Hrd C, Hrd D, Hrd E, Hrd G - мінорні, і контролюють присутність, або відсутність одного або двох, у випадку локусу Hrd G, компонентів (Поморцев А.А. и др., 1983; Созинов А.А., 1985). Алелі кластерних гордеїнкодуючих локусів ідентифікують, зокрема, в разі розділення цих білків у трубках крохмального гелю з алюміній-лактатним буфером (рН 3,1) (Поморцев А.А. и др., 1985, 1994). Проте, ідентифікація алелів гордеїнів у даному випадку має ряд обмежень: не завжди вдається ідентифікувати варіанти F-гордеїнів, крім цього виникають труднощі щодо ідентифікації блоків, які відрізняються за рухливістю мінорних компонентів. Враховуючи значну генетичну мінливість гордеїнів і вказані недоліки для ідентифікації компонентів білків, досліджували поліморфізм гордеїнів у пластинах поліакриламідного гелю з тестуванням алелів гордеїнів Hrd A, Hrd B і Hrd F відповідно до вже існуючої номенклатури.

Встановлено, що блоки компонентів кластерних гордеїнкодуючих локусів розташовані на електрофреграмах ПААГ, як і в випадку використання крохмалю, у відповідних для них зонах рухливості. Проте, А, В і F гордеїни володіли різними біохімічними властивосями. У зв'язку з цим досліджували спектри спирторозчинних білків шляхом двоетапного одномірного електрофорезу (гліцин-ацетат, рН 3,1; С=4,0; Т=7,75). Це дало змогу дослідити незалежно B гордеїнові білки, що містять цистеїн і, відповідно, дисульфідні зв'язки, та відокремити їх від А-гордеїнів, у яких ці зв'язки відсутні. Одночасно, F-гордеїни, які також мають дисульфідні зв'язки, чітко ідентифікувалися у всіх варіантах дослід. З використанням під час підготовки екстрактів відновлюючого агента - в-меркаптоетанолу отримували типові для кислого гелю спектри гордеїну. Після розділення без відновника (етап І) гелі профарбовували, а попередньо вирізані стартові частини гелю гомогенізували з в-меркаптоетанолом, і розділяли знову (етап ІІ). На треках мутанта Riso 1508, у якого відсутній синтез майже всіх гордеїнових генів, у всіх варіантах досліду практично не виявлено білків. На треку гордеїнів із в-меркаптоетанолом у мутанта Riso 56, у якого не синтезуються В-гордеїни, не виявляються білки, які контролює локус Hrd B, як і на гелі етапу І, а гель етапу ІІ виявився порожнім. Одночасно, у вихідних сортів цих мутантів Bomi та Carlsberg II, на електрофореграмах гордеїни представлені блоками всіх трьох їх кластерних локусів - Hrd A, Hrd B і Hrd F у варіанті з в-меркаптоетанолом, А і F гордеїни представлені на гелі етапу І, а В гордеїни виявляються на гелі етапу ІІ.

Таким чином, використаний підхід із залученням мутанів Riso 56 і Riso 1508 дозволив чітко виділити «блоки» А, В і F гордеїнів на спектрах ПААГ при рН 3,1, що дало підставу вести більш детальний генетичний аналіз цих білків.

Зчеплення між виявленими в ПААГ поліморфними білками гордеїну, а також глютеліну, вивчали у 210 випадково відібраних самозапилених лініях популяції МайяВінер (F), якою є сорт Красноуфімський 95, а також в 362 самозапилених лініях популяції (КосмосMirena)Ca 33787 (F_7-8), якою є сорт Дерибас. Обидві групи ліній - популяції в стані рекомбінантного насичення (F), виявилися поліморфними за А, В і F гордеїнами. Крім цього, в гібридах МайяВінер виявлено поліморфізм компонентів глютеліну в разі їх розділення в ДСН-ПААГ (рН 8,3). Формули гордеїнів, що контролюють локуси Hrd A, Hrd B, Hrd F батьківських класів (c; d) в цій гібридній комбінації: Майя - HRD 2.8.2; Вінер - HRD 12.19.1, що збігається з даними в крохмальному гелі для цих сортів (Поморцев А.А. и др., 1994). Рекомбінантними (а; b) за локусами Hrd A і Hrd B є, відповідно, генотипічні класи - HRD 2.19.1; HRD 12.8.2. Одночасно, не виявлено рекомбінантів між тісно зчепленими локусами Hrd B і Hrd F. Позначені нами як Glu 1, Glu 2 i Glu 3 локуси виявляли по два алельні варіанти, що визначали зміни в рухливості пари компонентів (Glu 1), присутність двох або трьох рухливіших компоненів (Glu 2), або присутність одного чи двох компонентів (Glu 3) у відповідних ділянках спектру.

Зчеплення між локусами Hrd A і Hrd B складало 22,413,34% (табл. 1). Значення рекомбінації між локусами Hrd A і Glu 1 та Hrd B i Glu 1 було 19,783,15 та 27,824,18%, відповідно. Локус Glu 2 виявив рекомбінацію з Hrd A в 35,785,48%, а її значення між локусами Hrd B i Glu 2 можна трактувати як незалежне успадкування (48,857,45%). Відстань між локусами Glu 1 i Glu 2 складала 28,444,52% рекомбінації. Отже, на хромосомі 5 ячменю досліджувані локуси гордеїнів і глютелінів можуть мати наступне розташування (5S) Hrd B - Hrd A - Glu 1 - Glu 2 (5L).

За блоками гордеїнів сорт Дерибас складається з п'яти генотипічних класів: HRD 2.8.2, HRD 1.21.1, HRD 1.8.2, HRD 2.21.1 i HRD 28.21.1. Генотипи 2.8.2, 1.21.1 і 28.21.1 є батьківськими, та характеризують сорти Космос, Mirena і Ca 33787, відповідно. Лінії чотирьох груп: 2.8.2, 1.12.1, 1.8.2 і 2.21.1 вказують на рекомбінацію між локусами Hrd A і Hrd B і формують відповідні генотипічні класи. За участю алелю A28 не виявлено жодного рекомбінанта з алелем B8, який альтернативний до B21, тобто генотип 28.8.2 серед ліній сорту не представлений. Можна припустити, що на другому етапі гібридизації (КосмосMirena)Ca 33787 рекомбінація в районі кластерів генів Hrd на короткому плечі хромосоми 5 не відбулася. Розраховуючи процент рекомбінації, в зв'язку з цим, лінії з гордеїнами 28.21.1 не враховували.

Таблиця 1. Оцінка зчеплення між локусами гордеїнів і глютелінів у самозапилених лініях (F) популяції Майя Вінер

Примітки: 1 - об'єм вибірки (N); 2 - рекомбінантні класи (a i b); 3 - батьківські класи (c i d).

З чотирьох наведених, рекомбінантними (а; b), за локусами Hrd A і Hrd B є генотипічні класи - 1.8.2; 2.21.1, а батьківськими (c; d), відповідно, - 2.8.2; 1.12.1. Знайдено, що локуси Hrd A і Hrd B зчеплені між собою в 14,022,34% рекомбінації (табл. 2). Так само як у гібридів МайяВінер, тут не виявлено рекомбінантів між тісно зчепленими локусами Hrd B і Hrd F. Зауважимо, що в сорту Дерибас немає відмінностей на електрофоретичних спектрах глютелінів, в разі їх розділення в ДСН-ПААГ (рН 8,3). Одночасно виявлялись відмінності на спектрах гордеїнів, виділених із тих самих зерен, що і глютелін та розділених спільно в ДСН-ПААГ. Даний факт дозволяє говорити про різну генетичну природу цих білків і правильність застосованих методичних підходів до їх екстрагування та розділення в ДСН-ПААГ.

Таблиця 2. Оцінка зчеплення між локуcами гордеїнів у самозапилених лініях (F) популяції (КосмосMirena)Ca 33787 (сорт Дерибас)

Ідентифікацію алельних варіантів гордеїнів у ПААГ при рН 3,1 вели у 173 сортах ярого ячменю, використовуючи метод алельних відмінностей на електрофореграмах. Було виявлено 28 алелів HRD A, з яких п'ять - А50, А51, А52, А53, А54 виявились новими або їм не вдалося присвоїти номер, стосовно номенклатури встановленої з використанням крохмального гелю (Поморцев А.А. и др., 1994). Аналіз А-гордеїнів у кислому ПААГ виявив поліморфізм серед варіанту, відомому як HRD А2. На електрофоретичних спектрах у сортів, які мали генотип з цим алелем, виявилися його чотири підваріанти, які були позначені нами як блоки A2, A2а, A2b, A2c. Крім цього виявлено два підваріанти гордеїну HRD A1, позначені як A1, A1а. Шляхом аналізу колекції сортів було виявлено 32 варіанти в локусі Hrd В, та 4 відомі в локусі Hrd F - F1, F2, F3, F0. Алелі В90, В91, В95 раніше не ідентифіковані. Всім іншим блокам було присвоєно номери згідно відомої номенклатури (Поморцев А.А. и др., 1994).

За результатами аналізу спектрів гордеїнів було виділено групи (сім'ї та підсім'ї) алельних варіантів HRD A. В межах сімей варіанти розрізнялися за рухливістю і (або) кількістю білкових компонентів. Їх можна розглядати як похідні одного блоку (Созинов А.А., 1985). Гордеїни А було згруповано в 4 сім'ї: А І (1, 1а, 52, 12, 21, 18, 31, 13, 33), А ІІ (2, 2а, 2b, 2c, 30, 47, 4, 24, 54), А ІІІ (23, 51, 34, 28, 50, 3, 19, 41, 53) і А ІV (20), де сім'ї A I i A III, в свою чергу, складались із трьох підсімей (див. рис. 2 А). Гордеїни В - в 5 сімей: В І (8, 21, 1, 29, 2, 39, 90), В ІІ (19, 45, 66, 61, 63, 69, 33, 74, 70, 71, 78), В ІІІ (17, 18, 91, 73, 53, 72, 25), В IV (35, 95, 40, 37), B V (52, 36, 84). В сім'ях В ІІ і В ІІІ вирізняли по дві підсім'ї.

Частота зустрічання 28 показаних варіантів HRD A в досліджених сортах була неоднаковою. Найпоширенішим виявився алель А2, який загалом домінує в культурного ячменю - 37,57%. Сумарна частота цього варіанту, та похідних від нього А2a, А2b і А2c склала 58,1%. Відносно високу частоту мали алелі А1 і А12 - 7,22% і 6,36%, відповідно. Нові алелі - А50, А51, А52, А53 і А54 - рідкісні та спостерігалися на спектрах близько в 0,3-1,0% сортів.

Із 32 показаних алелів HRD B переважали варіанти В8, В19 і В1, частота яких складала 23,9%, 20,71% і 14,93%, що в сумі становило 59,54%. Частота 3 нових варіантів В90, В91 і В95 була незначною - 0,58%, 0,58% і 1,73%, відповідно.

Загалом, додатковий поліморфізм у відомих варіантах А1 і А2, а також нові алелі, ідентифіковані в ПААГ, збільшують межі мінливості кластерних гордеїнкодуючих локусів Hrd A і Hrd B.

Серед 173 вивчених сортів ярого ячменю поліморфними хоча б у одному з кластерних гордеїнкодуючих локусів виявились 26,6% сортів, мономорфними - 73,4%, що відповідає даним літератури для крохмального гелю (Поморцев А.А. и др., 1994). У всіх поліморфних сортах, більшість із яких гібридного походження, виявлялись по два

У четвертому розділі розглянуто питання поліморфізму б- і в-амілази в культурному ячмені, обумовлені локусами Amy 1, Amy 2 і Bmy 1, а також вивчено географічний розподіл варіантів в-амілази територією східноєвропейських і центральноазіатських країн (колишній СРСР).

Генетичний контроль б-амілази (б-1,4-глюкан-4-глюканогідролаза; К.Ф. 3.2.1.1) зерна в ячменю здійснюють 2 незчеплені локуси Amy 1 і Amy 2, розташовані в хромосомах 6 і 1, відповідно. Контроль в-амілази (в-1,4-глюканмальтогідролаза; К.Ф. 3.2.1.2) зерна здійснює локус Bmy 1, що знаходиться в хромосомі 4 ячменю.

За даними електрофоретичного аналізу 212 сортів ярого ячменю генетичний контроль б-амілази (локус Аmy 1) здійснювали 12 алельних варіантів, в локусі Amy 2 - 5. Відмінності між варіантами визначалися кількістю, рухливістю та інтенсивністю прояву окремих компонентів на спектрах.

Спостерігалась неоднакова частота зустрічання варіантів AMY 1 у сортах ярого ячменю. Найпоширенішим був варіант Vn, що характеризував сорт Вінер - 53,38%. Досить поширеними виявились варіанти Sv (Сєвєр 1), Sn (Сувенір) і Es (Есме), частота яких складала 11,95, 11,0 і 8,73%, відповідно. Найменш представленими були варіанти, виявлені в сортопопуляціях місцевого походження - Джау Кабутак (Памір) і Амурський місцевий (Далекий Схід) - менше 1%.

Серед варіантів AMY 2 переважав алель Vi (Вінер) - 85,14%. Інші варіанти мали незначну частоту. Крім цього, в сорту Хаджау виявлено лінії з відсутньою активністю в локусі Аmy 2, що було позначено як «нуль-алель».

У 212 вивчених сортах ярого ячменю поліморфними хоча б у одному з б-амілазних локусів виявились 21,23%. Із них поліморфними в локусі Amy 1 - 17,45% сортів, і в локусі Amy 2 - 7,55% сортів. Поліморфними в обох б-амілазних локусах були 3,77% сортів.

Аналіз 557 сортів і селекційних форм ярого ячменю за ізоферментами в-амілази дозволив виділити три групи сортів, що мали один з наведених на рис. 5 електрофоретичних типів ферменту або сумішшю типів, у випадку гетерогенності сорту за даною ознакою. В культурі ячменю знайдено три алелі, позначені як Ar, Br і Al, що визначають відповідні зимотипи в сортах Aramir, Birka і Algerian (Netsvetaev V.P., 1992). Гомогенними, які мають один із варіантів BMY 1, виявилися 471 сорти (84,56%), гетерогенними, в яких по два альтернативні алелі - 86 сортів (15,44%). Серед гетерогенних, генотип Ar+Br виявлено в 80 сортах (14,36%), Ar+Al - в 4 сортах (0,72%), Br+Al - у 2 сортах (0,36%).

За частотою зустрічання вирізнявся варіант Al, який було виявлено лише в 14 сортах (2,51%). Частота варіантів Аr і Br становила відповідно 40,3% і 57,18%.

Враховуючи можливу реакцію генотипів, які мають різні алелі локусу Bmy 1, на зміну умов оточуючого середовища, досліджували розподіл частот його варіантів територією східноєвропейських і центральноазіатських країн. Для встановлення закономірностей у розповсюдженні алелів BMY 1 залежно від агрокліматичних умов дотримувалися розподілу території колишнього СРСР на провінції, що входили до системи його природно-сільськогосподарського районування.

Аналіз даних вказує на нерівномірне розповсюдження частоти алелів ізоензимів -амілази досліджуваною територією. Загалом найбільше зустрічання алелю BMY 1Ar (50% і більше) у ярого ячменю характерне для районів, розташованих на півночі. Просуваючись на південь, частота алелю BMY 1Ar поступово зменшується, а алелю BMY 1Br - збільшується. У південних провінціях, що відрізняються більш посушливим кліматом з підвищеним температурним режимом, розповсюджені сорти, в яких ізоферменти -амілази BMY 1Br зустрічаються значно частіше ніж BMY 1Ar. Так, якщо на півночі (провінція А - Європейська) частота алелю Ar, що обумовлює знижену амілолітичну активність, досягла величини 56,8%, то на півдні європейської частини колишнього СРСР вона закономірно зменшувалась до 14,3% (провінція S - Південно-Українська).

Розгляд динаміки частот алелів локусу Bmy 1 в культурі ярого ячменю з заходу на схід не виявив будь-яких видимих закономірностей. Третій алель BMY 1Al зустрічався в культурі порівняно рідко, здебільшого в європейській частині СРСР і регіонах, прилеглих до неї.

Дослідження динаміки частот варіантів BMY 1 у часі показало домінування алелю Ar серед сортів, що вирощувалися до 1930-х років. Даний алель виявле но в 66,7% сортів того періоду. Наступного десятиріччя він зустрічався тільки у 25,0% сортів ярого ячменю. До 90-х років частоти алелів Ar і Br вирівнялись до 51,1% і 46,6%, відповідно. Таким чином, частоти їх на даний час приблизно однакові.

Враховуючи зональні відмінності в частотах зустрічання алелів локусу Bmy 1 в культурі ярого ячменю, було важливо визначити, які саме кліматичні параметри обумовлюють адаптивну цінність його алелів.

Дані, наведені в табл. 3, вказують, що частота розповсюдження алелю BMY 1Ar від'ємно корелює з температурою оточуючого середовища і позитивно з вологозабезпеченістю регіону. Тоді як частота альтернативного алелю BMY 1Br позитивно корелює з температурою, але від'ємно з вологістю зони. Не виявлено істотного зв'язку між частотою розповсюдження вказаних генетичних факторів і показником континентальності клімату.

Таблиця 3. Коефіцієнти кореляції між частотами зустрічання алелів локуса Bmy 1 і кліматичними показниками зони

Отже, частота зустрічання алелів локуса Bmy 1 залежить у першу чергу від температурного фактора та від кількості опадів, що випадають на даній території.

На це вказує і розрахунок частки вкладу кліматичних факторів у коефіцієнт детермінації розповсюдження алелів локусу Bmy 1 (табл. 4).

Зокрема, частка вкладу середньорічної кількості опадів для варіанту BMY 1Ar cкладала 63,0%. Для варіанту BMY 1Вr частка вкладу суми ефективних температур становила 82,4%. Статистичний зв'язок між розповсюдженням алелю BMY 1Al у культурі ярого ячменю і кліматичними параметрами зони виявився незначним, оскільки цей варіант зустрічається рідко. Проте, якщо взяти до уваги хоча б знакові показники коефіцієнтів кореляції, то слід зазначити, що його частота зустрічання асоціюється з розповсюдженням алелю BMY 1Br (див. табл. 4).

Таким чином, не всі кліматичні параметри однаково впливають на відбір у користь того чи іншого алелю, що контролює ферментативну систему, а одні і ті ж кліматичні фактори не рівноцінні з точки зору значимості різних ізоензимів для нормального функціонування рослинного організму за даних умов середовища. Це видно на прикладі порівняння двох алелів -амілазного локусу Bmy 1.

Таблиця 4. Частка вкладу трьох кліматичних факторів у коефіцієнт детермінації частот алелів локусу Bmy 1 (за даними з 25 географічних провінцій)

Аналізуючи наведені дані, можна спробувати пояснити виявлені зональні відмінності частот алелів -амілазного локусу Bmy 1, що контролюють синтез ізоензимів з різною ферментативною здатністю. Загальновідомо, що в південних регіонах іде більш інтенсивне наростання температур у весняний період і дефіцит вологи в посівному шарі наступає у ранньому періоді вегетації. У північних регіонах добові температури значно нижчі і вологи в цей період досить багато. Враховуючи ці особливості, можна вважати, що ізоензими з підвищеною ферментативною активністю в період проростання зерна, найбільш бажані на півдні, тоді як на півночі цей факт менш важливий через порівняно низьку температуру, що сприяє менш інтенсивному росту рослин і відповідно меншій витраті цукрів у цей період. «Менш активний фермент» сприяє більш тривалому розщепленню крохмалю в цукор, тобто джерело поступлення живлення для проростка за цих умов буде працювати довше.

У п'ятому розділі розглянуто статистичні зв'язки якісних біохімічних ознак з кількісними ознаками, що визначають технологічну цінність зерна та елементи продуктивності.

Тестування 150 самозапилених ліній з комбінації Одеський 115 Ч Гольф із використанням 68 довільних праймерів ДНК для полімеразної ланцюгової реакції та 7 локусів ізоферментів виявило 25 поліморфних локусів, з яких: 4 - ізоферменти (Amy 1, Bmy 1, Est 1 і Est 5) та 21 - RAPD-локуси. Із досліджених 25 молекулярних маркерів ПЛР та ізоферментів, 21 (19 RAPD-локусів, Bmy 1, Est 5) утворили 6 груп зчеплення, які охоплювали 237 сМ, тобто шосту частину геному ячменю. Встановлено, що з геном Est 5, який контролює синтез естерази 5 (рис. 8), зчеплено успадковуються продуктами ампліфікації Р92/93#594 та Р9#1150, виявлені з допомогою пари праймерів Р92 і Р93, та довільним праймером Р9, відповідно. Ці генетичні фактори Est 5, Р92/93#594 і Р9#1150 розташовані в короткому плечі хромосоми 1.

Виявлено також, що продукти Р6#900 і Р9#680 тісно зчеплені з локусом, який контролює синтез -амілази - Bmy 1 (довге плече хромосоми 4). Локуси Bmy 1 і P9#680 зчеплені повністю (0,0%). Можливо, продукт Р9#680 є структурною частиною гена -амілази.

Пошук статистичних зв'язків між варіантами 4 ізоферментних маркерів та кількісними показниками продуктивності рослин за 2 роки спостереження виявив лише зв'язок алелів BMY 1 з озерненістю колоса.

Аналіз зв'язку алелів ізоферментів з кількісними ознаками, що визначають пивоварну цінність зерна, в матеріалі конкурсного сортовипробування (КСВ) відділу селекції ячменю СГІ - НЦНіС УААН представлено в табл. 5.

Отримані відмінності можуть бути обумовлені як ефектами зчеплення генів у межах хромосом, так і безпосереднім біохімічним вкладом алельних станів ізофермента у фенотипічний прояв кількісної ознаки.

Найбільший вплив на величину вмісту білка (Р<0,001) мають варіанти локусів Amy 2 і Sod S. Алелі локусу Amy 2 виявились зв'язані з масою 1000 зерен, локусу Est 12 - з плівчаcтістю. Локус Amy 2 виявився, також, спряжений з екстрактивністю.

У всіх трьох випадках, коли виявлялася кореляція між локусом кореневої супероксиддисмутази Sod S і кількісними ознаками (білковість, -амілолітична активність, маса 1000 зерен), алелю SOD S2 відповідало вище значення ознаки.

Таблиця 5. Аналіз зв'язку алелів локусів ізоферментів з ознаками пивоварної цінності зерна в матеріалі конкурсного сортовипробування відділу селекції ячменю СГІ УААН

Результати дослідження спряженості варіантів -амілази з кількісними ознаками, що відображають продуктивність рослин, солодові якості зерна, амілолітичну активність солоду, отримані під час тестування конкурсних сортовипробувань ярого ячменю СГІ - НЦНіС УААН, представлені в табл. 6.

У всіх спостереженнях, за винятком абіотично не типового 1995 р., з алелем BMY 1Br був пов'язаний вищий рівень амілазної активності (табл. 6, п. 1, 4), вищий рівень екстрактивності (табл. 6, п. 3) та нижчий вміст білка в зерні (табл. 6, п. 3, 6).

Отже, варіант BMY 1Br обумовлює формування зерна з кращими солодовими якостями. Слід зазначити, що залежно від умов середовища відмінності у врожайності зразків, які несуть алелі локуса Bmy 1 Ar або Br, можуть нівелюватися або навіть змінювати знаки.

З використанням молекулярних білкових маркерів у селекції ярого ячменю було створено сорт Княжий (HRD A2.B8.F2; AMY 1Vn; AMY 2Da; BMY 1Ar). На етапах селекції цього сорту починаючи з селекційного розсадника (F₄) здійснювали контроль варіантів гордеїнів з метою запобігання від засмічення. Крім цього відбір вели у користь алелів, спряжених з хорошими солодовими властивостями та високою продуктивністю рослин (HRD A2.B8.F2; AMY 1Vn).

Таблиця 6. Алельні варіанти -амілази і рівень прояву кількісних ознак продуктивості та пивоварної цінності зерна ярого ячменю

Примітки. * - Р>0,95. 1 - 1990 р., 2 - 1993 р., 3 - 1994 р., 4 - 1995 р., 5 - 1996 р.

Висновки

У результаті виконаної роботи проведено диференціацію культурного ячменю за альтернативними біохімічними ознаками - запасними білками зерна та ізоферментами б- і в-амілаз. Встановлено можливі зв'язки між алельними варіантами поліморфних білків (ізоферментів) та кількісними господарсько цінними ознаками в ячменю, що дозволяє використовувати їх як маркери в селекційній практиці.

1. Показано, що поліакриламідний гель при рН 3,1 є оптимальним для ідентифікації алельних варіантів гордеїнів. Шляхом двоетапного одномірного електрофорезу в ПААГ, у мутантах із пригніченим синтезом проламінів Riso 56, Riso 1508 та їх батьківських сортах - Carlsberg II і Bomi, підтверджена приналежність компонентів цих білків до блоків A, B і F гордеїнів.

2. Встановлено зчеплення між проламіновими маркерами хромосоми 5 ячменю і двома, із трьох виявлених, локусами, які кодують глютеліни Glu 1, Glu 2 і Glu 3. Розташування локусів на генетичній карті хромосоми 5: (5S) Hrd B - Hrd A - Glu 1 - Glu 2 (5L). Аналіз двох самозапилених популяцій (F) показав, що рекомбінація між гордеїновими локусами Hrd A і Hrd B коливалась від 22,413,34% до 14,022,34%.

3. Серед 173 зразків колекції ярого ячменю ідентифіковано 28 алелів у локусі Hrd A і 32 - у локусі Hrd B. П'ять варіантів HRD А і три варіанти HRD B раніше не описані. Виявлено чотири та два підваріанти в найбільш поширених алелях HRD А2 (58,1%) і HRD A1 (7,2%), відповідно.

4. Серед 212 сортів ярого ячменю знайдено дванадцять алелів у локусі Amy 1 та чотири - в локусі Amy 2. Генетичний поліморфізм в-амілази (локус Bmy 1) в культурі ярого ячменю, за даними аналізу 557 сортів, складав три алельні варіанти BMY 1Ar, Br, Al. Варіанти AMY 1, AMY 2 і BMY 1 мають різну частоту зустрічання, що пов'язано з їх адаптивними властивостями.

5. На географічне розповсюдження варіантів в-амілази в ярого ячменю основний вплив мають кліматичні характеристики регіону. На частоту зустрічання алелю BMY 1Br здебільшого впливає температурний фактор. Геногеографія алелю BMY 1Ar обумовлена дією двох кліматичних факторів - температури та вологозабезпеченості.

6. У селекції ярого пивоварного ячменю доцільно вести відбір на користь варіанту BMY 1Br, якому відповідають: низький вміст білка в зерні, висока амілолітична активність і, відповідно, більша екстрактивність солоду. В селекції кормового ячменю доцільніше вести відбір алелю BMY 1Ar.

7. В комбінації F_7-8 Одеський 115 Гольф із використанням RAPD-маркерів і ізоферментів виявлено дві групи зчеплення 1S і 4L, які включали локуси Est 5 (Естераза 5) i Bmy 1 (в-амілаза 1), відповідно. Знайдено молекулярний маркер тісно зчеплений з геном, що кодує в-амілазу.

8. Виявлено зв'язок алелів у локусах Amy 2, Bmy 1, Sod S i Est 12 з наступними показниками технологічних властивостей зерна ячменю: вмістом білка, екстрактивністю, -амілолітичною акивністю, плівчастістю та індексом пивоварної цінності.

9. Розбіжності в описі варіантів гордеїнів, б- і в-амілази в деякий сортів, що належать до різних колекцій, підтверджує необхідність реєстрації нових сортів ячменю за біохімічними молекулярними маркерами шляхом аналізу еталонних зразків, отриманих від селекціонерів. Така паспортизація нових сортів за біохімічними маркерами може бути реалізована в насінництві для контролю сортової чистоти.

Публікації за матеріалами дисертаційної роботи

1. Vronska O., Chaplya A. Relation of Hordein's Spectra with Genetic Resistance of Spring Barley to Powdery Mildew // Proc. International Conf. «Protection of Cereal Crops against Harmful Organisms» (Kromмшiћ, 1-4 July 1997). - Kromмшiћ (Сzech Rep.), 1997. - P. 77.

2. Chaplya A.E., Rybalka O.I. Two-step one-dimentional acid-page elctrophoresis of hordein - barley storage protein // Proc. Conf. on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to 100-th anniversary of genetics (L'viv, 20-22 Apr. 2000). - L'viv (Ukraine), 2000. - P. 115.

3. Kopchyk Z., Marukhnyak A., Kosylovich G., Chaplya A. Breeding development spring barley varieties in the Western Region of Ukraine // Proc. VIII-th International Barley Genet. Symp. (Barley Genetics VIII) (Adelaide, 22-27 Oct. 2000). - Adelaide (Australia), 2000. - Vol. 3. - P. 27-29.

(Особистий внесок здобувача - участь у проведенні досліджень, опрацювання та аналіз експериментальних даних, написання та оформлення тез доповіді).

Анотація

Чапля А.Є. Генетична диференціація культурного ячменю (Hordeum vulgare L.) за альтернативними біохімічними ознаками. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут клітинної біології та генної інженерії Національної академії наук України, Київ, 2006.

Шляхом елекрофорезу гордеїнів - спирторозчинних запасних білків зерна ячменю - в поліакриламідному гелі з гліцин-ацетатною буферною системою (рН 3,1) ідентифіковано 28, 32 і 4 алельні варіанти цих білків, генетичний контроль яких здійснюють кластерні гордеїнкодуючі локуси Hrd A, Hrd B i Hrd F, відповідно. Виявлено 5 варіантів білків HRD A, та 3 - HRD B, не ідентифікованих раніше при використанні крохмального гелю, а також додаткову мінливість в межах вже відомих блоків. Встановлено зчеплення між проламіновими маркерами (5S) ячменю і двома, із трьох виявлених, поліморфних локусів глютеліну: Hrd A - Hrd B - Glu 1 - Glu 2; Glu 3. Генетичний контроль -амілази здійснюють 12 варіантів у локусі Amy 1 і 4 - Amy 2, контроль -амілази - 3 алелі в локусі Bmy 1. Варіанти в локусах гордеїнів, - і -амілази мають неоднакову частоту зустрічання в культурі ярого ячменю. Дослідження географічного розподілу алелів BMY 1 показало, що на особливості частоти алелів -амілази основний вплив чинять кліматичні характеристики регіону. Загалом, генотипи, що володіють алелем BMY 1Br мають кращі солодові властивості, порівняно до BMY 1Ar, і можуть бути маркерами цих ознак у селекції ярого пивоварного ячменю. Показано можливість спільного використання ізоферментів і RAPD-маркерів для картування геному ячменю: у дві групи зчеплення, з шести встановлених, увійшли локуси ізоферментів Bmy 1 і Est 5.

Ключові слова: ячмінь; білок; ізофермент; гордеїн; амілаза; локус; алель; електрофоретичне розділення; генетичні маркери; пивоварна цінність.

Аннотация

Чапля А.Е. Генетическая дифференциация культурного ячменя (Hordeum vulgare L.) по альтернативным биохимическим признакам. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт клеточной биологии и генной инженерии Национальной академии наук Украины, Киев, 2006.

Методом электрофореза гордеинов - спирторастворимой фракции запасных белков зерна ячменя - в полиакриламидном геле (рН 3,1) идентифицированы 28, 32 и 4 аллельные варианты этих белков, генетический контроль которых осуществляют кластерные гордеинкодирующие локусы Hrd A, Hrd B и Hrd F, соответственно. Обнаружено 5 вариантов белков HRD A, и 3 - HRD B, не идентифицированных ранее с использованием крахмального геля, а также дополнительную изменчивость в пределах уже известных блоков. Показано сцепление между проламиновыми маркерами (5S) ячменя и двумя, из трех обнаруженных, полиморфных локусов глютелина: Hrd A - Hrd B - Glu 1 - Glu 2; Glu 3. Генетический контроль -амилазы осуществляют 12 вариантов в локусе Amy 1 и 4 - Amy 2, контроль -амилазы - 3 аллеля в локусе Bmy 1. Варианты в локусах гордеинов, - и -амилазы имеют различную частоту в культуре ярового ячменя. Исследование географического распределения аллелей BMY 1 показало, что на особенности встречаемости аллелей -амилазы основное влияние оказывают климатические особенности региона. В целом, генотипы, обладающие аллелем BMY 1Br имеют лучшие солодовые свойства, по сравнению с BMY 1Ar, и могут быть маркерами этих признаков в селекции ярового пивоваренного ячменя. Показана возможность совместного использования изоферментов и RAPD-маркеров для картирования генома ячменя: в две группы сцепления, из шести показанных, вошли локусы изоферментов Bmy 1 и Est 5.

Ключевые слова: ячмень; белок; изофермент; гордеин; амилаза; локус; аллель; электрофоретическое разделение; генетические маркеры; пивоваренная ценность.

Abstract

Chaplya A.G. Genetic differentiation of cultural barley (Hordeum vulgare L.) by its alternative biochemical characteristics. - Manuscript.

Thesis for Degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.15 - Genetics. - The Institute of Cell Biol...