Філогенетична характеристика роду Pseudomonas

Размещено на http://www.allbest.ru/

Філогенетична характеристика роду Pseudomonas

Генетична систематика вивчає фізико-хімічні властивості ДНК з метою створення природної системи мікроорганізмів. Загальна кількість ДНК в геномі - важлива інтегральна характеристика ДНК. У бактерій роду Pseudomonas, в порівнянні з іншими мікроорганізмами, воно досить велике: 3624 пар основ у Р. aeruginosa, 3820 - у Р. putida, 4107 - у P. fluorescens.

Одним з важливих параметрів ДНК, широко використовуваних у дослідженнях таксономії і ідентифікації мікроорганізмів, є молярний склад ГЦ пар (%). Він виступає як кількісний показник нуклеотидного співвідношення у ДНК бактеріального генома. Представники роду Pseudomonas в даному плані вивчені досить детально. Найбільший внесок у їх дослідження було зроблено Мандель, яка проаналізувала ГЦ- вміст ДНК у 165 штамів різних видів псевдомонад, згодом, при описі нових видів, а також більш детальному вивченні вже описаних, ця інформація неодноразово доповнювалася. За нуклеотидним складом ДНК бактерії роду Pseudomonas являють собою досить компактну групу: цей показник коливається у них в межах 58-70%. Дещо нижче (55-57%) нуклеотидний склад ДНК P. stanieri, а також Р. luteola (55,4-55,9%).

Коливання в ГЦ-складі ДНК всередині роду, як правило, не перевищує 10%, всередині виду - не більше 1%. Предсавники роду Pseudomonas дещо перевищують ці показники. Так, за даними Мандель, ГЦ-склад ДНК штамів Р. putida становить 60,7-62,5%, штамів P. stutzeri - 62,1-65,0%. За даними Де Лея ГЦ-склад ДНК штамів фітопатогенних бактерій роду Pseudomonas коливається в досить вузьких межах (60,5 ± 1,2%), що, на думку автора, свідчить про їхню тісну спорідненість і загальне еволюційне походження. Було досліджено нуклеотядний складу ДНК більш ніж у 100 штамів псевдомонад, у тому числі P. aurantiaca, P. taetrolens та інших. Показано, що ГЦ - склад ДНК досліджених штамів бактерій коливається в межах 59,6-69,1% всередині таких фенотипових однорідних видів, як P. aurantiaca, P. aureofaciens. Відмінності в ГЦ-складі ДНК окремих штамів не перевищує 1-1,5%. Види, гетерогенні за властивостями, є неоднорідні і за нуклеотидним складом ДНК (Р. putida - 62,5-65%, P. stutzeri - 62,8-67,4%, P. fluorescens - 61,2-64,5%, P. pseudoalcaligenes - 60,8-63,8% ГЦ). Деякі відхилення ГЦ-складу ДНК окремих штамів можуть бути обумовлені наявністю плазмід, що є поширеними у роду Pseudomonas (складають до 15% бактеріального генома). Результати дослідження нуклеотидного складу ДНК дозволили переглянути таксономічне положення видів, включених у свій час до роду Pseudomonas, і, таким чином, звузити його межі. Так, наприклад, види Р. putrefaciens, Р. piscicida, Р. atlantica були віднесені до роду Alteromonas, а Р. natriegens - до морських вібріонів, Р. methanica був виділений в спеціалізовану групу метанокислюючих бактерій. Дослідження складу пар основ ДНК, у поєднанні з іншими методами, дозволило уточнити таксономічне положення багатьох видів Pseudomonas. Була показана ідентичність P. cepacia, P. multivorans і P. kingii, P. pickettii і P. thomaasii, Р. melanogena і P. maltophilia. Результати вивчення нуклеотидного складу ДНК типового штаму Р. aurantiaca послужили одним з доказів його приналежності до Р. aureofaciens. Достовірність таких висновків була підтверджена методом гібридизації нуклеїнових кислот. Метод молекулярної гібридизації ДНК - ДНК, широко використовується для встановлення ступеня філогенетичної спорідненості між організмами, вперше застосований Де Леєм і Фрідманом в 1965 р. при гібридизації ДНК Pseudomonas із ДНК Xanthomonas pelargonii. Було продемонстровано значну (58-81% гомології) спорідненість між родами Pseudomonas і Xanthomonas. Проте, проведені згодом дослідження показали, що значення гомології були суттєво завищені і, мабуть, являються результатом помилки. Пізніше, американськими дослідниками було проведено фундаментальне вивчення філогенетичних зв'язків між різними видами Pseudomonas за допомогою молекулярної гібридизації ДНК -ДНК. Гібридизацію проводили методом конкуренції при оптимальній температурі (на 25° нижче температури плавлення ДНК) і більш стресовій (80°С). Ці дослідження підтвердили угруповання бактерій за видами, запропонованими раніше на підставі їх фенотипових властивостей. Так, було показано спорідненість між сапрофітними і фітопатогенними видами бактерій роду Pseudomonas, що утворюють зелений флуоресцентний пігмент, а також P. stutzeri, P. mendocina, P. alcaligenes і P. pseudoalcaligenes. Перераховані види були виділені в єдину групу, названу «комплексом Р. fluorescens». Показники реасоціаціі ДНК при температурі 25°, нижче температури плавлення, між видами всередині цієї групи найчастіше коливалися в межах 20-50%, хоча в окремих випадках були значно нижчі (наприклад, досліджені штами Р. stutzeri і P. mendocina проявили всього 5% гомології з фітопатогенними бактеріями Р. syringae, а штами Р. alcaligenes і Р. Pseudoalcaligenes - 12- 13% гомології з Р. fluorescens). На загал, досліди з молекулярної гібридизації ДНК показали значну гетерогенність таких великих таксонів, як Р. fluorescens і Р. putida, і певну генетичну відособленість біотипів D і Е Р. fluorescens, еквівалентних рангу виду, а не біотипу. Цей висновок відображається в 8-му виданні визначника, де названі біотипи отримали видову самостійність (P. aureofaciens і P. chlororaphis). Порівняно низькі значення гомології (18-37%) були виявлені між сапрофітними і фітопатогенними флуоресцентними видами псевдомонад. Аналогічні значення (7-29%) отримали Пекнольд і Гроген при вивченні взаємодії між фітопатогенними бактеріями Р. morsprunorum, Р. cichorii, P. viridiflava, Р. syringae і сапрофітами Р. fluorescens, Р. putida. При вивченні дев'яти штамів Р. pseudoalcaligenes і трьох штамів Р. alcaligenes Ральстон-Барретом і співавторами було показано від 17 до 37% міжвидової гомології ДНК - ДНК і від 53 до 82% гомології між штамами одного і того ж виду. Аулінг і співавтори, вивчаючи оптичними методами реассоціацію ДНК - ДНК у водневоокиснюючих бактерій, спостерігали гомології від 12 до 65% між видами P. palleronii, P. pseudoflava, Р. facilis, P. flava, P. saccharophila і від 84 до 100% - всередині названих видів. Нижче наведені деякі дані, отримані при визначенні ступеня геномної спорідненості штамів різних видів бактерій роду Pseudomonas з типовим штамом P. fluorescens АТСС 13525 методом гібридизації ДНК - ДНК:

Табл. 1:

Показники геномної спорідненості між окремими флуоресцентними видами становили в середньому 20-30%, а в деяких випадках досягали і більш високих значень (до 49%). Вельми низькі рівні міжвидової гомології ДНК були отримані при гібридизації Р. fluorescens з біоваром В Р. putida. Повна відсутність спорідненості спостерігалась при гібридизації ДНК типового штаму Р. fluorescens з біоваром А Р. putida і штамами Р. pseudoalcaligenes. У значних межах (від 45 до 99%) коливалися значення геномної спорідненості між різними штамами P. cepacia.

Показники гібридизації ДНК - ДНК в комплексі з іншими підходами послужили підставою для визначення видової самостійності P. aurantiaca, P. taetrolens, Р. fragi і їх приналежності до видів Р. fluorescens-комплексу (згідно термінології - I секція роду Pseudomonas). Гібридизація ДНК - ДНК є обов'язкова при описі нових видів Pseudomonas, уточненні таксономічного положення вже описаних, ідентифікації виділених з ґрунту атипових штамів і при вирішенні багатьох інших питань систематики роду Pseudomonas. Цей метод дозволяє визначати близькоспоріднені зв'язки, проте не є придатним для більш високих таксономічних рівнів.

Молекулярна гібридизація ДНК - ДНК виявила і інші групи споріднених видів всередині роду Pseudomonas, наприклад, патогенні для людини, тварин і рослин P. solanacearum, P. cepacia, P. mallei, P. pseudomallei, види груп «acidovorans» і «facilis-delafieldii», а також Р. diminuta і P. vezicularis, далекі як генетично, так і фенотипово від інших представників роду. Таким чином, дослідження гібридизації ДНК - ДНК зруйнували уявлення про цілісність роду Pseudomonas і показали, що, незважаючи на фенотипову подібність, представники цього роду утворюють кілька філогенетично віддалених видових комплексів, або груп (рис. 1).

Рис. 1. - Розподіл видів і біотипів бактерій роду Pseudomonas відповідно до гомології рРНК та ДНК:

Відповідно до рРНК - груп:

1) P. caryophylli;

2) P. mallei;

3) P. pseudomallei;

4) P. cepacia;

5) Р. marginata;

6) P. pickettii;

7) P. colanacearum;

8) Р. diminuta;

9) P. vezicularis;

10) P. acidovorans;

11) Р. testosteroni;

12) P. saccharophila;

13) Р. facilis;

14) P. delafieldii;

15) P. maltophilia;

16) Xanthomonas sp.;

17) P. syringae;

18) P. mori;

19) P. savastanoi;

20) P. tomato;

21) P. phaseolicola;

22) P. glycinea;

23) P. cichorii;

24) P. putida;

25) P. fluorescens E;

26) P. fluorescens B;

27) P. fluorescens A;

28) P. fluorescens D;

29) P. fluorescens C;

30) P. fluorescens F.;

31) P. putida A;

32) P. aeruginosa;

33) P. pseudoalcaligenes;

34) P. mendocina;

35) P. alcaligenes;

36) P. stutzeri.

Значним кроком вперед у розвитку генетичної систематики роду Pseudomonas стала гібридизація ДНК різних видів псевдомонад з рибосомальної РНК. Остання кодується найбільш консервативною в процесі еволюції частиною бактеріального геному, що дозволяє виявити спорідненість між відносно далекими групами мікроорганізмів. Проведені дослідження показали більш високий (ніж при гібридизації ДНК - ДНК) відсоток подібності нуклеотидних послідовностей нуклеїнових кислот як всередині описаних вище груп, так і між ними (рис. 2). У деяких випадках при повній відсутності гомології ДНК - ДНК авторам вдалося отримати досить високі значення гомології ДНК з рибосомальної РНК. У ході цих досліджень були об'єднані в єдиний комплекс групи «acidovorans» і «facilis-delafieldii», а також створено новий, 5-й комплекс, що включає P. maltophilia і споріднені йому мікроорганізми роду Xanthomonas (рис. 1), міжгрупові значення гомології рРНК - ДНК становили від 2 до 66% (в середньому 40%).

Рис. 2. - Ступінь конкуренції рРНК - ДНК (у%) між різними РНК - групами бактерій роду Pseudomonas (у порівнянні з E. coli):

Наведено середні значення міжгрупових показників гомології. Кожен з комплексів РНК - груп, створених на підставі гомології ДНК - рРНК, відповідає рангу роду або навіть сімейству і філогенетично далекий від інших. Це підтверджується і результатами досліджень лабораторії Де Лея, де були отримані гібриди 23514С-міченої рибосомальної РНК і ДНК багатьох видів і родів бактерій. В результаті отриманих даних рід Pseudomonas був розподілений на три великим суперсімейства, перше з яких включає флуоресцентні і безпігментні види I РНК - групи, а також роди Azotobacter і Azomonas. Спорідненість між цими таксонами підтверджується подібністю амінокислотних послідовностей, їх цитохромів, і деякими іншими даними еволюційної біохімії. Види псевдомонад, що належать до II і III РНК - груп увійшли до складу іншої РНК - гілки разом із родами Chromobacterium, Janthinobacterium, Alcaligenes. Особливе суперсімейство склали види роду Xanthomonas із P. maltophilia. Ці дані поряд з всебічними фенотиповими дослідженнями забезпечили перенесення P. maltophilia до складу роду Xanthomonas. Метод гібридизації ДНК - рРНК дозволив уточнити положення і філогенетичні зв'язки багатьох видів псевдомонад із невизначеним таксономічним статусом. Деякі з них, Р. myxogenes, Р. oleovorans, Р. reptilivora, Р. septica, Р. synxantha, виявилися генетично близькими мікроорганізмам Р. fluorescens -комплексу, інші були віднесені до родів Xanthomonas (P. boreopolis, Р. pictorum, P. hibiscicola), Alteromonas (Р. atlantica, Р. piscicida), Deleya (P. beijerinckii), Flavobacterium (P. paucimobilis), Acinetobacter (P. pavonacea) та інші.

Гібридизація ДНК - рибосомальних РНК лягла в основу деяких методів експрес-діагностики псевдомонад. Фестл і співавтори виділили з 23S рРНК - генів Р. aeruginosa фрагмент, який містить 360 пар основ, і клонували його у вектор pUN 121, отримавши плазміду pHF 360. При її гібридизації з хромосомної ДНК багатьох мікроорганізмів виявилося, що вона є високо специфічною для флуоресцентних і споріднених до них безпігментних видів Pseudomonas, що дозволяло чітко диференціювати їх від інших видів бактерій, у тому числі від помірно подібних Azotobacter і Azomonas. Значний внесок у розвиток порівняльної філогенії прокаріотів зробили дослідження 5S і 16S рибосомальних РНК. Останні є більш придатними для широкого філогенетичного аналізу, але важче піддаються повному визначенню послідовностей. При їх дослідженні проводиться частковий аналіз послідовностей, так звана порівняльна каталогізація олігонуклеотидів. Метод полягає у виділенні 16S рРНК з різних бактерій, їх частковому гідролізі до олігонуклеотидів, секвенуванні останніх і обробці отриманих даних нумерологічними методами. Побудовані при цьому дендрограми є близькі істинному філогенетичному дереву.

Цей метод дозволив отримати дані, близькі до тих, які були отримані при гібридизації ДНК - рибосомальних РНК. Види псевдомонад виявилися розподіленими по трьх філогенетичних групах. В одну з них увійшли флуоресцентні бактерії, Azotobacter vinelandii і Serpens flexibilis, друга містила P. cepacia з близькими йому Alcaligenes і Chromobacterium, а також P. acidovorans і P. testosteroni, в третю філогенетичну групу увійшли Р. diminuta, Agrobacterium tumefaciens і Rhizobium.

Поряд з названими родами і видами, у всіх трьох групах були присутні пурпурні фотосинтезуючих бактерії. Таким чином, представники роду Pseudomonas виявилися розподіленими між багатьма видами і родами еубактерій. Викладені вище дані переконливо демонструють гетерогенність роду Pseudomonas, полігенеруючий характер цього таксону, необхідність його повторного аналізу. Ці уявлення знайшли відображення у 9-му виданні визначника Бергі що є, безсумнівно, важливим, проте далеко не завершеним етапом на шляху створення еволюційно обґрунтованої систематики бактерій роду Pseudomonas.

Визначник містить детальну характеристику 25 видів роду, розподілених за трьома секціями (РНК- групами).

Віднесення мікроорганізмів до тієї чи іншої секції здійснюється за допомогою дихотомічного ключа - видова диференціація за допомогою діагностичних таблиць.

Табл. 2:

Поряд з трьома названими вище секціями визначник включає описи філогенетично далеких від псевдомонад Р. diminuta, P. vezicularis і Р. maltophilia. Останню секцію становлять види, філогенетичні особливості яких з добре вивченими видами роду Pseudomonas не були з'ясовані. Їх фенотипові властивості досліджені в різний час різними авторами і з неоднаковим ступенем повноти, таксономічне положення потребує уточнення (прикладом може служити Р. mesophilica, більш детальне вивчення якого показало приналежність до метанокислюючих бактерій).

Вказане вище відноситься до видів, не включених до 9-го видання визначника Бергі і «Схвалених списків видових назв». Багато хто з цих видів захищені патентами та є недоступними для широкого кола дослідників. До їх числа належать Р. bromoutilis, Р. magnesiorubra, Р. sorbistinii та інші.

Безсумнівно, одним із завдань систематики роду Pseudomonas є максимально повна характеристика як уже відомих, так і нових видів псевдомонад на основі уніфікованих методів, апробації даних на великій кількості об'єктів і діагностичних таблицях (часто розроблених всього на декількох штамах), перевірка і відбір простих та надійних критеріїв, придатних для діагностики. Необхідне широке використання методів генетичної систематики для уточнення меж роду, виявлення споріднених видів, виведення зі складу роду генетично віддалених мікроорганізмів, виявлення нових видів псевдомонад. Крім того, безсумнівно актуальні молекулярно-біологічні та порівняльні біохімічні дослідження різних родів грамнегативних бактерій і їх філогенетичної спорідненості з псевдомонадами, що дозволить створити природну класифікацію останніх і встановити місце роду Pseudomonas в системі мікробного світу.

Література

1. Воронин А.М. Биология плазмид // Успехи микробиологии. - М.: Наука, 1983. - Т. 18. - С. 143-163.

2. Киприанова Е.А., Леванова Г.Ф., Новова Е.В. и др. Таксономическое изучение Pseudomonas aurantiaca и предложение неотипового штамма этого вида // Микробиология. - 1985. - 54, №3. - С. 434-440.

3. Киприанова Е.А., Гарагуля А.Д., Леванова Г.Ф., Барышева Н.Н. Таксономическое изучение Pseudomonas fragi // Микробиология. - 1988. - 57, №1. - С. 119-125.

4. Леванова Г.Ф. Опыт применения модифицированного метода определения нуклеотидного состава ДНК бактерий по температуре плавления // Сравнительная физиология микроорганизмов. - Горький, 1970. - С. 108-111.

5. Леванова Г.Ф., Новова Е.В., Сорокина В.Н., Киприанова Е.А. Спектрофотометрический метод оценки молекулярной гибридизации ДНК - ДНК // Биол. науки. - 1984. - №8. - С. 23-26.

6. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий. - М.: Наука, 1976.

7. Auling G., Dittbrenner М., Maarzahl M. et al. Deoxyribonucleic acid relationships among hydrogen-oxidizing strains of the genera Pseudomonas, Alcaligenes and Paracoccus // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1980. - Vol. 30, №1. - P. 123-128. генетичний біологічний бактерія

8. Baumann P., Bowditch R., Baumann L., Beaman B. Taxonomy of marine Pseudomonas species: P. stanieri sp. nov., P. perfectomarina sp. nov. nom. rev., P. nautica and P. doudoroffii // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1983. - Vol. 33, №4. - P. 957-965.

9. Burkholder P., Pfisier R., Leitz F. Production of a pyrrole antibiotic by amarine bacterium // Appl. Microbiol. - 1966. - Vol. 14, №4. - P. 649-653.

10. Debette J., Blondeau R. Characterization de bacteries telluriques assimilablesa Pseudomonas maltophilia // Can. J. Microbiol. - 1977. - Vol. 23, №9. - P. 1123-1127.

11. De Ley J. DNA-base composition and hydridization in the taxonomy of phytopathogenic bacteria // Ann. Rev. Phytopathol. - 1968. - Vol. 6. - P. 63-90.

12. De Ley J, Friedman S. Similarity of Xanthomonas and Pseudomonas deoxyribonucleic acid // J. Bacteriol. - 1965. - Vol. 89. - P. 1306-1309.

13. De Smedt J., Bauwends М., Tytgat R., De Ley J. Intra and intergeneric similarities of ribosomal ribonucleic acid cistrons of free-living, nitrogenfixing bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1980. - Vol. 30, №1. - P. 106-122.

14. De Vos P., Kersters K., Falsen F. et al. Comamonas Davis and Park 1962 gen. nov., nom. rev. emend., and Comamonas terrigena Hugh 1962 sp. nov. nom. rev. // Ibid. - №4. - P. 443-453.

15. De Vos P., Van Landschoot A., Segers P. et al. Genotypic Relationschips and Taxonomic Localization of Unclassified Pseudomonas and Pseudomonas-like Strains // Ibid. - 1989. - Vol. 39, №1. - P. 35-49.

16. Festl H., Ludwig W., Schleifer K.H. DNA hybridization probe for the Pseudomonas fluorescens group // Appl. and Environ. Microbiol. - 1986. - Vol. 52, №5 - P. 1190-1194.

17. Gandhi N.М., Patell J.R., Gandhi J. et al. Prodigiosin metabolites of amarine Pseudomonas species // Marine Biol. - 1976 - Vol. 34, №3 - P. 223-227.

18. Holloway B.W., Morgan A.F. Genome organisation in Pseudomonas // Ann. Rev. Microbiol. - 1986. - Vol. 40. - P. 79-105.

19. King A., Holmes B., Phillips J., Lapage S. A taxonomic study of clinical isolated of Pseudomonas pickettii, P. thomasii and “Group IV” bacteria // J. Gen. Microbiol. - 1979. - Vol. 114, №1. - P. 137-147.

20. Kodama K., Kimura N., Komagata К. Two new species of Pseudomonas: P. oryzihabitans isolated from rice paddy and clinical specimens and P. Luteola isolated from clinical specimens // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1985. - Vol. 35, №4.

21. Komagata K., Yabuuchi E., Tamagawa Y., Ohyama A. Pheudomonas melanogena Iizuka and Komagata 1963, a later subjective synonym of Pseudomonas maltophilia Hugh and Ryschenkow 1960 // Ibid. - 1974. - Vol. 24, №2. - P. 242-247.

22. Mandel M. Deoxyribonucleic acid base composition in the genus Pseudomonas // J. Gen. Microbiol. - 1966. - Vol. 43, N 3. - P. 273-292.

23. Olsen C.J., Lane D., Giovannoni J. et al. Microbial ecology and evolution: A ribosomal RNA approach // Ann. Rev. Microbiol. - 1986. - Vol. 40. - P. 337-365.

24. Palleroni N.J. General properties and taxonomy of the genus Pseudomonas // Genetics and biochemistry of Pseudomonas. - London, New York: Wiley and sons. - 1975. - P. 1-37.

Размещено на Allbest.ru