Частная микробиология и вирусология

Эпидемиология. Основными путями заражения являются воздушно - капельный и воздушно - пылевой. Основным источником заражения является больной туберкулезом человек. Особую роль имеет скученность проживания, в России наибольшую значимость имеют места заключения, лагеря беженцев, лица без определенного места жительства и другиен социально ущербные группы населения. В относительно небольшом проценте случаев туберкулез обусловлен заражением от животных (чаще - через молоко) М.bovis.

Патогенетические особенности.

В течение жизни человек неоднократно контактирует с микобактериями туберкулеза, однако туберкулезный патологический процесс развивается далеко не у всех инфицированнных. Это зависит от многих факторов и прежде всего - резистентности организма.

Наиболее часто заражение происходит через дыхательные пути. Попавшие в организм микобактерии захватываются альвеолярными и легочными макрофагами. В месте попадания может развиться первичный аффект (бронхопневмонический фокус). Далее возбудитель транспортируется в регионарные лимфоузлы, вызывая воспалительную реакцию - лимфангоит и лимфаденит. Первичный аффект, лимфангоит и лимфаденит - первичный комплекс (первичный очаг туберкулеза), характеризующийся образованием по ходу лимфатических путей и узлов гранулем в виде бугорков (бугорчатка или туберкулез).

Образование гранулем представляет собой клеточную реакцию ГЗТ на ряд химических компонентов микобактерий. В центре гранулемы в очаге некроза (казеозного распада) находятся микобактерии. Очаг окружен гигантскими многоядерными клетками Пирогова - Лангханса, их окружают эпителиоидные клетки а по периферии - лимфоциты, плазматические и мононуклеарные клетки.

Исходы первичного очага:

- при достаточной резистентности организма размножение возбудителя в гранулемах прекращается, очаг окружается соединительнотканной капсулой и обезизвествляется (откладываются соли кальция). Этот процесс определяется формированием нестерильного инфекционного иммунитета к возбудителю туберкулеза. Нестерильность - способность микобактерий длительно сохраняться в первичном очаге и ждать свой час (иногда через несколько десятилетий);

- при недостаточной резистентности - усиленный казеозный распад очага, казеозная пневмония, тяжелая первичная легочная чахотка и генерализованный туберкулез (диссеминированный или милиарный туберкулез с гранулемами в различных органах).

Вторичный туберкулез.Вторичный туберкулезный процесс - реактивация возбудителя в результате ослабления резистентности наблюдается при стрессах, нарушениях питания и у лиц пожилого возраста. Возникают очаги казеозного распада в легких с образованием полостей, поражение бронхов, мелких кровеносных сосудов.

Иммунитет. В основе нестерильного инфекционного и вакцинального иммунитета при туберкулезе - клеточный иммунитет в виде гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), опосредуемой Т- лимфоцитами и макрофагами. Т- лимфоциты при участии белков главной системы гистосовместимости класса I распознают клетки, инфицированные микобактериями туберкулеза, атакуют и разрушают их. Антибактериальные антитела связываются с различными антигенами возбудителя, образуют циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) и способствуют их удалению из организма.

Аллергическая перестройка (ГЗТ) к туберкулезной палочке свидетельствует о формировании приобретенного иммунитета и может быть выявлена с помощью туберкулиновой пробы. Эта проба является достаточно специфичной. Старый туберкулин Коха представляет концентрированный фильтрат стерилизованных компонентов микобактерий. Очищенный препарат PPD (новый туберкулин Коха, содержащий туберкулопротеины) используют преимущественно для постановки внутрикожной пробы Манту. С помощью этой пробы проводят отбор лиц, подлежащих ревакцинации. Положительный результат пробы Манту нельзя рассматривать как обязательный признак активного процесса (это на самом деле показатель ГЗТ), а отрицательный - не всегда свидетельствует об его отсутствии (анергия, иммунодефициты).

Иммунопрофилактика включает внутрикожное введение аттенуированного штамма B.bovis, известного как бацилла Кальметта - Жерена (БЦЖ). В России вакцинацию проводят новорожденным (на 5-7 дни жизни), ревакцинацию - в 7-12-17-22 лет и более старших возрастах при отрицательной пробе Манту (т.е. отсутствии клеточного нестерильного = вакцинального или инфекционного иммунитета - ГЗТ).

Лабораторная диагностика. Применяют микроскопические, бактериологические, биологические, аллергологические, серологические и молекулярно - генетические методы.

Микроскопическая диагностика включает микроскопию нативного материала, использование методов накопления, люминесцентную диагностику. Микроскопия нативного патологического материала (мокрота, отделяемое свищей, промывные воды из бронхов, моча) в мазках, окрашенных по Цилю - Нильсену, позволяет выявлять красные кислотоустойчивые палочки при концентрации микобактерий не менее нескольких сот тысяч / мл. Методы накопления (например, флотации) повышают чувствительность микроскопии до нескольких тысяч микробных тел / мл. Люминесцентная микроскопия с использованием акридинового оранжевого или аурамина - родамина - наиболее чувствительный и эффективный метод бактериоскопии, чувствительность - 500-1000 микобактерий / мл. Позволяет выявлять микобактерии с измененными культуральными и тинкториальными свойствами.

Бактериологический метод (посев на питательные среды) позволяет обнаружить микобактерии при концентрации 200-300 / мл. Наиболее эффективен до или в начале лечения, в конце лечения уступает по эффективности люминесцентному методу. Недостаток - длительность получения результатов - от 2 до 12 недель. Достоинство - возможность оценки вирулентности культуры, определение чувствительности к лекарственным препаратам. Разработаны ускоренные методы выделения. По методу Прайса материал помещают на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду с цитратной кровью. Стекло вынимают через 3-4 суток и окрашивают по Цилю - Нильсену.

Золотой стандарт - биологическая проба на морских свинках, позволяет определять до 10 микобактерий в мл. Распространение резистентных и измененных микобактерий снизило чувствительность метода. Метод требует соблюдения режимных условий и применяется в крупных специализированных лабораториях.

Аллергологические методы - это широко используемые кожные пробы с туберкулином и методы аллергодиагностики in vitro (РТМЛ, ППН - показатель повреждения нейтрофилов и др.).

Серологические методы многочисленны (РСК, РА, РПГА), однако в связи с недостаточной специфичностью используют мало.

Наиболее совершенны генетические методы, в практических лабораториях их используют пока недостаточно.

Среди методов идентификации микобактерий наибольшую практическую ценность имеют два подхода:

- методы дифференциации M.tuberculosis и M.bovis от прочих микобактерий;

- методы дифференциации M.tuberculosis и M.bovis.

Существует ряд методов дифференциации микобактерий двух основных видов от остальных. Из них наиболее простым и доступным является оценка роста на яичной среде, содержащей салициловый натрий в концентрациях 0,5 и 1,0 мг/мл. На этих средах, в отличии от других микобактерий, M.tuberculosis и M.bovis не растут.

Для дифференциации M.tuberculosis от всех других видов микобактерий , в том числе от M.bovis, используют ниациновый тест (определение синтезируемой M.tuberculosis в больших количествах никотиновой кислоты, выявляемой с помощью цианистых или роданистых соединений по ярко- желтому окрашиванию). У микобактерий туберкулеза также отмечается положительный тест восстановления нитратов. Учитывают скорость роста и характер пигментообразования. Используют цитохимические методы, позволяющие выявлять корд - фактор (вирулентность) по прочности связи красителей - нейтрального красного или нильского голубого при обработке щелочью.

M.bovis.

Этот вид микобактерий выявлен у 60 видов млекопитающих. Эпидемическую опасность для человека представляют крупный рогатый скот, реже - верблюды, козы, овцы, свиньи, собаки, кошки. Больные животные выделяют микобактерии с молоком, мокротой, экскрементами. Человек заражается при уходе за больными животными или употреблении сырого молока и молочных продуктов (в сыре и масле возбудитель может сохраняться более 200 дней). На долю этого возбудителя приходится до 5% случаев туберкулеза (высокая доля туберкулеза бычьего типа - в Якутии и других территориях с высоким уровнем заболеваемости животных туберкулезом).

M.leprae.

Микобактерии лепры - возбудитель лепры (проказы) - генерализованной хронической инфекции с преимущественным поражением производных эктодермы (покровные ткани и периферическая нервная система).

Морфология в целом типична для микобактерий. Хорошо окрашиваются по Цилю - Нильсену, облигатные внутриклеточные паразиты. В мазках располагаются параллельными группами (пачка сигар) или шаровидными скоплениями.

Культуральные свойства. Очень плохо культивируются на питательных средах. Основной метод диагностики - бактериоскопический. Дифференциация с микобактериями туберкулеза может осуществляться в биопробе на белых мышах (M.leprae не патогенна для них).

Эпидемиология. Заболевание мало контагиозно. Имеет значение генетическая предрасположенность, индивидуальная резистентность к инфекции. Заражение происходит контактно - бытовым и воздушно - капельным путем. Содержат больных в лепрозориях (основной путь профилактики - изоляция).

Клинико - патогенетические особенности. Инкубационный период - очень длительный (от 4-6 лет). Выделяют туберкулоидную (более доброкачественную) и лепроматозную (более тяжелую) форму.

Лечение длительное, иногда пожизненное. Основные препараты - сульфоны, препараты выбора - дапсон, рифампицин, клофазимин.

Лекция №6. Семейство Enterobacteriaceae. Род Salmonella

Общая характеристика семейства энтеробактерий.

Бактерии этого семейства являются наиболее частыми возбудителями кишечных инфекций. Их объединяет ряд общих признаков. Это короткие, не образующие спор, палочки с закругленными концами, подвижные (перитрихи) или неподвижные, некоторые имеют капсулы. Аэробы или факультативные анаэробы. Характерна отрицательная окраска по Граму. Хорошо растут на обычных питательных средах с мясном экстрактом. На большинстве плотных сред энтеробактерии образуют круглые выпуклые блестящие S- (гладкие) колонии, а также часто обусловленные потерей капсулы плоские, неровные и зернистые R- (шероховатые) формы. Для них характерна ферментация глюкозы (и других углеводов) с образованием кислоты и газа. По отношению к лактозе их делят на лактоза- ферментирующие и лактоза - неферментирующие. Каталаза - положительны, восстанавливают нитраты в нитриты.

Семейство энтеробактерий включает более 20 родов, объединяющих более 100 видов бактерий, обитающих в почве, на растениях, входящих в состав микробных биоценозов кишечников животных и человека. Наибольшее значение для человека имеют рода Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Proteus, Klebsiella и др. Для дифференциации родов используют в основном биохимические признаки, для классификации внутри родов и видов - изучение антигенной структуры (О-, Н- и К- антигенов).

О- антиген представлен липополисахаридами (ЛПС) наружной мембраны. Штаммы, лишенные О- антигена, образуют R- колонии и обычно авирулентны.

Н- антиген - термолабильные белки, имеются только у подвижных (имеющих жгутики) видов.

К- антиген - термостабильные полисахариды капсулы и наружной оболочки.

В патогенезе поражений, вызываемых энтеробактериями, имеют значение ЛПС (эндотоксин, освобождающийся при разрушении бактерий), различные энтеротоксины, факторы инвазивности и адгезии (жгутики и др.), ферменты патогенности.

Род Salmonella.

Сальмонеллы - большая группа энтеробактерий, среди которых различные серотипы - возбудители брюшного тифа, паратифов А, В и С и наиболее распространенных пищевых токсикоинфекций - сальмонеллезов. По признаку патогенности для человека сальмонеллы разделяют на патогенные для человека- антропонозы (вызывают брюшной тиф и паратифы А и В) и патогенные для человека и животных - зоонозы (вызывают сальмонеллезы). Несмотря на значительные различия сальмонелл по антигенным характеристикам, биохимическим свойствам, вызываемым ими заболеваниям, по современной, но недостаточно удобной и совершенной классификации выделяют два вида - S.bongori и S.enteritica. Последний разделен на подвиды, из которых наибольшее значение имеют подвиды choleraesuis и salamae. Подвид choleraesuis включает наибольшую часть известных сероваров сальмонелл (около 1400 из примерно 2400).

Морфология. Прямые грамотрицательные палочки размером 2-4 x 0,5 мкм. Подвижны благодаря наличию перитрихиально расположенных жгутиков.

Культуральные и биохимические свойства. Факультативные анаэробы, хорошо растут на простых питательных средах. Оптимум рН- 7,2-7,4, температуры - +37. Метаболизм - окислительный и бродильный. Сальмонеллы ферментируют глюкозу и другие углеводы с образованием кислоты и газа (серотип Salmonella typhi газообразования не вызывает). Обычно не ферментируют лактозу (на средах с этим углеводом - безцветные колонии), сахарозу. Оксидаза- отрицательны, каталаза - положительны. Реакция Фогеса - Проскауэра отрицательна.

На основании биохимических (ферментативных) свойств сальмонеллы разделены на четыре группы. Характерные признаки сальмонелл - образование сероводорода, отсутствие продукции индола и аэробность. Для выделения используют дифференциально - диагностические среды (висмут - сульфит агар, среды Эндо, Плоскирева, SS агар) и среды обогащения (селенитовый бульон, желчный бульон, среда Раппопорта). S- формы образуют мелкие (от 1 до 4 мм) прозрачные колонии (на среде Эндо - розоватые, на среде Плоскирева - безцветные, на висмут - сульфит агаре - черные, с металлическим блеском). На жидких средах S- формы дают равномерное помутнение, R- формы - осадок.

Антигенная структура. Выделяют О-, Н- и К- антигены. К группе К- антигенов относят Vi- антигены (антигены вирулентности). Благодаря более поверхностному расположению (чем О- антигены) Vi- антиген может препятствовать агглютинации культур сальмонелл О- специфической сывороткой (экранирование). Для дифференциации сальмонелл применяют схему (серологическую классификацию) Кауфманна - Уайта.

В соответствии со структурой О- антигенов сальмонеллы подразделяют на О- группы (67 серогрупп), в каждую из которых входят серологические типы, отличающиеся строением Н- антигенов. Принадлежность сальмонелл к определенному серовару устанавливают при изучении антигенной структуры в соответствии со схемой Кауфманна - Уайта. Примеры: серотип S.paratyphi A относится к серогруппе А, S.paratyphi В - к серогруппе В, S.paratyphi С - к группе С, S.typhi - к серогруппе D.

Факторы патогенности.

1.Факторы адгезии и колонизации.

2. Способность к внутриклеточному паразитированию, препятствовать фагоцитозу, размножаться в клетках лимфоидной ткани выражены у возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В, способствуя хроническому носительству.

3.Эндотоксин (ЛПС).

4. Термолабильные и термостабильные энтеротоксины.

5. Цитотоксины.

6. Существенное значение имеют плазмиды вирулентности и R- плазмиды.

7. Vi - антиген ингибирует действие сывороточных и фагоцитарных бактериоцидных факторов.

Основными факторами патогенности сальмонелл является их способность проникать в макрофаги и размножаться в лимфоидных образованиях собственно слизистого слоя тонкого кишечника (пейеровы бляшки, солитарные фолликулы), а также продукция эндотоксина.

Патогенез поражений. Различия клинических форм заболеваний, вызываемых сальмонеллами, зависит от вирулентности и дозы возбудителя и состояния иммунной системы организма. Обычная доза, вызывающая клинические проявления - 10⁶ - 10⁹ бактерий, меньшая доза достаточна при иммунодефицитах, гипохлоргидрии и других заболеваниях желудочно - кишечного тракта.

Выделяют следующие основные формы сальмонеллезной инфекции:

- гастроинтестинальную;

- генерализованную (тифоподобный и септикопиемический варианты);

- бактерионосительство (острое, хроническое, транзиторное).

Существенные патогенетические особенности инфекционного процесса, вызываемого серотипами S.typhi, S.paratyphi A,B, являются основанием для выделения тифо- паратифозных заболеваний в самостоятельную нозологическую группу. Каждой фазе патогенеза соответствует клинический период заболевания и своя тактика лабораторного обследования. Основные фазы - внедрения возбудителя (соответствует инкубационному периоду), первичной локализации возбудителя (продромальный период), бактеремии (первая неделя заболевания), вторичной локализации сальмонелл (разгар заболевания - 2-3 недели), выделительно- аллергическая (реконвалесценция - 4 неделя заболевания).

Проникшие через рот сальмонеллы попадают в эпителиальные клетки двенадцатиперсной и тонкой кишки посредством эндоцитоза. Они легко проникают в эпителиальные клетки, но не размножаются здесь, а проходят и размножаются в лимфатическом аппарате тонкого кишечника. Сальмонеллы размножаются преимущественно в lamina propria (первичная локализация), что сопровождается местной воспалительной реакцией слизистой оболочки, притоком жидкости в очаг поражения и развитием диарейного синдрома (гастроэнтерит). Энтеротоксины повышают уровень циклического аденомонофосфата (цАМФ), происходит повышение уровня гистамина и других биологически активных веществ, проницаемости сосудов. Наблюдаются водно - электролитные нарушения, развиваются гипоксия и ацидоз, которые усугубляют патологический процесс с преобладанием сосудистых растройств. Происходит разрушение части сальмонелл с выделением эндотоксина, сенсибилизация (ГЗТ) лимфатического аппарата тонкого кишечника.

Из слизистой оболочки сальмонеллы могут попадать в лимфо- и далее в кровоток, вызывая бактеремию. В большинстве случаев она носит транзиторный характер, т.к. сальмонеллы элиминируются фагоцитами.

В отличие от других сальмонелл, возбудители брюшного тифа и паратифов, проникнув в кровоток, способны выживать и размножаться в фагоцитах. Они могут размножаться в мезентериальных лимфоузлах, печени и селезенке и вызывать генерализацию процесса. После гибели фагоцитов сальмонеллы вновь поступают в кровь. При этом Vi- антиген ингибирует бактерицидные факторы.

При гибели сальмонелл освобождается эндотоксин, угнетающий деятельность центральной нервной системы (тиф - от греч. typhos - туман, спутанное сознание) и вызывающий длительную лихорадку. Действие эндотоксина может вызвать миокардит, миокардиодистрофию, инфекционно - токсический шок.

В результате бактеремии происходит генерализованное инфицирование желчного пузыря, почек, печени, костного мозга, твердых мозговых оболочек (вторичная локализация сальмонелл). Происходит вторичная инвазия эпителия кишечника, особенно пейеровых бляшек. В сенсибилизированной сальмонеллами стенке развивается аллергическое воспаление с образованием основного грозного осложнения - брюшнотифозных язв. Наблюдается длительное носительство сальмонелл в желчном пузыре с выделением возбудителя с испражнениями, пиелонефриты, кровотечения и перфорации кишечника при поражении пейеровых бляшек. Затем происходит формирование постинфекционного иммунитета, элиминация возбудителя и заживление язв или формирование бактерионосительства (в Западной Сибири часто на фоне хронического описторхоза).

Возбудителями сальмонеллезов являются другие серотипы сальмонелл, патогенные для человека и животных (S.typhimurium, S.enteritidis, S.heldelberg, S. newport и другие). В основе патогенеза сальмонеллезов - действие самого возбудителя (его взаимодействия с организмом хозяина) и эндотоксина, накапливающегося в пищевых продуктах, инфицированных сальмонеллами. В классическом варианте сальмонеллезная токсикоинфекция - гастроэнтерит. Однако при прорыве лимфатического барьера кишечника могут развиваться генерализованные и внекишечные формы сальмонеллезов (менингит, плеврит, эндокардит, артрит, абсцессы печени и селезенки, пиелонефрит и др.). Увеличение генерализованных и внекишечных форм сальмонеллезов связано с увеличением количества иммунодефицитных состояний, что имеет особое значение при ВИЧ- инфекции.

Отдельную проблему представляют госпитальные штаммы сальмонелл (чаще отдельные фаговары S.typhimurium), вызывающие вспышки внутрибольничных инфекций преимущественно среди новорожденных и ослабленных детей. Они передаются преимущественно контактно- бытовым путем от больных детей и бактерионосителей, обладают высокой инвазивной активностью, часто вызывая бактеремию и сепсис. Эпидемические штаммы характеризуются множественной лекарственной устойчивостью (R- плазмиды), высокой резистентностью, в том числе к действию высоких температур.

Эпидемиологические особенности. Характерно повсеместное распространение. Основные резервуары сальмонелл - человек (возбудители брюшного тифа и паратифа А) и различные животные (остальные серотипы сальмонелл). Основные возбудители отличаются полипатогенностью. Основные источники заражения - мясные и молочные продукты, яйца, птице- и рыбопродукты. Основные пути передачи - пищевой и водный, реже - контактный. Характерна чрезвычайная множественность резервуаров и возможных источников инфекции. Основное значение имеют сельскохозяйственные животные и птицы.

Лабораторная диагностика. Основной метод - бактериологический. Исходя из патогенеза оптимальными сроками бактериологических исследований при гастроинтестинальных формах являются первые дни, при генерализованных формах - конец второй - начало третьей недели заболевания. При исследовании различных материалов (испражнения, кровь, моча, желчь, рвотные массы, пищевые остатки) наибольшая частота положительных результатов отмечается при исследовании испражнений, для возбудителя брюшного тифа и паратифов - крови (гемокультура).

Исследования проводят по стандартной схеме. Исследуемый материал засевают на плотные дифференциально - диагностические среды - высокоселективные (висмут- сульфит агар, агар с бриллиантовым зеленым), среднеселективные (среда Плоскирева, слабощелочной агар), низкоселективные (агары Эндо и Левина) и в среды обогащения. Для посева крови используют среду Рапопорт. На висмут- сульфит агаре колонии сальмонелл приобретают черный (реже- зеленоватый) цвет.Выросшие колонии пересевают на среды для первичной (среды Ресселя) и биохимической (сероводород, мочевина, глюкоза, лактоза) идентификации. Для предварительной идентификации используют О1- сальмонеллезный фаг, к которому чувствительно до 98% сальмонелл.

Для идентификации культур в РА используют поливалентные и моновалентные О-, Н- и Vi- антисыворотки. Сначала используют поливалентные адсорбированные О- и Н- сыворотки, а затем- соответствующие моновалентные О- и Н- сыворотки. Для идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов используют антитела к антигену О2 (S.paratyphi A), O4 (S.paratyphi B), O9 (S.typhi). Если культура не агглютинируется О- сывороткой, ее нужно исследовать с Vi- сывороткой. Для быстрого выявления сальмонелл используют поливалентные люминесцентные сыворотки.

Серологические исследования проводят для диагностики, а также выявления и дифференциации различных форм носительства. Применяют РА (реакцию Видаля) с О- и Н- диагностикумами и РПГА с применением поливалентных эритроцитарных диагностикумов, содержащих полисахаридные антигены серогрупп А,В,С,Д и Е и Vi- антиген.

Лечение - антибиотики (левомицетин и др.). Часто выявляют резистентные к антибиотикам штаммы. Необходимо определять антибиотикорезистентность выделенных культур.

Специфическая профилактика может применяться преимущественно в отношении брюшного тифа. Применяют химическую сорбированную брюшнотифозную моновакцину. Вакцинацию в настоящее время применяют преимущественно по эпидемическим показаниям.

Лекция №7. Эшерихии и шигеллы

Род Escherichia.

Эшерихии - наиболее распространенные аэробные бактерии кишечника, способные при определенным условиях вызывать обширную группу заболеваний человека, как кишечной (диарея), так и внекишечной (бактеремия, инфекции мочевыводящих путей и др.) локализации. Основной вид - E.coli (кишечная палочка) - самый распространенный возбудитель инфекционных заболеваний, вызываемых энтеробактериями. Этот возбудитель является показателем фекального загрязнения, особенно воды. Коли - титр и коли - индекс часто использовали как санитарные показатели. Эшерихии входят в состав микрофлоры толстого кишечника млекопитающих, птиц, пресмыкающихся и рыб.

Культуральные свойства. На жидких средах E.coli дает диффузное помутнение, на плотных средах образует S- и R- формы колоний. На основной для эшерихий среде Эндо лактозоферментирующие кишечные палочки образуют интенсивно красные колонии с металлическим блеском, не ферментирующие - бледно- розовые или бесцветные колонии с более темным центром, на среде Плоскирева - красные с желтоватым оттенком, на среде Левина - темно- синие с металлическим блеском.

Биохимические свойства. Кишечная палочка в большинстве случаев ферментирует углеводы (глюкозу, лактозу, маннит, арабинозу, галактозу и др.) с образованием кислоты и газа, образует индол, но не образует сероводород, не разжижает желатин.

Антигенная структура. Какие - либо существенные морфологические различия между патогенными и непатогенными кишечными палочками не обнаружены. Их дифференциация основана на изучении антигенных свойств. Среди поверхностных антигенов выделяют полисахаридные О- антигены, жгутиковые Н- антигены и капсульные полисахаридные К- антигены. Известно более 170 вариантов О- антигенов (это соответствует принадлежности возбудителя к определенной серогруппе) и 57 - Н- антигенов (принадлежность к серовару). В состав диареегенных (вызывающих диарею) кишечных палочек входят 43 О- группы и 57 ОН- вариантов.

Основные факторы патогенности диареегенных E.coli.

1. Факторы адгезии, колонизации и инвазии, связанные с пилями, фимбриальными структурами, белками наружной мембраны. Они кодируются плазмидными генами и способствуют колонизации нижних отделов тонкой кишки.

2. Экзотоксины: цитотонины (стимулируют гиперсекрецию клетками кишечника жидкости, нарушают водно - солевой обмен и способствуют развитию диареи) и энтероцитотоксины (действуют на клетки стенки кишечника и эндотелия капилляров).

3. Эндотоксин (липополисахарид).

В зависимости от наличия различных факторов патогенности диареегенные кишечные палочки разделены на пять основных типов: энтеротоксигенные, энтероинвазивные, энтеропатогенные, энтерогеморрагические, энтероадгезивные.

4. Для патогенных кишечных палочек характерна выработка бактериоцинов (колицинов).

Энтеротоксигенные E.coli имеют высокомолекулярный термолабильный токсин, схожий по действию с холерным, вызывают холероподобную диарею (гастроэнтериты у детей младшего возраста, диарею путешественников и др.).

Энтероинвазивные кишечные палочки способны проникать и размножаться в клетках эпителия кишечника. Вызывают профузную диарею с примесью крови и большим количеством лейкоцитов (показатель инвазивного процесса) в испражнениях. Клинически напоминает дизентерию. Штаммы имеют некоторое сходство с шигеллами (неподвижные, не ферментируют лактозу, обладают высокими энтероинвазивными свойствами).

Энтеропатогенные E.coli - основные возбудители диареи у детей. В основе поражений - адгезия бактерий к эпителию кишечника с повреждением микроворсинок. Характерна водянистая диарея и выраженное обезвоживание.

Энтерогеморрагические кишечные палочки вызывают диарею с примесью крови (геморрагический колит), гемолитико - уремический синдром (гемолитическая анемия в сочетании с почечной недостаточностью). Наиболее частый серотип энтерогеморрагических кишечных палочек - О157: Н7.

Энтероадгезивные E.coli не образуют цитотоксины, слабо изучены.

Эпидемиология. Основной механизм распространения диареегенных кишечных палочек - фекально - оральный. Заражение может происходить через пищу, воду, при уходе за животными. Поскольку эшерихии обитают в кишечниках многих видов животных, конкретный источник заражения установить сложно. Контактный путь заражения может быть в закрытых заведениях. Энтеропатогенные и энтероинвазивные E.coli - наиболее частые причины внутрибольничных вспышек эшерихиозов.

Лабораторная диагностика. Основным подходом является выделение чистой культуры на дифференциально - диагностических средах и ее идентификация по антигенным свойствам. Ставят РА с набором поливалентных ОК (к О- и К- антигенам) сывороток, затем - адсорбированных О- сывороток и прогретыми при 100 градусах Цельсия (для разрушения К- антигенов) культурами.

Биохимическая дифференциация имеет дополнительное значение. Идентификация диареегенных типов возможна при выявлении специфических маркеров (энтерогеморрагические кишечные палочки не ферментируют сорбит, а серовар О157: Н7 не проявляет бета - глюкуронидазной активности).

Род Shigella.

Шигеллы - кишечные патогены человека и приматов, которые вызывают бактериальную дизентерию или шигеллезы. В соответствии с антигенной структурой О- антигена и биохимическими свойствами известные серотипы шигелл разделяют на четыре вида или серогруппы - S.dysenteriae (серогруппа А), S.flexneri (серогруппа В), S.boydii (серогруппа С) и S.sonnei (серогруппа Д).

По морфологическим признакам шигеллы не отличаются от остальных энтеробактерий. Это неподвидные факультативно - анаэробные грамотрицательные палочки.

Биохимические свойства. Шигеллы по сравнению с другими кишечными бактериями биохимически малоактивны. Не образуют сероводород на трехсахарно - железном агаре, не ферментируют мочевину.

Наименьшей ферментативной активностью обладают штаммы S.dysenteriae (серогруппа А), ферментирующие только глюкозу без газообразования, в отличие от других шигелл этот вид является маннит - отрицательным.

Шигеллы Флекснера ферментируют маннит, образуют индол, но не ферментируют лактозу, дульцит и ксилозу. Серотип Ньюкасл разделен на три биохимических типа. Для шигелл Флекснера более характерен водный путь передачи. вирус возбудитель энтеробактерия патогенез

Шигеллы Бойда (серогруппа С) имеют близкую биохимическую активность, однако ферментируют дульцит, ксилозу и арабинозу. Имеют ряд серотипов, каждый из которых имеет свой главный типовой антиген.

Шигеллы Зонне (серогруппа Д) способны медленно ферментировать лактозу и сахарозу, имеют биохимические типы и фаготипы. Основной путь передачи - пищевой (чаще через молоко и молочные продукты).

Антигенная структура. У шигелл имеются О- и К- антигены. О- антигены имеют эпитопы различной специфичности - от общих для семейства энтеробактерий до типоспецифических. В классификации учитывают только термостабильные групповые (четыре группы или вида - А,В,С и Д) и типоспецифические (деление на серотипы). К термолабильным антигенам относятся К- антигены (они имеются в группах А и С) и фимбриальные антигены (у шигелл Флекснера они близки в антигенном отношении E.coli). Определение антигенной структуры необходимо для окончательной идентификации.

Эпидемиология. Шигеллы достаточно устойчивы во внешней среде. Источник инфекции - человек с различными формами клинического проявления шигеллезов. Механизм заражения - фекально - оральный. Для различных видов шигелл характерны преобладающие пути передачи (контактно- бытовой - для S.dysenteriae, пищевой - для S.sonnei, водный - для S.flexneri). Для эпидемического процесса характерна изменение структуры циркулирующих популяций возбудителей - смена ведущих видов, биоваров, сероваров, что связано как с изменениями популяционного иммунитета, так и с изменениями свойств возбудителя, особенно с приобретением различных плазмид (R, F, Col и др.). Инфицирующая доза - порядка 200 - 300 шигелл. Более легкое течение имеет дизентерия, вызванная шигеллами Зонне.

Факторы патогенности и патогенез поражений. Главная биологическая характеристика шигелл - способность внедряться в эпителиальные клетки, размножаться в них и вызывать их гибель. Формирование очага в слизистой нисходящего отдела толстого кишечника (сигмовидная и прямая кишки) носит циклический характер: адгезия, колонизация, внедрение шигелл в цитоплазму энтероцитов, размножение, разрушение и отторжение эпителиальных клеток, выход шигелл в просвет кишечника, снова адгезия и т.д.

Роль факторов адгезии и колонизации выполняют пили, белки наружной мембраны, ЛПС, ферменты - нейраминидаза, муциназа, гиалуронидаза (разрушают слизь).

Шигеллы имеют целый ряд факторов инвазии и устойчивости к действию механизмов защиты (К- антиген, ЛПС и др.), контролизуемых хромосомными генами шигелл и плазмидами.

Шигеллы имеют различные токсины. Они имеют эндотоксин и шигаподобные цитотоксины (SLT-1, SLT-2). Цитотоксины обусловливают разрушение клеток, энтеротоксин - диарею, эндотоксин - общую интоксикацию. Токсин Шига вызывает нарушение синтеза белка, всасывания ионов натрия и воды, приток жидкости в очаг воспаления.

Наиболее типичные признаки дизентерии - понос, тенезмы (болезненные спазмы прямой кишки) и частые позывы, общая интоксикация. Характер стула определяется степенью поражения толстого кишечника.

Постинфекционный иммунитет - прочный, типоспецифический.

Лабораторная диагностика. Основной метод диагностики - бактериологический. Производят посев испражнений на дифференциально - диагностические среды Эндо и Плоскирева для получения изолированных колоний. Чистые культуры изучают по биохимическим свойствам, идентификацию проводят в РА с поли- и моновалентными сыворотками. Если выделенная культура обладает биохимическими свойствами шигелл, но не агглютинирует сыворотки к О- антигенам, ее нужно прокипятить 30 минут для разрушения термолабильных К- антигенов, часто препятствующих агглютинации шигелл серогрупп А и С (т.е. имеющих К- антигены), и снова исследовать в РА.

Для серологической диагностики используют РПГА с групповыми эритроцитарными диагностикумами.

Лекция №8. Представители родов Vibrio, Campylobacter, Helicobacter

Род Vibrio.

Семейство Vibrionaceae объединяет подвижные, изогнутые палочковидные бактерии, обладающие полярными жгутиками. Эволюционно происходят из водных бактерий, широко распространены в пресной и морской воде, у беспозвоночных и позвоночных хозяев. Патогенные для человека виды относят к родам Vibrio, Aeromonas и Plesiomonas.

Для рода Vibrio характерны короткие прямые или изогнутые грамотрицательные палочки, подвижные, не образующие спор и капсул, хорошо растущие на обычных средах. Они ферментируют углеводы с образованием кислоты без газа, чувствительны к вибриостатику О/129. Можно культивировать при температуре от плюс 18 до 37^о С, рН 8,6-9,0.

От других родов семейства представители рода Vibrio дифференцируют по биохимическим тестам. Род насчитывает более 25 видов, из них основное значение имеет Vibrio cholerae- возбудитель холеры, а также V.parahaemolyticum, V.vulnificus.

Vibrio cholerae.

Морфология. Холерный вибрион имеет один полярный жгутик, часто напоминает запятую (запятая Коха). Важный диагностический признак - подвижность (определяют микроскопией по методу висячей или раздавленной капли). Морфологически изменчивы. Хорошо окрашиваются водным фуксином Пффейфера и карболовым фуксином Циля.

Культуральные свойства. Факультативный анаэроб. Холерный вибрион неприхотлив к питательным средам. Хорошо размножается на 1% щелочной (рН 8,6-9,0) пептонной воде, опережая бактерии кишечной группы (среда обогащения), образует нежную голубоватую пленку и муть. Для подавления роста протея и некоторых других микроорганизмов используют пептонную воду с добавлением теллурита калия.

На плотных средах холерный вибрион образует гладкие стекловидные, прозрачные с голубоватым оттенком дисковидные колонии вязкой консистенции. Используют щелочной агар, желчно - солевой агар, щелочной агар с кровью, наилучшей является TCBS - агар (агар с тиосульфатом, цитратом, солями желчных кислот и сахарозой).

Биохимические свойства. Холерный вибрион сбраживает с образованием кислоты без газа многие углеводы (глюкозу, сахарозу, маннозу, маннит, лактозу, левулезу, гликоген, крахмал). По отношению к трем сахарам (триада Хейберга) - сахарозе, маннозе и арабинозе вибрионы делят на восемь биохимических групп, холерный вибрион относится к первой группе (разлагает сахарозу и маннозу).

Холерный вибрион разлагает желатин, казеин, свертывает молоко и разлагает белковые препараты до индола и аммиака.

Вид V.cholerae делят на биотипы, серогруппы и серовары.. Основные биотипы - классический (V.cholerae asiaticae) и Эль - Тор (V.cholerae eltor). Серогруппы выделяют по структуре О- антигенов, в основной О1 группе холерных вибрионов выделяют серовары Огава, Инаба и Хикоджима.

Антигенная структура. У холерных вибрионов выделяют термостабильные О- антигены и термолабильные Н- антигены. По структуре О- антигенов выделено 139 серогрупп, биотипы Эль - Тор и классический объединены в 01 группу (типируются 01 - антисывороткой). Изоляты Эль - Тор отличаются гемолитическими свойствами (вызывают гемолиз эритроцитов барана), способностью агглютинировать куриные эритроциты, резистентности к полимиксину, чувствительности к фагам.

О- антиген 01 группы неоднороден и включает общий А- компонент и два типоспецифических - В и С. Соответственно их наличию серовар Огава имеет сочетание АВ, Инаба - АС, Хикоджима - АВС.

Холерный вибрион может переходить из S- в R- форму, не агглютинироваться О- сывороткой. В связи с антигенной структурой для идентификации V.cholerae используют О- сыворотку, OR- сыворотку ( для выявления OR- и R- диссоциантов), типоспецифические сыворотки Инаба (С) и Огава (В). В 90- е годы выявлен новый серовар V.cholerae 0139, не агглютинирующийся вышеуказанными сыворотками, по остальным свойствам мало отличающийся от холерного вибриона 01 группы.

Не типируемые основной 01 сывороткой (т.е. не относящиеся к 01 группе) вибрионы называются неагглютинирующими (НАГ) вибрионами- холероподобными или парахолерными. Они имеют общий с холерным вибрионом Н- антиген, но отличаются по О- антигену.

По Н- антигену выделяют группы А и В, холерные вибрионы входят в группу А. Вирионы группы В (биохимически отличающиеся от холерных) имеют неоднородную структуру О- антигена и подразделяются на шесть серологических подгрупп.

Факторы патогенности холерного вибриона.

1. Подвижность (жгутики) и хемотаксис.

2. Ферменты способствуют адгезии и колонизации, взаимодействию с эпителиальными клетками- муциназа (разжижает слизь), нейтаминидаза (взаимодействие с микроворсинками, создание посадочной площадки), лецитиназа и другие.

3. Эндотоксин - термостабильный липополисахарид, схожий по структуре и свойствам с другими эндотоксинами грамотрицательных бактерий.

4. Экзотоксин - холероген - главный фактор патогенности, термолабильный белок. Синтез холерогена - важнейшее, генетически детерминированное свойство холерного вибриона. Молекула холерогена состоит из двух фрагментов А и В. Собственно токсическую функцию выполняет пептид А₁ фрагмента А. Молекула холерогена распознает рецептор энтероцита, проникает в мембрану клетки, активирует аденилатциклазную систему, накапливающийся циклический АМФ вызывает гиперсекрецию жидкости, Na⁺, HCO₃^-, K⁺, Cl^- из энтероцитов. Это приводит к характерной для холеры диарее, обезвоживанию и обессоливанию организма.

5. У многих вибрионов, в т.ч. не относящихся к 01 группе, имеются различные энтеротоксины.

6. В патогенезе проявлений холеры имеет значение также фактор, повышающий проницаемость капилляров.

Некоторые особенности эпидемиологии. Холера - кишечная инфекция. Основной источник - человек (больной или вибрионоситель), загрязненная вода. Способ заражения - фекально - оральный. Индивидуальная восприимчивость к холере чрезвычайно вариабельна. Характерно большое количество скрытых (стертых) форм, вибрионосительство. Обнаружение возбудителя в воде напрямую связано с наличием больных или бактерионосителей. Холерные вибрионы 01 группы могут длительно находиться в водных экосистемах в виде некультивируемых форм.

Лабораторная диагностика. Холера относится к группе особо опасных инфекций, культивирование ее возбудителя требует соблюдения особого режима биологической безопасности. Основной метод диагностики - бактериологический, включает выделение и идентификацию возбудителя.

Материал для исследования - испражнения и рвотные массы, секционные материалы от погибших, пробы воды и смывы с объектов окружающей среды, пищевые остатки.

Для посева используют жидкие среды обогащения, щелочной МПА, элективные и дифференциально - диагностические среды (лучше TCBS). В качестве транспортной среды наиболее удобна 1% пептонная вода. Подозрительные стекловидные прозрачные колонии пересевают для получения чистой культуры, которую идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности, антигенным свойствам, фаготипируют.

Для ускоренной диагностики применяют иммунолюминесцентный метод, биохимическую идентификацию с набором индикаторных дисков, для обнаружения холерных вибрионов в первичных материалах - РНГА с антительным диагностикумом, для выявления некультивируемых форм - ПЦР, для определения вирулентности и синтеза холерогена - биопробы на кроликах - сосунках, ИФА, ДНК- зонды (выявление фрагмента хромосомы, несущего оперон холерогена).

Специфическая профилактика. Имеются различные вакцины - убитая из сероваров Инаба и Огава, анатоксин холерогена, химическая бивалентная вакцина. Вакцины применяют только по эпидпоказаниям (низкая иммуногенность). Может проводиться антибиотикопрофилактика (превентивная терапия) тетрациклином и другими антибиотиками.

V.parahaemolyticus (парагемолитический вибрион) является галофилом, встречается в морской воде (Японского, Черного, Каспийского и других южных морей). При употреблении морских продуктов, не подвергнутых достаточной термической обработке, этот возбудитель вызывает у людей пищевые токсикоинфекции и дизентерия - подобные заболевания. Вызывает гемолиз на кровяном агаре с повышенной концентрацией хлористого натрия (на 7% NaCl - штаммы с энтеропатогенными свойствами).

V.vulnificus - наиболее патогенный вид для человека из нехолерных вибрионов. Выявляют в морской воде и ее обитателях. Вызывает раневые инфекции, септицемии и другие заболевания. Ферментирует сахарозу и лактозу, на TCBS - агаре образует желтые колонии.

Представители родов Campylobacter и Helicobacter.

Грамотрицательные микроаэрофилы этих двух родов - мелкие, подвижные, не образующие спор, изогнутые (S- образные или похожие на крыло чайки) палочковидные бактерии. Виды, составляющие род Helicobacter, в том числе H.pylori - возбудитель язвенной болезни человека, выделены из рода Campylobacter.

Род Campylobacter

Этот род включает 13 видов спиральных бактерий, имеющих один и более завитков. Кампилобактеры - подвижные, обладающие полярными жгутиками (или жгутиком) и винтообразным движением, микроорганизмы. Они не ферментируют и не окисляют углеводы, капрофилы и микроаэрофилы , т.е. требуют повышенной концентрации СО₂ и пониженной - О₂.

Род включает виды, патогенные для человека и теплокровных животных. Заболевания, ими вызываемые - кампилобактериозы - острые кишечные заболевания, протекающие с поражением желудочно - кишечного тракта. Кампилобактеры часто выделяют из кишечника, ротовой полости и органов мочеполовой системы теплокровных.

Выделяют группу C.jejuni (включает этот вид, а также C.coli, C.lari) или термофильных кампилобактерий. Они отличаются высоким температурным оптимумом роста (+42⁰С).

Среди мезофильных кампилобактерий с оптимумом роста при +37⁰С существенную роль в патологии человека имеет C.fetus (вызывает артриты, менингиты, васкулиты, аборты), а также имеется ряд условно - патогенных видов (C.concisus и C.sputorum - в ротовой полости, C.fennelliae, C.cinaedi и C.hyointestinalis - в толстом кишечнике).

Культуральные свойства. Для кампилобактеров нужны специальные газовые смеси для создания микроаэрофильных условий, рН - 7,0-7,2, мезофильные условия (+42⁰С - для термофилов, +37⁰С - для остальных). Используют специальные питательные среды (мясные, печеночные, кровяные) с добавлением селективных антибиотиков. Для получения более чистых проб для посевов (чаще исследуют копрофильтраты!) можно использовать фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,65 мкм. На плотных средах образуют два типа колоний - “расползающиеся” с неровными краями или блестящие выпуклые с ровными краями, колонии мелкие.

Биохимические свойства. Инертны к углеводам, редуцируют нитраты, оксидаза - положительны, энергию получают за счет аминокислот и трикарбоновых кислот. Дифференциация видов по биохимическим свойствам основана на гидролизе гиппурата (C.jejuni и C.coli), чувствительности к налидиксовой кислоте (C.jejuni и C.lari), образовании сероводорода и др.

Антигенная структура. Кампилобактеры имеют О- , Н- и К- антигены. Основное значение для серотипирования имеют термостабильные О- антигены.

Эпидемиологические особенности. Кампилобактеры распространены у различных видов млекопитающих и птиц. Основной путь передачи - пищевой. Характерна преимущественно летняя сезонность.

Основные патогенетические факторы. Кампилобактеры характеризуются высокой адгезивной и инвазивной активностью, быстрой колонизацией верхних отделов тонкого кишечника. Важнейшими факторами адгезии являются жгутики и специфические поверхностные адгезины. У этих бактерий имеется эндотоксин, термолабильный энтеротоксин.

Клинические проявления - энтероколит.

Лабораторная диагностика. Микроскопический метод - окраска 1% водным раствором основного фуксина 10- 20 секунд - выявляют S- образные короткие цепочки, “крылья чайки”. Основной метод - бактериологический - посев испражнений. Культуры идентифицируют по совокупности признаков.

Helicobacter pylori.

Язвенная болезнь - заболевание, которое характеризуется наличием язвенного дефекта в слизистой желудка или двенадцатиперсной кишке. Открытие H.pylori обусловило переворот в представлениях об этиологии, патогенезе, лечении и профилактике язвенной болезни. Язвенная болезнь практически в 100% ассоциирована с хеликобактером пилори. Существенную роль имеют также стрессовые факторы и психологические особенности больных, а также генетические факторы в развитии болезни.

Морфологические и культуральные свойства - аналогичны Campylobacter. Предпочитает шоколадный агар.

Биохимические свойства. Имеет уреазу, оксидаза- и каталаза- положителен.

Антигенные свойства. Имеет О- и Н- антигены.

Патогенез поражений. Хеликобактеры проникают через слой слизи (чаще в антральной части желудка и двенадцатиперсной кишке), прикрепляются к эпителиальным клеткам, проникают в крипты и железы слизистой оболочки. Антигены бактерий (в первую очередь ЛПС) стимулируют миграцию нейтрофилов и вызывают острое воспаление. Хеликобактеры локализуются в области межклеточных ходов, что обусловлено хемотаксисом на мочевину и гемин (разрушение гемоглобина эритроцитов в микроциркуляторном русле). Под действием уреазы хеликобактеров мочевина расщепляется до аммиака, с действием которого связано повреждение слизистой оболочки желудка и двенадцатиперсной кишки. Многие ферменты (муциназа, фосфолипаза и др.) также могут стимулировать нарушения целостности слизистых.

К факторами патогенности H.pylori в первую очередь относят факторы колонизации (адгезию, подвижность), факторы персистенции и факторы, вызывающие заболевание. Ключевые факторы в тропизме и патогенности H.pylori включают механизмы адгезии и секреции бактериальных токсинов. Представлены доказательства ведущей роли Lewis B антигена как рецептора для адгезии. Кроме них имеют значение муцины желудка и сульфатиды слизистой желудка. Выявлен белок Bab A возбудителя (адгезин), который позволяет микроорганизму связываться с групповым антигеном крови Lewis B, присутствующим на поверхности клеток эпителия желудка. Другими факторами патогенности являются cag A (цитотоксин- ассоциированный ген) и vac A (вакуолизирующий цитотоксин). Штаммы, экспрессирующие эти маркеры вирулентности, относятся к штаммам первого типа, которые ассоциированы с повышенным ульцерогенным и воспалительным потенциалом, в отличии от штаммов второго типа, не имеющих этих факторов.

Присутствие всех трех факторов (Bab A, cag A, vacA) является существенным для проявления патогенных свойств H.pylori (триплет - позитивные штаммы). Повреждающее действие на слизистую может быть связано как с прямым действием бактериальных токсинов, так и с опосредованным влиянием через иммунную систему. Длительная персистенция возбудителя связана с рядом механизмов, позволяющих преодолевать защитные барьеры слизистой, и способностью формирования кокковых, не обладающих патогенным потенциалом, форм.

H.pylori не всегда приводит к развитию язвенной болезни, однако при язвенной болезни этот возбудитель выявляют постоянно. Факторы, определяющие ульцерогенность H.pylori, усиленно изучаются.

Лабораторная диагностика должна быть комплексной, основанной на нескольких тестах. Методы выявления могут быть инвазивными (связанными с необходимостью взятия биоптата слизистой) и неинвазивными (косвенными).

Основные методы выявления H.pylori в биоптатах слизистой.

1.Микроскопические методы (окраска гематоксилином - эозином, акридиновым оранжевым, по Граму, водным фуксином, инпрегнация серебром; фазово - контрастная микроскопия с определением подвижности).

2.Определение уреазной активности.

3.Выделение и идентификация возбудителя на плотных средах (чаще кровяных). Посевы осуществляют на кровяной агар, кровяной агар с амфотеррицином, эритрит - агар с амфотеррицином. Культивируют 5-7 суток при 37^о С в микроаэрофильных, аэробных и анаэробных условиях. Принадлежность определяют по морфологии микроорганизмов и их колоний, винтообразной подвижности, росту в микроаэрофильных условиях и отсутствию роста в аэробных и анаэробных условиях и при температурах +25 и +42^о С, по наличию оксидазной, каталазной и уреазной активности.

...