Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. В.І. ВЕРНАДСЬКОГО

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

03.00.02 - біофізика

Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях

Виконала Антюфєєва Ольга Іванівна

Симферополь - 2006

АНОТАЦІЯ

біохемілюмінесценція ксенобіотик алергійний шкірний

Антюфєєва О.І. Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадського, Сімферополь, 2006.

Дисертація присвячена одній із важливих проблем сучасної прикладної біофізики (медична і екологічна біофізика) - розробці кількісних і якісних критеріїв в оцінці впливу нових синтезованих токсичних хімічних речовин на живі організми. Уперше за показниками динаміки біохемілюмінесценції (БХЛ) сироватки крові експериментальних тварин при дії ксенобіотиками у дозах ДЛ₁₀₀, ДЛ₅₀, Ѕ ДЛ₅₀, 1/5 ДЛ₅₀, 1/10 ДЛ₅₀ проведені дослідження за визначенням ступеня інтоксикації організму тварин: абсолютно смертельний, дуже важкий, важкий, середній та легкий. Уперше за розробленими, оригінальними, кількісними критеріями параметрів динамічних кривих інтенсивності БХЛ визначений ступінь кумуляції ксенобіотиків. Показано, що при виявленні алергійних, сенсибілізуючих та шкіряно-резорбтивних властивостей ксенобіотиків інтенсивність індукованої та спонтанної БХЛ сироватки крові є чутливим тестом, що реагує не тільки на вид ксенобіотика, але й на дозу та час його дії. Визначено взаємозв'язок між стабільністю водяних розчинів ксенобіотиків та рівнем їх ХЛ. Обґрунтовано застосування біофізичних методів БХЛ, фосфоресценції та мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію в донозологічній оцінці стану здоров'я робітників хімічних підприємств.

Ключові слова: біофізичні методи, біохемілюмінесценція, ксенобіотики, токсичність, гігієнічна регламентація.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сучасному етапі однією із пріоритетних тем, що розроблюються в прикладній біофізиці (медична та екологічна біофізика), є проблема дослідження особливостей і механізмів шкідливої дії на біооб'єкти нових синтезованих хімічних сполук. У повній мірі це стосується поліефірів, які широко використовуються для виготовлення полімерних матеріалів, пластмас, пенопластів, епоксидних смол та ін., що не виключає їх токсичного впливу на водойми, організми тварин і людей (Жуков В.І., Зайцева О.В., 1999; Штабський Б.М., 1999). Одним із головних у системі попереджувальних заходів, спрямованих на виключення шкідливих наслідків хімізації народного господарства, є визначення безпечних рівнів впливу хімічних сполук на біооб'єкти на основі їхньої гігієнічної регламентації та обґрунтування донозологічних критеріїв ранніх виявів біологічної дії хімічних чинників. (Мудрий І.В., 1995; Трахтенберг І.М., 2001). Метод дослідження біохемілюмінесценції (БХЛ) середовищ організму виступає як неспецифічний скринінговий тест, що дозволяє оцінити компенсаторні можливості організму при впливі токсикантів, зокрема, хімічного походження, контролювати стан фізіологічних та метаболічних процесів, виявити показники передхвороби. (Журавлев О.І., 1973; Владимиров Ю.А., Азізова О.А., 1991; Воєйков В.Л., 1998). Вивчення методом БХЛ функціонального стану системи вільнорадикального окислення належить до методів визначення інтегрально-кількісних оцінок токсичної дії на організм людини чинників виробничого середовища та довкілля (Стежка В.А., 1999; Фархутдинов У.Р., 1995; Шакиров Д.Ф., 1999).

У доступній науковій літературі не показані місце та роль біофізичних методів у переліку токсикологічних досліджень хімічних речовин, відсутня система критеріїв для оцінки методів у визначенні біологічних ефектів ксенобіотиків. Немає відомостей про застосування біофізичних методів, зокрема БХЛ, в токсикологічних дослідженнях, для визначення ступеня токсифікації, кумуляції ксенобіотиків, алергійної і шкіряно-резорбтивної дії (ШРД) хімічних речовин. Недостатньо визначена роль біофізичних методів у виявленні тестових показників структурно-метаболічних порушень в організмі людини при дії токсичних хімічних чинників, що використовуються в моніторингу „Навколишнє середовище - здоров'я населення”.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Харківського державного медичного університету в рамках спільного науково-технічного співробітництва Науково-дослідного інституту екології людини і гігієни навколишнього середовища ім. О.М. Сисіна РАМН (Москва, Російська Федерація) і Харківського державного медичного університету за програмою: “Нові хімічні матеріали-020”, затвердженої ДКНТ 30.10.85 р. за № 555, номер держреєстрації - 01890081688, а також за темами науково-дослідницької роботи ХДМУ “Вивчення загальних закономірностей патологічних процесів і розробка засобів їх корекції”, номер держреєстрації - 0103U004546 від 2000 р., “Наукове обґрунтування біохімічної моделі структурно-метаболічних зрушень в організмі внаслідок впливу екологічних чинників як прогностичної основи діагностики донозологічних станів”, номер держреєстрації - 0199U001763 від 2002 р.

Мета і завдання дослідження.

Мета роботи - обґрунтування застосування методу біохемілюмінесценції для оцінки якісних та кількісних параметрів токсикологічних характеристик ксенобіотиків при дослідженні їх дії на організм людини та експериментальних тварин.

Для досягнення цієї мети в роботі вирішувались такі задачі:

Вивчити можливість застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці ступеня важкості токсифікації організмів експериментальних тварин новими синтезованими ксенобіотиками, а також у виявленні органів, систем і функцій організму, що найбільш ушкоджуються при їхній дії.

Визначити зв'язок між параметрами динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції сироватки крові експериментальних тварин і ступенем кумуляції ксенобіотиків.

Обґрунтувати можливість виявлення алергійної та шкіряно-резорбтивної дії (ШРД) ксенобіотиків методом біохемілюмінесценції при експрес-експериментальних токсикологічних дослідженнях.

Оцінити стабільність і швидкість гідролітичного окислення водяних розчинів ксенобіотиків за методом хемілюмінесценції.

Обґрунтувати доцільність застосування біофізичних методів дослідження - біохемілюмінесценції, фосфоресценції та мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію при експрес-аналізі біологічної дії ксенобіотиків на організм робітників хімічних підприємств з метою удосконалення моніторингу “Навколишнє середовище - здоров'я населення” і подальшим виділенням тестових діагностичних показників.

Об'єкт дослідження - біохемілюмінесценція біологічних середовищ, а також водних розчинів токсичних речовин.

Предмет дослідження - обґрунтування застосування методу БХЛ в оцінці впливу токсичних хімічних речовин на організм людини і тварин.

Методи дослідження. В оцінці ступеня важкості токсифікації організму експериментальних тварин, ступеня кумуляції ксенобіотиків, виявленні органів-мішеней використовувався метод БХЛ сироватки крові та гомогенатів внутрішніх органів. Алергійну та шкіряно-резорбтивну дію вивчали, крім методу БХЛ, стандартними алергодіагностичними та біохімічними методами. Визначення стабільності ксенобіотиків у водяних розчинах провадили інтерферометричним та біохемілюмінесцентним методами. При вивченні стану адаптаційних резервів організму під впливом антропогенних хімічних чинників, зокрема малої інтенсивності, використовували методи біохемілюмінесценції, фосфоресценції сечі та мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше визначені ступені токсичності та кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих інтенсивності біохемілюмінесценції з обґрунтуванням прогнозу потенційної небезпеки нових синтезованих хімічних сполук. Розроблена класифікація рівнів важкості токсифікації тварин та виявлені органи-мішені для кожного із досліджуваних ксенобіотиків.

Уперше показано, що інтенсивність індукованої та спонтанної біохемілюмінесценції сироватки крові є більш чутливим тестом в порівнянні з біохімічними методами при виявленні алергійних і шкіряно-резорбтивних властивостей ксенобіотиків.

Уперше виявлено кореляційний зв'язок між рівнем інтенсивності хемілюмінесценції водяних розчинів ксенобіотиків та їх стабільністю.

Набуло подальшого розвитку застосування біофізичних методів в оцінці донозологічного стану здоров'я робітників хімічних виробництв досліджуваних ксенобіотиків із метою удосконалення моніторингу „Навколишнє середовище - здоров'я населення”.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати розширюють уявлення про використання методу біохемілюмінесценції в оцінці впливу та механізму дії токсичних хімічних речовин на організми експериментальних тварин та робітників хімічних виробництв. Результати роботи покладені в основу розробки та обґрунтування державних стандартів нешкідливих рівнів 3 нових ксенобіотиків (макроциклічний ефір - 12 краун-4; неонол- АФ 9-12; простий поліефір - Л-402-2-100) у воді водойм господарсько-питного й культурно-побутового призначення (СанПіН №4630-88; Государственные нормативы ГН 2.1.5.689-98; Постанова № 21 від 2003 р. СЕС України), що використовуються в поточному й попереджувальному санітарному нагляді за станом водяних об'єктів. Методичні прийоми, що розроблені дисертантом, захищені 2 Деклараційними патентами України на винахід. Теоретичні положення та практичні рекомендації, які одержані за результатами досліджень, упроваджені в практику навчання студентів на кафедрах біохімії, екології та гігієни, біологічної і медичної фізики Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно виконані експериментальна частина досліджень, розрахунки та побудова усіх графіків динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції, вперше запропоновані критерії динамічних кривих БХЛ, зроблені аналіз літератури і статистична обробка отриманих результатів. Вибір теми, обґрунтування мети, завдань, програми дослідження, аналіз одержаних результатів і формулювання висновків проведені за участю наукового керівника. Автор брав особисту участь у написанні праць за темою дисертації, три роботи написані особисто автором. Біохімічні дослідження проводились разом з к.б.н., с.н.с. Центральної науково-дослідної лабораторії Харківського державного медичного університету Г.О. Логіновою. Дослідження особливостей біологічної дії ксенобіотиків на організм робітників хімічних виробництв проводили разом з к.б.н., завідувачем ЦНДЛ ХДМУ М.Г. Щербанем. Дослідження на людях (забір біологічного матеріалу - сечі, клітин букального епітелію) проводилися відповідно до Гельсінської декларації з прав людини від 1975 р. з доповненнями Конвенції Ради Європи „Про права людини у біомедицині” (1996 р.) і вимог комітету з біоетики при НАН та АМН України. Експериментальні дослідження на тваринах виконувалися відповідно до „Міжнародних рекомендацій проведення біомедичних досліджень із використанням тварин” (1985 р.), національних „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001 р.). Особистий внесок здобувача у всіх експериментах і дослідженнях становить понад 80 %.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені й обговорені на VIII; IX; X; XI, XII й XIII Міжнародній науково-технічній конференції “Екологія і здоров'я людини” (АР Крим, 2000 - 2005 р.р.); 1-му Євразійському конгресі медичних фізиків, (Москва, РФ, 2001 р.); IV, V та VI Міжнародній міждисциплінарній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми науки та освіти” (АР Крим, Ялта, 2003 р.; Алушта, 2004; 2005 р.р.).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовується актуальність теми дослідження, сформульовані мета й задачі досліджень, наведені наукова новизна та практична цінність отриманих результатів. Відзначається особистий внесок здобувача. Вказується, на яких конференціях апробовані результати досліджень і кількість опублікованих робіт із теми дисертації.

У першому розділі представлений короткий аналіз сучасних літературних даних про токсичний вплив ксенобіотиків на функціональний стан системи вільнорадикального окислення (ВРО) біологічних об'єктів. Розглянуто застосування БХЛ методів в оцінці функціонального стану системи ВРО організму експериментальних тварин і людини при патологічних станах.

У другому розділі наведені матеріали та методи досліджень. Як об'єкти впливу на живий організм були використані синтезовані хімічні речовини: макроциклічний ефір - 12 краун-4; неонол- АФ 9-12; метилцелозольв (МЦ); макроциклічні поліефіри - Лд-303, 503, 703; прості поліефіри - Л-402-2-100, Л-1505, надані НВО “СинтезПАВ”, які знайшли широке застосування в хімічній промисловості. Експериментальні дослідження виконані на 1520 тваринах: 1280 білих щурів популяції Вістар з початковою масою тіла 0,18 - 0,21 кг; 132 білі миші масою 0,021 - 0,023 кг; 108 морських свинок масою 0,35 - 0,38 кг.

Гігієнічні та біохімічні методи досліджень обрані відповідно до нормативних документів і рекомендацій з використання розрахункових й експериментальних методів при гігієнічному нормуванні хімічних сполук у воді водних об'єктів. При оцінці ступеня важкості токсифікації організму експериментальних тварин досліджуваними ксенобіотиками в дозах ДЛ₁₀₀, ДЛ₅₀, Ѕ ДЛ₅₀, а також у виявленні органів, систем і функцій організму, що найбільш ушкоджуються при їхній дії, застосовували метод БХЛ. Хемілюмінограми сироватки крові експериментальних тварин реєстрували на хемілюмінометрі ХЛМ1Ц-01. Для одержання посиленої БХЛ використовували 0,5 мл сироватки крові, 1,5 мл фізіологічного розчину, 50 мкл люміналу, 50 мкл 0,5% розчину Н₂О₂. Для визначення взаємозв'язку між ступенем кумуляції ксенобіотиків та параметрами динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції будували динамічні криві інтенсивності БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих дозами 1/5 і 1/10 ДЛ₅₀. Дослідження ЩРД ксенобіотиків проводили БХЛ і біохімічними методами. Для виявлення алергійної дії ксенобіотиків досліджували зв'язок між інтенсивністю БХЛ сироватки крові експериментальних тварин та показниками імунологічних тестів: реакції специфічної агломерації лейкоцитів (РСАЛ), реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ), реакції специфічного ушкодження базофілів (РСУБ) (Алексєєва О.Г., Дуєва Л.А., 1978). При дослідженні кореляційного зв'язку між інтенсивністю БХЛ водяних розчинів ксенобіотиків і їх стабільністю застосовували прямий інтерферометричний метод за допомогою інтерферометра ІТР-1 та непрямий метод (Гаршенін Є.Ф., 1968). Натурні дослідження дії ксенобіотиків на організм робітників хімічних виробництв проводили на об'єднаннях НВО “СинтезПАВ” (м. Шебекіно, Бєлгородська обл., Російська Федерація), ВО “Хімпром” (м. Первомайськ, Харківська обл., Україна), всього обстежено 296 робітників. Використовували методи біохемілюмінесценції та фосфоресценції (за допомогою фосфороскопа ФС-1) сечі робітників (Жуков В.І., Зайцева О.В., 1999). Для визначення токсичної дії ксенобіотиків на біологічний вік працівників хімічних виробництв використовувався цитобіофізичний метод внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію людини (Шахбазов В.Г., 1996).

Статистична обробка результатів проведена за допомогою професійного пакету статистичного аналізу даних “STATISTICA 6,0 for Windows” з проведенням процедур кореляційного та регресійного аналізу. Вірогідність розходжень оцінювали за критерієм Ст'юдента при рівні значущості р < 0,05.

У третьому розділі наведені результати особистих експериментальних досліджень.

Ступінь інтоксикації лабораторних тварин оцінювали за показниками динаміки інтенсивності БХЛ. Виявлено чітку залежність параметрів динамічних кривих інтенсивності БХЛ від ступеня токсичності ксенобіотиків. Динамічні криві, побудовані для кожного виду ксенобіотика, являють собою часову залежність інтенсивності БХЛ I (імп/с) сироватки крові експериментальних тварин, токсифікованих різними дозами ксенобіотиків (ДЛ₁₀₀, ДЛ₅₀, Ѕ ДЛ₅₀, 1/5 ДЛ₅₀, 1/10 ДЛ₅₀), впродовж середньо-ефективного часу загибелі тварин ЕТ₅₀ (рис. 1). Після токсифікації краун-ефіром 12 краун-4 інтенсивність світіння ХЛ реєстрували через 12; 24; 36; 48; 60 хвилин; неонолом АФ 9-12 - через 1; 3; 6; 9; 12 годин; метилцелозольвом (МЦ) - через 1,5; 3; 6; 9; 12; 15 годин; простим поліефіром Л-402 - через 5, 10, 15, 20, 25 годин.

Рис. 1. Динаміка інтенсивності біохемілюмінесценції сироватки крові білих щурів при одноразовому введенні різних доз простого поліефіру Л-402

Уперше для визначення ступеня інтоксикації експериментальних тварин досліджені закономірності динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції, її особливості залежно від виду ксенобіотиків та їхньої дози впливу. При цьому нами введені наступні параметри: І_еф - величина інтенсивності біохемілюмінесценції наприкінці середньо-ефективного часу загибелі тварин (ЕТ₅₀); t_m - час досягнення максимальної інтенсивності світіння; tg , tg * - тангенси кутів нахилу висхідних і спадних ділянок динамічних кривих до вісі часу; t_к. - час досягнення контрольних значень інтенсивності; S_к - світлосума світіння за час t_к.; к - коефіцієнт токсичності, що визначається для кожного із ксенобіотиків за формулою

к = t_к / t_m²,

де t_m й t_к - відповідно час досягнення максимального й контрольного значень інтенсивності біохемілюмінесценції. Причому, варто звернути особливу увагу на той факт, що при впливі певних доз досліджуваних ксенобіотиків, інтенсивність І_еф мала приблизно одне й теж значення для всіх ксенобіотиків, що дозволяє виділити цей параметр як критеріально значущий, за яким ми й визначали ступінь інтоксикації: 1) абсолютно смертельний (при одержанні дози ДЛ₁₀₀) інтенсивність (І_еф) БХЛ фоновим значенням інтенсивності (50100 імп/с); 2) дуже важкий (при одержанні дози ДЛ₅₀) - інтенсивність світіння (І_еф 300 імп/с) приблизно в 2 рази менше інтенсивності світіння контрольної групи тварин (І_к); 3) важкий (при одержанні дози Ѕ ДЛ₅₀) інтенсивність світіння (І_еф 600 імп/с) приблизно дорівнює інтенсивності світіння І_к; 4) середній (при одержанні дози 1/5 ДЛ₅₀) - інтенсивність світіння (І_еф 900 імп/с) більше інтенсивності І_к приблизно в 1,5 рази; 5) легкий ступінь (при одержанні дози 1/10 ДЛ₅₀) - інтенсивність світіння (І_еф 1500 імп/с) більше І_к приблизно в 2,3 рази. Встановлено, що існує чітка залежність параметрів динамічних кривих від дози, тобто при збільшенні дози кожного із ксенобіотиків збільшується величина tg * і зменшуються величини І_еф, t_к, к й S_к.

Якщо розташувати ксенобіотики в ряд за мірою збільшення їхньої токсичності: Л-402; МЦ; АФ9-12; 12-краун-4, то t_m, ЕТ₅₀, t_к й S_к за час t_к мають тенденцію зменшуватися, а tg , tg * і коефіцієнти токсичності к - збільшуватися.

Показано, що введений нами коефіцієнт токсичності к є дозозалежним. При цьому залежність дози кожного ксенобітика від коефіцієнта токсичності описується лінійним регресійним рівнянням: D = a_i - b_i к, де a_i й b_i - константи, величини яких залежать від виду хімічної речовини, причому величина а_i для кожної речовини приблизно відповідає подвоєному значенню ДЛ₁₀₀, b_i = ДЛ₁₀₀/ к. З рис. 2 видно, що кожний ксенобіотик характеризується своїми величинами швидкості наростання й спаду висхідної та спадної ділянок кінетичних кривих, тобто різними величинами тангенсів кутів нахилу (tg б ) і (tg б*); різним часом, через який спостерігається максимальне значення інтенсивності (t_m); різним часом виходу кривих на контрольні значення ( t_к ); різними світлосумами світіння до виходу на контроль (S_к).

Рис. 2. Динаміка інтенсивності біохемілюмінесценції (I, імп/с) сироватки крові білих мишей з часом під дією різних ксенобіотиків із дозою ДЛ₁₀₀. (tg , tg * - тангенси кутів нахилу висхідних і спадних ділянок динамічних кривих до вісі часу)

При обґрунтуванні органів-мішеней показано, що поряд з гістологічними дослідженнями метод біохемілюмінесценції виявляє органи, системи й функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації організму. Так, усі випробувані ксенобіотики найбільше підвищували інтенсивність БХЛ гомогенатів нирок, печінки й серця. При цьому їхня інтенсивність ХЛ збільшувалася в середньому в 1,5 рази в порівнянні з контрольними величинами. Результати досліджень показали, що для кожного органа характерна висока субстратна специфічність хемілюмінограми. Установлені також особливості дії кожного ксенобіотика, що виражалося в зміні інтенсивності БХЛ гомогенатів різних внутрішніх органів і тканин піддослідних тварин: лапроксид Лд-703 у порівнянні з іншими сполуками істотно підвищував інтенсивність гомогенатів селезінки, тимуса й лімфатичних вузлів (в 1,8 рази); метилцелозольв - головного мозку (в 1,6 рази); макроциклічний ефір 12 краун-4 - наднирників (в 1,7 рази) і головного мозку (в 1,6 рази).

Визначення ступеня кумуляції досліджуваних хімічних речовин провадилося за параметрами динамічних кривих біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин, токсифікованих дозами 1/5 ДЛ₅₀ й 1/10 ДЛ₅₀ у підгострому досліді. Здійснювалося виявлення й формалізація двох систем залежностей: доза - ефект і час впливу - ефект. На рис.3, як приклад, наведена динамічна крива, що отримана для ксенобіотика 12-краун-4. Для інших досліджуваних ксенобіотиків були побудовані динамічні криві, яки мали аналогічний вигляд, але специфічні особливості. Виявлено, що динамічні криві біохемілюмінесценції характеризуються послідовними трьома фазами: 1) різке наростання світіння до максимальних значень за час t_m (від 0 до t_m); 2) різкий спад інтенсивності біохемілюмінесценції впродовж часу t_с (від t_m до t_с), причому, t_m+t_с відповідає середньому ефективному часу загибелі тварин (ЕТ₅₀); 3) повільне зменшення інтенсивності до значень інтенсивності світіння в контрольній групі протягом часу t_к^*.

Рис. 3. Динаміка інтенсивності біохемілюмінесценції сироватки крові білих щурів при дії 12-краун-4 дозою 1/5 ДЛ₅₀

Часовий інтервал від початку спостереження до досягнення контрольних значень інтенсивності характеризується часом t_к = t_m + t_с + t_к^*. Установлено, що при впливі ксенобіотиками, які мають слабкі кумулятивні властивості, подовжуються часи фаз швидкого наростання (t_m) і швидкого спаду (t_с) інтенсивності світіння; збільшуються величини tg в спадної ділянки на динамічній кривій і світлосума (S) світіння за одну добу; скорочується час (t_к^*) фази повільного зниження інтенсивності біохемілюмінесценції до контрольних значень у порівнянні з надзвичайно кумулятивними ксенобітиками (табл. 1).

Таблиця 1. Параметри динамічних кривих біохемілюмінесценції сироватки крові білих щурів при дії ксенобіотиків дозою 1/5 ДЛ₅₀

Вище зазначені параметри динамічних кривих дозволяють судити про ступінь кумуляції ксенобіотиків (табл.2).

Таблиця 2. Визначення ступеня кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих

Оцінюючи динаміку інтенсивності світіння при дозі 1/5 ДЛ₅₀, можна припустити, що час t_m досягнення максимуму біохемілюмінесценції пов'язаний із часом стрес-реакції організму на токсифікацію, яка супроводжується напругою захисно-компенсаторних механізмів, ушкодженням частини структурно-функціональних одиниць клітинного апарата та виходом антиокислювачів у кров'яне русло. Наслідком цього є наступне різке падіння рівнів БХЛ протягом часу аж до ЕТ₅₀. Надалі в організмі, ймовірно, встановлюється стійке співвідношення оксидантно-антиоксидантної взаємодії, відображенням якого виступає наближення значень інтенсивності БХЛ до величин контрольної групи. Уведені нами кількісні показники фаз швидкого підйому, швидкого зниження біохемілюмінесценції, а також повільного зниження інтенсивності світіння до рівня контрольних величин можуть указувати, з одного боку, на різну швидкість надходження речовин у клітину через плазматичні мембрани, а з іншого боку - на насичення клітини ксенобіотиком, що активує оксидантно-антиоксидантні взаємодії на молекулярному рівні. Характер динаміки кривих біохемілюмінесценції під впливом 1/5 ДЛ₅₀ й 1/10 ДЛ₅₀ підтверджує істотні розходження токсикодинаміки, токсикокінетики та відповідно структурно-метаболічних процесів, що відбуваються в умовах токсифікації організму різними дозами ксенобіотиків.

Алергійна дія хімічних речовин була виявлена за імунологічними тестами (РСЛЛ, РСАЛ, РСУБ) і методом біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин. Установлено, що внутрішньо-шкіряна дія хімічних речовин, які мають різний ступінь алергійної дії, приводить до різного посилення інтенсивності світіння хемілюмінесценції сироватки крові, що може бути пов'язано з порушенням вільнорадикальних процесів, накопиченням в організмі продуктів перекисного окислення ліпідів, тобто появою вільнорадикальної патології. Так, ксенобіотики, що не мають алергійної дії (Л-402), не викликають достовірного підвищення індукованої БХЛ, тоді як алергійно небезпечний Лд -703, що підвищує імунологічні показники в 6-7 разів, приводить до збільшення інтенсивності БХЛ в 2,2 рази в порівнянні з контролем. Показано, що для виявлення сенсибілізуючих й алергійних властивостей хімічних речовин окрім індукованої БХЛ можна використовувати також і метод спонтанної БХЛ сироватки крові тварин. Установлено, що при імунологічному тестуванні в підгострому досліді сильні алергени лапроксиди (Лд-703, Лд-503, Лд-303) при введенні внутрішньо-шлунково в дозах 0,01 й 0,001 ДЛ₅₀ протягом 60 діб приводять до зміни імунобіологічної реактивності організму: імунологічні показники РСАЛ, РСЛЛ, РСУБ істотно підвищувалися в порівнянні з контролем, а доза 0,0001 ДЛ₅₀ була недіючою. Інтенсивність БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих дозами 0,01 ДЛ₅₀, 0,001 ДЛ₅₀ і навіть 0,0001 ДЛ₅₀, зростала в середньому більше, ніж в 2,0 рази порівняно з контролем. Це дозволяє вважати дозу 0,0001 ДЛ₅₀, визначену за методом БХЛ, діючою. Імунологічне тестування простих поліефірів (Л-402, Л-1502) не виявило їхньої алергенної дії. Однак інтенсивність БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих цими речовинами в дозі 0,01 ДЛ₅₀ й 0,001 ДЛ₅₀, збільшувалася в порівнянні з контролем у середньому, відповідно, в 1,7 і в 1,6 рази, що підтверджує високу чутливість даного біофізичного методу та дозволяє використовувати його з метою встановлення порогів алергійної дії та виявлення ефекту сенсибілізації організму.

У дослідженнях шкіряно-резорбтивної дії ксенобіотиків при нашкірних аплікаціях біохімічними методами й методом БХЛ показано, що метод БХЛ виявляє ефект шкіряно-резорбтиної дії досліджуваних речовин вже на 10 добу, у той час як біохімічні тести виявили симптоми інтоксикації тільки на 30 добу, що вказує на більш високу чутливість даного методу в порівнянні з біохімічними. При цьому аналіз біохімічних показників крові експериментальних тварин свідчить про зниження рівнів вмісту гемоглобіну, еритроцитів і кількості SH-груп, тобто про наростання патологічного процесу й інгібірування антиоксидантної системи. І навпаки, одержане підвищення активності каталази, церулоплазміну й холінестерази, певно, обумовлено активацією ферментативної системи організму у відповідь на токсичний вплив ксенобіотиків. Доведено, що зміни у вільнорадикальному окисленні, які спостерігаються за методом БХЛ, передують функціональним зрушенням показників периферичної крові й ферментативних систем.

При вивченні стабільності ксенобіотиків (відсоткового вмісту ксенобіотиків у водяних розчинах) визначено зв'язок між рівнем стабільності, швидкістю гідролітичного окислення ксенобіотиків і параметрами їхньої токсичності (ДЛ₅₀), а також значеннями інтенсивності хемілюмінесценції (ХЛ) їхніх водяних розчинів. Показано, що між дозою ДЛ₅₀ (D, г/кг) й інтенсивністю світіння (I, імп/с) розчинів ксенобіотиків існує тісний кореляційний зв'язок (коефіцієнт кореляції Спірмена R = - 0,999), рівняння регресії для індукованої ХЛ має вигляд D = 88,8·exp(-0,01·I). При зменшенні ДЛ₅₀, що означає збільшення ступеня токсичності ксенобіотиків, інтенсивність БХЛ їхніх водяних розчинів зростає. Результати дослідження зв'язку між параметром токсичності ДЛ₅₀ і ступенем стабільності хімічних речовин показують, що стабільність ксенобіотиків збільшується при зменшенні їхньої токсичності, тобто при збільшенні ДЛ₅₀ (рис. 4.а). Виявлена тісна кореляційна залежність із коефіцієнтом кореляції R = 0,998 між стабільністю й величиною дози ДЛ₅₀.

Рис. 4. Залежність стабільності водяних розчинів ксенобіотиків (%) від величини дози ДЛ₅₀

Причому, ступінь стабільності має логарифмічну залежність від величини дози ДЛ₅₀: S = 87 + 7lg(D), де S - стабільність речовини у водяному розчині (%), D - величина ДЛ₅₀ (г/кг). За допомогою лінійного регресійного аналізу визначені коефіцієнти кореляції R_с та R_і між рівнем інтенсивності спонтанної (I_с) та індукованої- Н₂О₂ (I_і) ХЛ водяних розчинів всієї групи ксенобіотиків і ступенем їхньої стабільності (S): R_с = - 0,999; R_і= - 0,998. Відповідно, рівняння регресії представлені лінійною залежністю виду: I_с = 1858 - 19S; I_і = 3425 - 34S. Графіки залежностей значень інтенсивності (імп/с) спонтанної та індукованої- Н₂О₂ хемілюмінесценції від ступеня стабільності водяних розчинів ксенобіотиків (%) представлені на рис.4.б.

Таким чином, установлено, що за рівнями інтенсивностей спонтанної та індукованої хемілюмінесценції тієї або іншої речовини можна визначити ступінь їх гідролітичної стабільності, тобто отримані значення інтенсивності хемілюмінесценції виступають як прогностичні критерії стабільності ксенобіотиків до гідролітичного окислення. Відповідно, пропонується використовувати метод хемілюмінесценції при орієнтовній оцінці ступеня токсичності, небезпеці й стабільності ксенобіотиків у токсикологічних дослідженнях.

Обґрунтовано використання методів біохемілюмінесценції, фосфоресценції та мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію в оцінці стану здоров'я робітників хімічних виробництв як найбільш чутливих методів у токсиколого-гігієнічних дослідженнях впливу на організм чинників виробничого середовища. При вивченні люмінол-індукованої хемілюмінесценції та фосфоресценції сечі робітників різних вікових груп було виявлено, що у людей, які в процесі професійної діяльності знаходились під впливом несприятливих факторів виробничого середовища, інтенсивність світіння сечі робітників-апаратників у середньому перевищувала показники контрольної групи в 1,3 рази (на 300 імп/с) (рис. 5).

Рис. 5. Діаграми інтенсивностей хемілюмінесценції сечі робітників виробництва простих поліефірів різних професійних груп і вікових категорій. Примітка: * - різниця з контролем достовірна, р 0,01

Це може бути пов'язано з посиленням обмінних процесів, вільнорадикального перекисного окислення ліпідів, зменшенням активності антиоксидантної системи. Рівні інтенсивності фосфоресценції сечі робітників-апаратників всіх вікових груп у середньому в 1,72 рази були вище в порівнянні з контролем, що, очевидно, обумовлено збільшенням у сечі концентрації ліпідів і білків, відповідальних за фосфоресценцію.

Аналіз результатів дозволяє зробити висновок, що існуючі умови виробництва досліджуваних ксенобіотиків стимулюють процеси вільнорадикального перекисного окислеання ліпідів і призводять до зниження імунобіологічної реактивності організму. Проведені експерименти з мікроелектрофорезу ядер клітин букального епітелію виявили зниження в порівнянні з контролем електронегативності ядер (ЕНЯ) клітин букального епітелію у робітників наступних професійних груп: апаратники синтезу, окислення, гідратації (рис. 6).

Рис. 6. Показник електронегативності (%) ядер клітин букального епітелію у робітників виробництва простих поліефірів різних вікових категорій.

У середньому по контингенту апаратників, у порівнянні з контрольною групою ІТР, зниження ЕНЯ склало у вікових категоріях 21-30 років - 13,5%, 31-40 років - 10,3%, 41-50 років - 22,3%, 51-60 років - 21,4%. Проведено порівняння фактичного віку обстежених з їх біологічним віком, який визначався за еталонною номограмою показників ЕНЯ. Виявлено, що біологічний вік апаратників у віковій групі 21-30 років перевищує паспортний у середньому на 3,0 роки; у групі 31-40 років - відповідно на 4,5 роки; у групі 41-50 років - на 5,8 роки й у групі 51-60 років - на 6,9 роки. Таким чином, виділені показники (інтенсивність БХЛ та ЕНЯ), які відображають напруженість механізмів забезпечення гомеостазу, можуть виступати як моніторингові при оцінці шкідливого впливу чинників виробничого середовища на організм робітників.

ВИСНОВКИ

1. Науково обґрунтована доцільність застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці токсичної дії нових ксенобіотиків на організми людини та експериментальних тварин. Показано, що метод біохемілюмінесценції дозволяє адекватно оцінити кумулятивні та алергійні властивості, ступінь токсичності, граничні та недіючі дози ксенобіотиків; порушення взаємодії антиоксидантної та оксидантної систем; ступінь окислення хімічних речовин та їх гідролітичну стабільність у воді водяних об'єктів, а також виявити органи, системи і функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації ксенобітиками.

2. Запропоновано новий кількісний підхід до аналізу та обробки експериментальних даних, отриманих за показниками спектрів біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин. Встановлено, що цей метод дозволяє диференціювати ступені важкості інтоксикації ксенобіотиками організму експериментальних тварин за параметрами динаміки інтенсивності світіння. Розроблена класифікація рівнів важкості токсифікації тварин (абсолютно смертельний, дуже важкий, важкий, середній і легкий) за величиною інтенсивності світіння наприкінці середньо-ефективного часу ЕТ₅₀ загибелі тварин. Показано чітку залежність параметрів динамічних кривих біохемілюмінесценції від ступеня токсичності ксенобіотиків. При збільшенні дози кожної з речовин збільшується tg * спадаючих ділянок динамічних кривих біохемілюмінесценції, зменшуються час досягнення контрольних значень інтенсивності (t_к), коефіцієнт токсичності (к) і світлосума світіння (S_к) за час t_к.

3. Встановлено, що використання методу біохемілюмінесценції дозволяє виявити органі-мішені для кожного досліджуваного ксенобіотика, які мають характерні тільки для них хемілюмінограми. Найбільшу інтенсивність світіння при запалі тварин 12 краун-4 мають гомогенати головного мозку; неонолом АФ 9-12 - гомогенати печінки й нирок; під впливом лапроксидів Лд-703 і Лд-503 - гомогенати селезінки, тимусу, лімфатичних вузлів. Ці дані були підтверджені й результатами морфологічних досліджень.

4. Уперше запропоновані нові якісні та кількісні параметри динамічних кривих інтенсивності біохемілюмінесценції, які дозволяють виявити ступені кумуляції ксенобіотиків. Розроблена класифікація ступенів кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих (tgв, t_m+t_c, t_m), зокрема, таким, як час досягнення інтенсивності світіння сироватки крові токсифікованих тварин контрольних значень (t_к).

5. Експериментально встановлено, що інтенсивність біохемілюмінесценції виступає як оціночний показник алергійної та шкіряно-резорбтивної дії ксенобіотиків при пероральній та нашкірній пробах. Показано, що метод БХЛ у порівнянні з імунологічними тестами (РСЛЛ, РСАЛ, РСУБ) має значно більшу чутливість виявлення впливу хімічних алергенів, ефектів сенсибілізації й установлення граничних доз у підгострих і хронічних експериментах, а також при оцінці ефекту проникнення речовин через неушкоджену шкіру.

6. Встановлено кореляційний зв'язок між інтенсивністю хемілюмінесценції, водяних розчинів ксенобіотиків та їхньою стабільністю з коефіцієнтом кореляції R_i = - 0,998. Розчини ксенобіотиків, які мають низькі рівні інтенсивності спонтанної й індукованої Н₂О₂ -ХЛ, є високо стабільними. Знайдено, що ступінь стабільності має логарифмічну залежність від величини дози ДЛ₅₀. Значення інтенсивності індукованої та спонтанної хемілюмінесценції водяних розчинів ксенобіотиків є прогностичним критерієм оцінки стабільності ксенобіотиків до гідролітичного окислення та біологічної активності хімічних речовин.

7. Показано, що використані в роботі показники біохемілюмінесценції, фосфоресценції та електрокінетичних властивостей ядер клітин букального епітелію дозволяють дати комплексну оцінку впливу чинників виробничого середовища на організм робітників, виділити групи та фактори ризику, виступати як моніторингові.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов: Монография / Жуков В.И., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.И., Антюфеева О.И. и др. - Х.: Торнадо, 2000. - 438 с. (Особистий внесок здобувача - проведення БХЛ досліджень при оцінці стану антиоксидантної системи, дії простих і макроциклічних ефірів на організм тварин, стану ВРО робочих хімічних виробництв; розділи 5, 7).

Зайцева О.В., Антюфеева О.И. Биохемилюминесценция в контроле кожно-резорбтивного действия новых групп поверхностно-активных веществ // Вісник проблем біології і медицини. - 2001. - Вып.1. - С. 104-109.

Рогозянская Л.М., Арсеньев А.В., Антюфеева О.И. Деякі методичні аспекти статистичної обробки медичної інформації у сучасних умовах // Експериментальна і клінічна медицина. - 2000. - № 4. - С. 133-135. (Особистий внесок здобувача полягає в обґрунтуванні обчислювальних програм з використанням сучасних статистичних пакетів, зокрема, регресійного аналізу).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Антюфеева О.И., Щербань Н.Г., Нежина М.В. Прогнозирование безвредных уровней содержания новой группы поверхностно-активных веществ на основе алкилполифосфатов в воде водоемов // Довкілля та здоров'я. - 2002. - № 3 (22). - С. 30-33. (Особистий внесок здобувача складається з визначення стабільності водних розчинів ксенобіотиків).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Антюфеева О.И. Гигиеническая оценка иммунотоксичности и аллергоопасности группы эпоксидсодержащих гликолей в связи с проблемой их нормирования в водных экосистемах // Проблеми екології та медицини. - 2002. - Т. 6, № 5. - С. 3-7. (Особистий внесок здобувача - участь в обробці експериментальних даних та встановленні недіючої дози лапроксидів).

Антюфеева О.И. Эколого-гигиеническая регламентация некоторых простых полиэфиров в воде водоемов // Проблеми екології та медицини. - 2003.-Т.7, № 3-4. - С. 3-5.

Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. Щербань Н.Г. Определение степени интоксикации экспериментальных животных по показателям динамики биохемилюминесценции // Проблеми екології та медицини. - 2004. - Т. 8, № 5-6. - С. 24-28. (Особистий внесок здобувача - безпосереднє виконання частини експериментальних досліджень, розрахунки та побудова всіх графіків динамічних кривих БХЛ, участь в обговоренні результатів та висновків експерименту).

Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И. Связь параметров динамики биохемилюминесценции со степенью кумуляции ксенобиотиков // Експериментальна і клінічна медицина - 2005. - № 2 - С.51-56. (Особистий внесок здобувача складається із безпосереднього виконання частини експериментальних досліджень, розрахунків та побудови всіх графіків динаміки БХЛ, обговорення результатів та визначення висновків експерименту).

Антюфеева О.И. Влияние вредных факторов производства тормозных и гидравлических жидкостей на биологический возраст рабочих // Гигиена населенных мест: Сб. научн. тр. - К.: Полимед, 2001. - Вып. 38, Т.2.--- С. 458-460.

Зайцева О.В., Жуков В.И., Щербань Н.Г, Антюфеева О.И. Экспериментальное исследование по гигиенической регламентации в воде водоемов органических смесей на основе гликолей // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2002. - Вип. 40. - С. 82-86. (Особистий внесок здобувача складається з проведення біохемілюмінесцентних досліджень при регламентації ксенобіотиків).

Зайцева О.В., Щербань Н.Г, Жуков В.И., Антюфеева О.И. Гигиеническая и токсикологическая характеристика группы олигоэфиров на основе двухатомных спиртов в связи с санитарной охраной водоемов // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2002. - Вип. 39. - С. 97-101. (Особистий внесок здобувача полягає у здійсненні експериментів по визначенню стабільності ксенобіотиків у воді та їх шкіряно-резорбтивної дії методом БХЛ)

Зайцева О.В., Жуков В.І., Антюфєєва О. І. Хемілюмінесцентні методи в донозологічній оцінці стану здоров'я робітників хімічного виробництва // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2003. - Вип. 41. - С. 180-184. (Особистий внесок здобувача полягає в обробці результатів досліджень, виконанні розрахунково-графічної роботи, аналізі результатів та висновків).

Зайцева О.В., Жуков В.І., Антюфєєва О. І., Брянцев О.М. Дослідження електрокінетичних властивостей ядер клітин буккального епітелію робітників хімічного виробництва // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2003. - Вип. 42. -С.170 - 172. (Особистий внесок здобувача - проведення експерименту, обробка результатів досліджень та виконування розрахунково-графічних робіт).

Пат. ua № 9990 України, МКИ G01N33/00. Спосіб визначення ступеня інтоксикації ксенобіотиками / Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. - № u200504362; Заявл. 10.05.05; Опубл. 17.10. 05, Бюл. № 10. -3 с. (Особистий внесок здобувача полягає в виконанні частини експериментальних досліджень, участі в аналізі результатів та висновків експерименту).

Пат. ua № 9989 України, МКИ G01N33/00. Спосіб визначення ступеня кумуляції чужорідних хімічних сполук в організмі / Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. - № u200504359; Заявл. 10.05.05; Опубл. 17.10. 05, Бюл. № 10. - 4 с. (Особистий внесок здобувача є виконання частини експериментальних досліджень, розрахунки та побудова всіх графіків динаміки БХЛ, участь в обговоренні результатів та висновків експерименту).

Антюфеева О.И. Оценка состояния здоровья рабочих химического производства с помощью хемилюминесцентных методов // Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов: Сб. научн. тр. IX (ежегодной) международной научно-технической конференции (9-13 июня 2001 г.). - Щелкино - Харьков: УкрВОДГЕО, 2001. - С.193-195.

Антюфеева О.И., Зайцева О.В. Изучение степени токсичности и опасности некоторых видов поверхностно-активных веществ в воде водоемов // Сучасні проблеми науки та освіти: Матеріали 4-ї Міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції (1-10 травня 2003 р.) - Ялта -Харків: Українська Асоціація „Жінки в науці та освіті”, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, 2003. - С.50.

18. Жуков В.І., Зайцева О.В., Антюфєєва О.І., Бондаренко М.А., Арсен'єв О.В., Московець М.А. Параметри динаміки біохемілюмінесценції як критерій ступеню кумуляції ксенобіотиків // Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов: Сб. научн. тр XIІІ. международной научно-технической конференции (9-13 июня 2003 г.), г. Алушта - Харьков: УкрВОДГЕО, 2005.- С. 370-375.

19. Зайцева О.В., Антюфєєва О.І., Бондаренко М.А., Рісованна Л.М., Проценко О.В. Оцінка ступеня інтоксикації експериментальних тварин по спектрах біохемілюмінесценції // Сучасні проблеми науки та освіти: Матеріали 6-ї Міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції. (1-10 травня 2005 р.). - Алушта-Харків: Українська Асоціація „Жінки в науці та освіті”, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна - 2005. - С.86.

Размещено на Allbest.ru