Производство инсулина, соматотропина и интерферонов

Всем широко и печально известна такая болезнь, как сахарный диабет, когда организм человека утрачивает способность вырабатывать физиологически важный гормон инсулин. В результате в крови накапливается сахар и больной может погибнуть. Инсулин вырабатывается бета - клетками островков Лангерганса поджелудочной железы.[9] Попытки извлечь его из поджелудочной железы долгое время оставались тщетными, так как этот гормон является полипептидом и разрушается трипсином, содержащимся в ткани вырезанной из организма поджелудочной железы.

Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. Результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.[12]

Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Так, в 1979 году из 6 млн. больных во всем мире только 4 млн. получали инсулин. Без лечения инсулином больные умирали. А если учесть, что среди больных диабетом немало детей, становится понятным, что для многих стран это заболевание превращается в национальную трагедию. Более того, многолетнее применение животного инсулина приводило к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина.

В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки (E. coli).

Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, в результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.

Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный (природный) двухцепочечный инсулин. Одним из методов получения генно-инженерного инсулина является раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Другой метод получения инсулина - синтез проинсулина в клетках E.Coli, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили трипсином и карбоксипептидазой и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

В Институте РАН получен рекомбинантный (полученный с помощью генной инженерии) инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо - отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография), получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду (небольш. молекулы ДНК) нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.

Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

инсулин соматотропин интерферон синтез

Получение соматотропина

Производство интерферонов

Впервые интерферон был описан в 1956 году английскими учеными А. Исааком и Е. Линдеманом. Интерфероны (ИФН) - белки, которые синтезируются в разных клетках организма. Их главная функция - защита организма от вирусных инфекций. Кроме того, интерфероны тормозят деление клеток, в том числе опухолевых, влияют на иммунные реакции организма, защищают клетки от радиационного повреждения. По своему действию интерфероны напоминают гормоны. Это вещества с очень высокой активностью. За единицу активности интерферона принято количество интерферона, которое защищает от поражения вирусом 10 млн. клеток. Таким защитным эффектом обладает 1 пикограмм интерферона (10-12г). Способность интерферонов защищать организм от вирусов и тормозить рост опухолей вызывает большой интерес к ним. Интерфероны имеют видовую специфичность, поэтому нельзя использовать интерфероны различного происхождения. В связи с этим интенсивно разрабатывались методы получения человеческого интерферона из клеток культур отдельных тканей человека, а также из микроорганизмов, созданных методами генетической инженерии. В зависимости от клеток-продуцентов интерфероны человека подразделяются на три группы:

1. альфа-интерферон, продуцируемый лейкоцитами человека (лейкоцитарный);

2. бета-интерферон, продуцируемый диплоидными фибробластами (фибробластовый);

3. гамма-интерферон или иммунный интерферон, продуцируемый гамма-лимфоцитами человека.

Первым из этих соединений на рынок поступил альфа-интерферон, затем бета-интерферон.

ИФН подразделяются на два типа. К первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-б и один подтип ИФН-в. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-г.

В клетке интерферон начинает синтезироваться в ответ на определенные возбудители. Основным возбудителем синтеза интерферона являются вирусы, мутагены и специфические антигены, которые могут индуцировать синтез интерферона. Производство интерферона в медицинских целях до недавнего времени основывалось на технологии с использованием клеточных культур. В последние годы эти технологии усовершенствованы: применяют новейшие методы концентрирования и очистки белков, достижения генетической инженерии.

Исторически первым методом получения интерферона можно считать метод П. Кантелы, который основан на культивировании лейкоцитов и очистке интерферона. Отделенные от других кровяных элементов лейкоциты помещают в поддерживающую среду. Синтез интерферона индуцируют 16-20 часов при помощи вируса Сендай (линия Кантелы). Индуцирование синтеза интерферона надо начинать не позднее 24 часов после взятия крови. Так как для получения интерферона методом Кантелы требуется много донорской крови, возможности этого метода ограничены. Фибробластовый интерферон получают от культур диплоидных клеток. Максимальный выход интерферона наблюдается при помощи синтетической двунитчатой РНК. Человеческий лимфобластоидный интерферон получен из лимфоидных клеток инфильтрата плевры больных лимфомой Беркита. Для индуцирования синтеза такого интерферона также используется вирус Сендай. Иммунный интерферон синтезируют В- и Т-лимфоциты. Его получают от кратковременных культур Т- и В-лимфоцитов. Выход этого интерферона ниже, чем альфа- и бета-интерферона.

Первые сообщения о получении альфа-интерферона генноинженерным методом появились в 1980 году. В бывшем СССР альфа-интерферон получен в Институте органического синтеза АН ЛатССР под руководством Э. Грена. Ген интерферона был синтезирован на матрице мРНК, выделенной из активно синтезирующих интерферон лейкоцитов. Ген был включен в плазмиду, которая была введена в клетки E.coli. Полученные трансформированные клетки продуцировали около 8 -10 ед. интерферона в 1 дм3 бактериальной культуры. Выделенный альфа-интерферон оказался интерфероном нового типа, до этого еще неиндентифицированным. Изучение альфа-интерферона показало, что имеется как минимум 20 генов, отвечающих за различные типы альфа-интерферонов. Получение интерферонов генноинженерным путем очень перспективно, так как из 1дм3 интерферонсинтезирующей культуры микроорганизмов можно получить до 60 мкг лейкоцитарного интерферона. Такое количество препарата можно получить из 100 дм3 крови. Сконструированы также плазмиды, содержащие гены бета- и гамма-интерферонов.

В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.

Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.

Но много недостатков. Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.

Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.

Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, рН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте рН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.

Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/pIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).

Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.

В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды pSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.

Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.

Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем:

1) Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.

2) Полученным продуктом трансформируют Е. соli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.

3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК.

4) Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и хРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка.

5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека.

Размещено на Allbest.ru