Основы микробиологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего пРофессионального образования

«российский государственный аграрный университет - МСха имени К.А. Тимирязева» (ФГБОУ ВПО ргау - МСХА имени К.А. Тимирязева)

Кафедра микробиологии и иммунологии

Контрольная работа

по дисциплине: «Микробиология»

Шифр контрольной работы: 99

Москва 2015

1. Строение клеточной стенки бактерий. Грамположительные и грамотрицательные бактерии. Значение окраски по Граму для диагностики микроорганизмов

бактерия микроорганизм ризосфера брожение

Важным и обязательным структурным элементом подавляющего большинства прокариотных клеток является клеточная стенка. Она располагается под капсулой или слизистым чехлом или же непосредственно контактирует с окружающей средой (у клеток, не содержащих этих слоев клеточной оболочки).

Клеточная стенка -- один из главных элементов структуры бактериальной клетки, она обладает определенной ригидностью, т. е. жесткостью, и вместе с тем эластичностью -- может изгибаться. Ее можно разрушить ультразвуком, ферментом лизоцимом и другими способами. В случае разрушения клеточной стенки содержание клетки -- цитоплазма с включениями, окруженная цитоплазматической мембраной, -- приобретает шаровидную форму.

Такую округлившуюся клетку, образовавшуюся после удаления клеточной стенки у бактерии, называют протопластом, а если оболочка разрушена не полностью -- сферопластом. Отсюда следует, что стенка придает бактериальной клетке определенную форму.

Клеточная стенка имеет и другие функции. Она защищает внутреннее содержимое клетки от действия механических и осмотических сил внешней среды, ей принадлежит важная роль в регуляции роста и деления бактерий, распределении генетического материала.

На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50 % сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой. Концентрация солей в клетке, как правило, намного выше, чем в окружающей среде, и поэтому между ними существует большое различие в осмотическом давлении. Клеточная стенка чисто механически защищает клетку от проникновения в нее избытка воды.

По строению и химическому составу клеточная стенка прокариот резко отличается от таковой эукариотных организмов. В ее состав входят специфические полимерные комплексы, которые не содержатся в других клеточных структурах. Химический состав и строение клеточной стенки постоянны для определенного вида и являются важным диагностическим признаком. В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки бактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс. При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются (этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым X. Грамом (Ch.Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых бактерий положительная реакция при окрашивании описанным способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки.

Таблица 1

Обозначения «+» - присутствуют, «-» - отсутствуют, «+ - » - присутствуют, но не у всех видов

Клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных прокариот резко различаются как по химическому составу (таблица 1), так и по ультраструктуре (рис. 1).

В состав клеточной стенки прокариот входят семь различных групп химических веществ, при этом пептидогликан (структурный полимер, являющийся основным опорным элементом клеточной стенки) присутствует только в клеточной стенке. У грамположительных бактерий он составляет основную массу вещества клеточной стенки (от 40 до 90 %), у грамотрицательных -- содержание пептидогликана значительно меньше (1 --10 %). Клеточная стенка цианобактерий, сходная с таковой грамотрицательных бактерий, содержит от 20 до 50 % этого гетерополимера.

Под электронным микроскопом клеточная стенка грамположительных бактерий выглядит как гомогенный электронно-плотный слой, толщина которого колеблется для разных видов от 20 до 80 нм. У грамотрицательных бактерий обнаружена многослойная клеточная стенка. Внутренний электронно-плотный слой толщиной порядка 2--3 нм состоит из пептидогликана. Снаружи к нему прилегает, как правило, волнистый слой (8--10 нм), имеющий характерное строение: две электронно-плотные полосы, разделенные электронно-прозрачным промежутком. Такой вид характерен для элементарных мембран. Поэтому трехконтурный внешний компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий получил название наружной мембраны.

Рис. 1 Схема молекулярной организации стенки грамположительных (А) и грамотрицательных (Б и В): 1 - плазматическая мембрана с билипидным слоем и глобулярными белками; 2 - пептидогликаны; 3 - тейхоевые кислоты; 4 - белки; 5 - белковые глобулы; 6 - периплазматическое пространство; 7 - наружная мемебрана; 8 - липопротеины; 9 - белки наружной мембраны; 10- липополисахариды; 11 - углеводные остатки; 12 - липопротеиновые комплексы наружной мембраны.

Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране (ЦПМ) в отличие от клеточной стенки грамотрицательных видов, компоненты которой (пептидогликановый слой и наружная мембрана) разделены электронно-прозрачным промежутком и четко отделены аналогичным образом от ЦПМ. Пространство между цитоплазматической и наружной мембранами получило название периплазматического. Оно, как можно видеть из строения клеточных стенок обеих групп бактерий, характерно только для грамотрицательных форм (рис. 1).

Опорный скелет бактериальной стенки состоит из однородного полимера, обозначаемого как мукопептид, глюкозаминопептид, гликопептид, пептидогликана или муреин (лат. мurus - стенка). В настоящее время общеприняты два последних наименования.

Эта макромолекула - гетерополимер, построенный из цепочек, в которых чередуются остатки N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты (N-ацетилглюкозаминлактата), соединенные между собой Я-1,4-гликозидными связями. Такие неразветвленные гетерополимерные цепи образуют основу муреина. Остатки мурамомвой кислоты через лактильные группы соединены пептидной связью с аминокислотами. К типичным аминокислотам муреина относятся L-аланин, D-глутаминовая кислота, мезо-диаминопимелиновая кислота или L-лизин и D-аланин. Диаминокислоты мезо- (или LL-) диаминопимелиновая кислота и L-лизин играют большую роль в межмолекулярных сшивках, так как образуют пептидные связи с участием обеих аминогрупп и, таким образом, могут связать две гетерополимерные цепи между собой (рис. 2). Место диаминопимелиновой кислоты или лизина могут занять орнитин или диаминомасляная кислота. Пептидными мостиками гетерополимерные цепи связаны между собой в мешкообразную гигантскую молекулу - муреиновый мешок.

Особого внимания заслуживает то, что в бактериальной стенке содержатся структуры и вещества, которых нет у животных и растений: таковы, например, чередующаяся последовательность N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты; не встречающаяся в составе белков мезо-диаминопимелиновая кислота; D-формы аланина и глутаминовой кислоты. Эти структурные элементы составляют ахиллесову пяту бактерий, используемую врачами в борьбе с инфекцией. По компонентам и структуре клеточной стенки и биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие только на бактериальные стенки и на процесс их синтеза, должны быть безвредными для высших организмов.

Наличие в клеточных стенках пептидогликанового слоя характерная особенность всех прокариот. Исключение составляют только архебактерии и немногие другие группы и виды.

Рис. 2.Структура муреина Escherichia coli. Гетерополимерные цепочки, состоящие из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и N-ацетилмурамовой кислоты (N-АцМур), связаны между собой пептидными мостиками. Слева - детальное строение фрагмента, изображенного справа в рамке. Треукольниками отмечены связи , расщепляемые лизоциумом (мурамидазой) и специфической муроэндопептидазой. Справа внизу - схематическое перспективное изображение структуры однослойного поперечного муреинового мешка, состоящего из N-АцГлю (G) и N-АцМур (М). m-Dpm - мезо-диаминопимелиновая кислота.

Муреиновый мешок выполняет функцию опорного каркаса клеточной стенки. На нем откладываются и его инкрустируют различные другие вещества. По строению этого каркаса, а также по содержанию других веществ в клеточной стенке грамположительные бактерии отличаются от грамотрицательных.

Клеточная стенка грамположительных бактерий. У грамположительных бактерий доля муреиновой сетки составляет 30-70% сухой массы клеточной стенки (толщиной в 40 слоев). Вместо м-диаминопимелиновой кислоты часто содержатся LL-диаминопимелиновая кислота или лизин. У Staphylococcus aureus тетрапептидные боковые цепи мурамовой кислоты связаны между собой межпептидными (например, пентаглициновыми) цепочками. Участвующие в образовании таких структур аминокислоты варьируют от вида к виду. Видоспецифическое строение опорного каркаса представляет собой хороший таксономический признак. В клеточной стенке грамположительных бактерий полисахариды, если они вообще имеются, связаны между собой ковалентно. Содержание белков невелико. Характерная особенность - наличие тейхоевых кислот (рис. 3); это цепи, состоящие из 8-50 остатков глицерола или рибитола, связанных между собой фосфатными мостиками. Некоторые из тейхоевых кислот содержат эритритол или маннитол. Тейхоевые кислоты, вероятно, через фосфат связаны с муреином по типу амида.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий. У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть однослойная (рис. 4) и составляет менее 10% сухой массы клеточной стенки (у Escherichia coli). Муреин содержит только мезодиаминопимелиновую кислоту и не содержит лизина; межпептидные мостики отсутствуют. Строение муреинового мешка у всех грамотрицательных бактерий одинаково.

У грамотрицательных бактерий строение клеточной стенки намного сложнее, чем у грамположительных (рис. 4). В ее состав входит гораздо большее число макромолекул разного химического типа. Пептидогликан образует только внутренний слой клеточной стенки, неплотно прилегая к ЦПМ. Для разных видов грамотрицательных бактерий содержание этого гетерополиме-ра колеблется в широких пределах. У большинства видов он образует одно- или двухслойную структуру, характеризующуюся весьма редкими поперечными связями между гетерополимерными цепями. Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клеточной стенки -- наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липополисахарида (рис. 4). Специфическим компонентом наружной мембраны является липополисахарид сложного молекулярного строения, занимающий около 30--40 % ее поверхности и локализованный во внешнем слое.

Белки наружной мембраны можно разделить на основные и минорные. Основные белки представлены небольшим числом различных видов, но составляют почти 80 % всех белков наружной мембраны. Одна из функций этих белков -- формирование в мембране гидрофильных пор диаметром примерно 1 нм, через которые осуществляется неспецифическая диффузия молекул с массой до 600--900 Да (Да -- дальтон, или единица атомной массы, равен 1,66033-1027 кг.). Это означает, что через такие поры могут проходить сахара, аминокислоты, небольшие олигосахариды и пептиды. Белки, пронизывающие наружную мембрану насквозь и образующие гидрофильные поры, называют поринами (рис. 4). Минорные белки наружной мембраны представлены гораздо большим числом видов. Их основная функция -- транспортная и рецепторная. Примером минорных белков могут служить белки, ответственные за специфический транспорт в клетку железосодержащих соединений.

Рис. 3. Структура грамположительной клеточной стенки. ЦПМ - цитоплазматическая мембрана. ПГ - пептидогликан. ЛТК - липотейхоевые кислоты

Рис. 4. Структура грамотрицательной клеточной стенки. ВМ - внешняя мембрана (содержит фосфолипиды на внутренней поверхности и липополисахариды - на внешней).ПГ - пептидогликан. ЦПМ - цитоплазматичеукая мембрана. ЛПС - липополисахарид, состоит из липидной части, которая обращена внутрь внешней мембраны и формирует ее гидрофобную область, и полисахаридной части, которая обращена во внешнюю среду. ЛП -липопротеиды.

Помимо слоев клеточной стенки, типичных для большинства грамотрицательных бактерий, у некоторых представителей этой группы обнаружены дополнительные слои разной электронной плотности, располагающиеся с внешней стороны от наружной клеточной мембраны. Однако до настоящего времени не ясно, относятся ли они к клеточной стенке, являясь результатом ее последующего усложнения, или же представляют собой структурные элементы многослойного чехла.

Некоторые скользящие бактерии (миксобактерии, флексибактерии) способны в процессе перемещения по твердому субстрату периодически менять форму клеток, например путем изгибания, что говорит об эластичности их клеточной стенки и в первую очередь ее пептидогликанового слоя. Электронно-микроскопическое изучение, однако, обнаружило у них клеточную стенку, типичную для грамотрицательных бактерий. Наиболее вероятное объяснение гибкости клеточной стенки этих бактерий -- чрезвычайно низкая сшитость ее пептидогликанового компонента.

Обнаружены прокариоты, клеточная стенка которых по структуре и химическому составу резко отличается от описанных выше типов. Они принадлежат к группе архебактерий. Клеточные стенки метанобразующих архебактерий содержат пептидогликан особого химического строения. У других представителей этой группы клеточная стенка состоит исключительно из кислого гетерополисахарида, а у некоторых экстремально галофильных, метанобразующих и ацидотермофильных архебактерий -- только из белка. Архебактерии с клеточной стенкой белковой природы не окрашиваются по Граму, остальные типы архебактериальной клеточной стенки дают грамположительную реакцию.

При воздействии определенными химическими веществами оказалось возможным получать в лаборатории из разных видов бактерий формы с частично (сферопласты) или полностью (протопласты) отсутствующей клеточной стенкой. Существовать они могут только в условиях, когда осмотическое давление питательной среды сбалансировано с осмотическим давлением внутри клетки. В благоприятных условиях сферопласты и протопласты проявляют определенную метаболическую активность, но утрачивают способность к размножению. Прокариоты, не содержащие клеточной стенки, обнаружены и в природе. Это группа микоплазм, сапрофитов и внутриклеточных паразитов растений, животных и человека.

Значение окраски по Граму для диагностики микроорганизмов.

Тест Грама классифицирует микроорганизмы и позволяет провести разделение микроорганизмов, по критерию строения стенки клетки. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана (грамположительные), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Грамму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма -- розовый.

Так например, окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак (биологический сигнал). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

2. Маслянокислое брожение. Возбудители и ход процесса

Масляная кислота (бутират), н-бутанол, ацетон, 2-пропанол и ряд других органических кислот и спиртов являются типичными продуктами сбраживания углеводов анаэробными спорообразующими бактериями Clostridium.

Род Clostridium относится к семейству Bacillaceae. Были открыты Л. Пастером в 1861 г. Ученый обнаружил, что некоторые представители данного рода сбраживают углеводы с образованием масляной кислоты. Сейчас среди представителей Clostridium насчитывается более 80 видов бактерий. Они имеют палочковидные клетки, обычно подвижны, передвигаются при помощи перитрихальных жгутиков. У видов рода образуются споры, имеющие овальную или сферическую форму; они терморезистентны. Как правило, споры раздувают клетку (рис. 38). Грамположительные. Облигатные анаэробы. Род включает психрофильные, мезофильные и термофильные виды. Температурный оптимум для роста большинства мезофильных видов лежит в диапазоне 30--40 °С. Для термофильных видов температурный оптимум составляет 60--75 °С. Оптимальная реакция среды для Clostridium -- нейтральная или слабощелочная. Хемоорганогетеротрофы. Clostridium сбраживают сахара, многоатомные спирты, аминокислоты, органические кислоты, пурины и пиримидины, другие органические соединения. Ряд видов способен к фиксации молекулярного азота атмосферы. Места обитания Clostridium -- почва, водоемы, а также пищеварительный тракт человека и животных. Все виды рода объединены в группы в зависимости от способности сбраживать те или иные органические соединения.

Первая группа -- сахаролитические виды Clostridium, сбраживающие растворимые углеводы, крахмал или пектин с образованием бутирата, ацетата, СО₂ и Н₂. Брожение при участии некоторых микроорганизмов группы приводит к образованию из Сахаров дополнительных нейтральных соединений (бутанола, пропанола, ацетона, небольших количеств этанола). В группу входят бактерии, вызывающие маслянокислое и ацетонобутиловое брожения: С. butyriсит, С. pasteurianum, С. tyrobutyricum, С. butylicum, С. acetobutylicum и др. Возможно, к ней можно отнести и ряд видов Clostridium -- высокоспециализированных агентов анаэробного разрушения целлюлозы, причем главные конечные продукты брожения -- этанол, ацетат и сукцинат, СО₂ и Н₂.

Вторая группа -- протеолитические виды Clostridium, сбраживающие аминокислоты. Обладают сильными протеолитическими свойствами и способны к интенсивному гидролизу белков с последующим сбраживанием аминокислот. Рост микроорганизмов в средах с белком сопровождается образованием аммиака, СО₂, Н₂, жирных кислот и большого количества летучих соединений с неприятным запахом. К группе относятся виды: С. sporogenes, С. регfringens, С. histolyticum, С. botulinum и др. Многие представители рода Clostridium, сбраживающие аминокислоты, способны также к сбраживанию углеводов.

Третья группа -- виды Clostridium, сбраживающие азотсодержащие циклические соединения -- пурины и пиримидины. Пурины (гуанин, гипоксантин, ксантин и др.) под влиянием С. acidiurici и С. cylindrosporum превращаются в аммиак, ацетат и СО₂. С. uraciliсит и С. oroticum сбраживают пиримидины, при этом урацил распадается до В-аланина, СО₂ и NH₃, а оротовая кислота -- до уксусной кислоты, СО₂ и NH₃.

Четвертая группа включает всего один вид -- С. kluyveri, сбраживающий смесь этанола с ацетатом до бутирата и капроновой кислоты, а также небольшого количества водорода.

Clostridium сильно различаются в отношении субстратов, которые они могут использовать и сбраживать. Некоторые виды мало разборчивы и используют широкий круг веществ, другие узко специализированы и способны сбраживать лишь один или несколько субстратов. В целом же Clostridium доступно множество различных природных соединений. Они способны разлагать полисахариды (крахмал, гликоген, целлюлозу, гемицеллюлозу, пектины), нуклеиновые кислоты, белки, аминокислоты, пурины и пиримидины.

Рис. 5 Clostridium butyricum. Увел. X 3500

По способности использовать различные субстраты сlostridium можно подразделить на ряд групп. Сахаролитические - расщепляют преимущественно полисахариды и сахара. Пептолитические - расщепляют белки, пептоны и аминокислоты.

По преобладанию тех или иных конечных продуктов маслянокислое брожение подразделяют на истинно маслянокислое брожение (брожение глюкозы, крахмала), ацетонобутиловое брожение, брожение пектиновых веществ.

Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (как правило, содержатся в 90% почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений и т.д.

Характерная особенность маслянокислых бактерий - способность накапливать в клетках гранулезу перед образованием спор.

Таблица 2. Виды бактерий участвующие в маслянокислом брожении

Типичный представитель маслянокислых бактерий -- Clostridium butyricum (рис. 5). Это крупная палочка (1--2 х 10 мкм). Молодые клетки подвижны, на более поздних стадиях развития они теряют жгутики, приобретают веретенообразную форму и накапливают запасное питательное вещество -- полисахарид гранулезу. При образовании спор клетки приобретают веретеновидную форму, иногда форму барабанной палочки. Источником углерода для маслянокислых бактерий могут служить моно- и дисахариды, некоторые полисахариды (декстрин, крахмал), лактат и пируват, маннит, глицерин и др. В сложных белковых средах при отсутствии сбраживаемого углевода маслянокислые бактерии растут плохо или не растут вовсе. Источником азота для них служат разнообразные вещества: аминокислоты, аммиачные соединения и даже молекулярный азот.

Маслянокислое брожение начинается с трансформации сахаров в пируват по пути Эмбдена--Мейергофа--Парнаса. Конечные продукты из пирувата образуются в цепи последовательных реакций, катализуемых несколькими ферментными системами (Рис. 6).

Рис.6 Пути превращения пирувата в маслянокислом брожении, осуществляемом Clostridium butyricum: Ф₁ - пируват: ферродоксин-оксидоредуктаза; Ф₂ - ацетил КоА-трансфераза (тиолаза); Ф₃ - в-оксибутурил-КоА-дегидрогеназа; Ф₄ - кротоназа; Ф₅- бутирил-КоА-дегидрогеназа; Ф₆ - КоА-трансфераза; Ф₇ - фосфотрансацетилаза; Ф₈ - ацетаткиназа; Ф₉ - гидрогеназа; Фд_ок - окисленный; Фд • Н₂ - восстановленный ферродоксин; Фн - неорганический фосфат.

Кратко данный процесс выглядит следующим образом:

Пируват превращается в ацетил-КоА, СО₂ и Н₂ при участии ферментной системы: пируват + ферредоксин-оксидоредуктаза. Из ацетил-КоА через ацетилфосфат синтезируется ацетат. Синтез бутирата начинается с конденсации двух молекул ацетил-КоА, возникших в результате декарбоксилирования пирувата, что приводит к образованию ацетоацетил-КоА. Последний восстанавливается в в-оксибутирил-КоА. С отщеплением от молекулы в-оксибутирил-КоА молекулы воды возникает кротонил-КоА, ферментативно восстанавливающийся в бутирил-КоА. Наконец, после гидролиза бутирил-КоА и переноса КоА на ацетат образуется бутират. Превращение ацетил-КоА в ацетилфосфат, а затем в ацетат сопровождается синтезом АТФ. Таким образом, в процессе субстратного фосфорилирования при маслянокислом брожении синтезируется третья молекула АТФ (две другие образовались в процессе гликолитического расщепления глюкозы).

Суммарное уравнение маслянокислого брожения:

4С₆Н₁₂О₆ = ЗСН₃СН₂СН₂СООН + 2СН₃СООН + 8СО₂ + 8Н₂

Среди маслянокислых бактерий есть мезофильные и термофильные формы. Кроме того, род Clostridium включает и патогенные, и сапротрофные виды. К сапротрофным бактериям относят Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Clostridium felsineum; к патогенным -- Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и др. Все они широко распространены в почвах и других естественных субстратах.

Маслянокислое брожение -- не всегда желательный процесс. Например, при его развитии в заквашиваемых кормах белковая часть корма разлагается, а накопившаяся масляная кислота придает продукту неприятный запах. Вместе с тем для некоторых промышленных целей требуется чистая масляная кислота. Ее получают на зaводах, специально сбраживая подготовленные среды чистой культурой маслянокислых бактерий. Образовавшуюся кислоту отделяют и очищают химическим методом.

Ацетонобутиловое брожение. Возбудитель ацетонобутилового брожения -- Clostridium acetobutylicum, он широко распространен в почках, имеет палочковидные клетки (0,6--0,9 х 2,4--4,7 мкм) с перитрихальным жгутикованием. Характерно образование овальных спор, которые располагаются в клетке субтерминально. Бактерии сбраживают моно-, ди- и полисахариды, а также глицерин, маннит, глюконат, пируват и ряд других соединений, фиксируют молекулярный азот. Оптимальная температура для их роста 37--38 °С, оптимальное значение рН среды -- 5,1--6,9. Ацетонобутиловые бактерии способны разлагать белки. Сбраживание углеводов при помощи данных бактерий происходит по пути Эмбдена--Мейергофа--Парнаса. Образовавшийся в результате декарбоксилирования пирувата ацетил-КоА восстанавливается в этанол, идет на синтез ацетата или конденсируется в ацетоацетил-КоА. Последний декарбоксилируется, что приводит к образованию ацетона, или восстанавливается в бутирил-КоА, который может трансформироваться в бутират или восстанавливаться через бутиральдегид до бутанола. Суммарная схема ацетонобутилового брожения:

С₆Н₁₂О₆ > СН₃СН₂СН₂СН₂ОН + СН₃СОСН₃ + СН₃СН₂ОН + CH₃CHOHCH₃ + Н₂ + СО₂

Основные конечные продукты брожения, как видно, -- бутанол, этанол, ацетон, 2-пропанол, а также ацетат и бутират. Однако характер конечных продуктов определяется как видовой принадлежностью используемого для брожения микроорганизма, так и условиями, в которых идет процесс. Установлено, что ацетонобутиловое брожение имеет двухфазный характер. В течение первой фазы наблюдается активный рост бактерий, в среде идет накопление преимущественно органических кислот. Во второй фазе брожения снижается значение рН среды, рост бактерий замедляется, преобладает синтез нейтральных продуктов -- ацетона, бутанола и этанола.

Данный вид брожения широко используют в промышленном производстве ацетона и бутанола из кукурузной муки и другого крахмалистого сырья. Ацетон применяют для производства искусственного шелка и кожи, фотографических пленок, искусственного цемента и других продуктов, бутанол -- при производстве лаков. Газы, образующиеся при ацетонобутиловом брожении, идут на синтез метанола.

3. Микроорганизмы ризосферы и их влияние на растение

Высшие растения, являясь основным источником питательных веществ для преобладающего числа микробного населения почв -- гетеротрофов,-- оказывают существенное влияние на микробные ценозы.

Зоны, непосредственно примыкающие к корням живых растений, являются областями активного развития микроорганизмов. Это связано прежде всего с выделениями из корней (экзосмосом) органических веществ, синтезированных растениями. В зависимости от многих причин интенсивность экзосмоса может быть большей или меньшей. Количество соединений, выделяемых растениями в течение жизни, может составлять до 10% растительной массы и более. При корневом экзосмосе образуются различные органические кислоты -- яблочная, янтарная, винная, лимонная, щавелевая и др. Обнаружены и сахара представленные альдозами и кетозами, а также некоторые аминокислоты (аланин, лизин и др.). Состав продуктов экзосмоса отдельных растений в той или иной степени различается. В выделениях корней присутствуют физиологически активные соединения -- витамины, ростовые вещества, иногда алкалоиды и т. д. Многие из них в некоторых количествах выделяются и надземными органами растений. Поэтому на корнях и надземных органах растений обильно размножаются сапротрофные микроорганизмы. Подобное явление обусловливает образование биологических сообществ, основанных на взаимодействии растений с широким спектром почвенных микроорганизмов, которые поселяются на поверхности корней или проникают в растительные ткани. Получая от растений доступное органическое вещество (корневые выделения некоторых растений составляют до 30% синтезируемой ими биомассы), почвенные микроорганизмы поставляют своим партнерам легкоусвояемые соединения азота и фосфора, синтезируют стимулирующие развитие растений фитогормоны и витамины, снижают численность и подавляют активность почвенных фитопатогенов.

Состав микрофлоры зоны корня можно разделить на две группы. «Корневые» микроорганизмы, поселяющиеся на самой поверхности корня, -- микроорганизмы ризопланы, и микробы, обитающие в слое почвы, прилегающем к корню, -- микроорганизмы ризосферы. Количество микроорганизмов на поверхности корня и в ризосфере в сотни раз больше, чем в остальной массе почвы. В зоне молодого корня в основном размножаются неспорообразующие бактерии (Pseudomonas, Mycobacterium и т. д.). Здесь же встречаются микроскопические грибы, дрожжи, водоросли и другие микроорганизмы.

Рис. 7. Участок ризосферы: A -- амёба, поедающая бактерий; BL -- малоактивные бактерии; BU -- активные бактерии; RC -- получаемый корнем углерод; SR -- отшелушивающиеся корневые волоски; F -- гифа гриба; N -- нематода

Способность специфичных групп микроорганизмов развиваться в ризосфере определенных видов растений и оказывать положительное или негативное воздействие определила необходимость чередования культур, т. е. севооборота. Целесообразность и даже необходимость введения чередования культур (севооборота) возникла, когда было установлено неблагоприятное воздействие на плодородие почвы длительного возделывания на поле одной и той же культуры.

Некоторые растения, например кукуруза и картофель, менее чувствительны к монокультуре. Иногда предшественник улучшает рост последующей культуры, что в значительной степени относится и к бобовым. Как же предшественник может влиять на последующую культуру и какова роль в таком случае микробиологического фактора? Здесь мы встречаемся с комплексом явлений. Некоторые растения односторонне обедняют почву на отдельные элементы питания. Под пропашными культурами почва не только истощается, но и существенно ухудшается ее структура. Не рекомендуется возделывать друг за другом сельскохозяйственные растения, имеющие общих вредителей и болезни. О том, что утомление почвы может быть вызвано микроорганизмами, свидетельствует опыт Н. А. Красильникова. В колбы с агаризованной минеральной питательной средой вносят семена клевера. В часть колб помещают небольшое количество «утомленной» почвы. Это вызывает быструю гибель проростков под влиянием микроорганизмов. Та же почва, но стерилизованная, неблагоприятного эффекта не дает. Токсичные для растений вещества могут накапливать в почве многие микроорганизмы, развивающиеся в ризосфере растений и на растительных остатках. Так, в результате жизнедеятельности бактерии рода Pseudomonas образуются феназинкарбоновая кислота, диацетилфлороглюцин и другие соединения, вредные для растений. Фитотоксины продуцируют многие почвенные грибы: Aspergillus fumigatus -- гельволевую кислоту, грибы рода Penicillium -- патулин, Trichoderma -- виридин и т. д. Поскольку каждому растению в почве сопутствует определенный ценоз микроорганизмов, это сказывается на накоплении определенных фитотоксичных соединений. Существуют и другие причины, обусловливающие влияние одного растения на другое, в частности химического характера. Это так называемое аллелопатическое действие растений. Термин «аллелопатия» предложен немецким ученым Г. Молишем для определения химического воздействия одного растения на другое. Многие покрытосеменные растения способны вырабатывать те или иные токсичные вещества, в том числе алкалоиды. Указанные соединения не только аккумулируются в растительных тканях, но и частично выделяются в почву. Отмеченное свойство присуще большинству культурных растений. Так, корневая система овса выделяет скополетин (вещество, близкое к кумарину), лен -- ряд ароматических соединений (феруловую, гидроксибензойную кислоты и т. д.), люцерна -- алкалоиды, сахарная свекла -- также ароматические соединения (гидроксибензойную, кумаровую, феруловую, ванилиновую кислоты) и т. д. Н. Г. Холодный, а затем другие исследователи установили, что аллелопатическое действие оказывают многие летучие соединения растений, среди них альдегиды, терпены, этилен, эфирные масла и т. д. В пожнивных остатках культурных растений обнаружены некоторые вещества, токсически действующие на растения. Так, в соломе злаковых растений присутствуют кумариновая, гидроксибензойная, феруловая, сиреневая кислоты и др. Сильное аллелопатическое действие оказывают хиноны.

Вещества растительных организмов, оказывающие химическое воздействие на другие растения, Г. Грюммер предложил называть «колины». В высоких концентрациях такие вещества угнетают рост растений, в малых стимулируют. Очевидно, научно обоснованное чередование культур должно строиться на учете аллелопатического фактора. Известно, что после сахарной свеклы плохо растет кукуруза, после овса резко падает всхожесть семян пшеницы, при вторичном посеве ячменя резко снижается его урожайность. Острое «утомление» почвы наблюдается при монокультуре сахарной свеклы, льна, гороха, клевера, люцерны, многих плодовых растений. Однако кукуруза, картофель, рожь, табак, виноград и некоторые овощи не испытывают угнетения при монокультуре. Как правило, благоприятно действуют на последующие культуры бобовые растения (особенно многолетние) в связи с тем, что в симбиозе с клубеньковыми бактериями обогащают почву азотом. По данным Д. Н. Прянишникова, после того как в Европе были введены плодосменные севообороты с клевером, средняя урожайность зерновых культур поднялась с 0,7 до 1,6 т с 1 га. На черноземе Воронежской области в четырехпольном севообороте без бобовых растений и удобрения озимая пшеница давала около 2 т/га. При использовании в севообороте однолетнего клевера урожайность повышалась до 2,5, а двулетнего клевера -- до 2,8 т/га. Такие урожаи устойчиво держались на протяжении 17 лет. Общеизвестна высокая эффективность таких предшественников хлопчатника, как люцерна и рапс. В значительной мере их действие связано с тем, что корневая система указанных растений выделяет в почву соединения (алкалоиды и другие вещества), угнетающие возбудителей вилта хлопчатника. Помимо того, люцерна обогащает почву азотом. Большая эффективность бобовых культур как предшественников сельскохозяйственных растений показана и зарубежными экспериментами. Состав микрофлоры ризосферы меняется с возрастом растений (табл. 3).

Таблица 3. Групповой состав микрофлоры пшеницы, тыс. на 1 г почвы

Например, бациллы, актиномицеты и целлюлозоразлагающие микроорганизмы, практически отсутствующие в ризосфере молодых растений, появляются на более поздних стадиях их развития. Очевидно, отмеченная группа микроорганизмов живет не за счет экзосмоса растений, а принимает активное участие в разложении отмирающих корней. Микрофлора поверхности корня несколько отличается по составу от микробного ценоза ризосферы. Так, в ризоплане богаче представлен род Pseudomonas, слабо размножаются Azotobacter, целлюлозоразлагающие и некоторые другие микроорганизмы, которых много в ризосфере.

Сделаны попытки доказать, что зоне корня каждого вида растений свойственны строго специфичные группы микроорганизмов, практически не размножающиеся в ризосфере других растительных организмов. Действительно, можно отметить определенную перегруппировку отдельных микроорганизмов в зоне корня различных растений. Это определяется составом корневых выделений и органических остатков, которые у растений имеют некоторые особенности. Например, известно, что клубеньковые бактерии обильнее размножаются в ризосфере бобовых растений. В прикорневой зоне некоторых растений Azotobacter развивается лучше. В зоне корня растений размножаются некоторые специфичные виды грибов и т. д. Особый интерес представляет воздействие генетических модификаций растений на численность, состав и активность микроорганизмов ризосферы. Так, английским ученым Дж. Линчем (1982) было установлено, что введение пары 513 хромосом в клетки пшеницы существенно изменило активность и численность ее ризосферной микрофлоры -- появились грибы, вызывающие корневую гниль, увеличилась численность целлюлозоразрушающих, пектинолитических, амилолитических и аммонифицирующих бактерий, изменилось общее количество микроорганизмов. В результате ризосфера растения-реципиента стала похожа на тип ризосферы, устанавливающейся в тетраплоидных, а не в диплоидных пшеницах. Микрофлора зоны корня представляет собой определенный биологический барьер, влияющий на взаимодействие высших растений и паразитов. В последнее время установлено, что среди различных представителей ризосферных микроорганизмов имеются отдельные виды, обладающие способностью не только находиться и размножаться на корнях растений, но и проникать в корни, а затем мигрировать в стебли и листья. Такие микроорганизмы отнесены к эндофитным ризобактериям, т. е. организмам, способным жить и размножаться в тканях высших растений (корнях, стеблях, листьях). На кафедре микробиологии МСХА (В. Т. Емцев, О. В. Селицкая и др.) была получена эндофитная ризобактерия Klebsiella planticola, обладающая способностью к инвазивности и персистентности, т. е. способная проникать во внутренние органы растений, активно размножаться и длительное время там находиться, мигрируя от корней к листьям и от листьев к корням. Подобные особенности Klebsiella planticola позволили использовать этот микроорганизм в качестве микробного биопрепарата биоплант-К для ускорения роста сельскохозяйственных растений и борьбы с корневыми фитопатогенами, поскольку данная бактерия, размножаясь в тканях растений, синтезирует ростовые вещества и антибиотики, оказывающие положительное влияние на продуктивность растений.

Мероприятия, проводимые человеком, оказывают огромное воздействие на микробные ассоциации. Среди них наиболее существенно применение химических средств борьбы с сорняками (гербициды), всевозможных протравителей семян, минеральных удобрений. Все это в сочетании с разными типами обработки почв (вспашка, орошение, мелиорация) изменяет микробные ценозы, часто стойко и не всегда в благожелательном для хозяйства направлении. В этом плане во всем мире ведется большая исследовательская работа.

Широко распространенное, даже среди некоторой части специалистов, мнение о почве как о подобии питательной среды, которую можно заселить любыми микроорганизмами, глубоко неверно. Колонизация микробами отдельных участков может иметь место в течение непродолжительного времени. Затем вступают в действие те или иные регуляторные механизмы, и популяции «пришельцев» оказываются сведенными к минимуму. Настойчивые попытки на протяжении многих лет применить бактеризацию (внесение) почвы микроорганизмами с полезными для растений свойствами (фиксаторов азота, активных минерализаторов фосфорсодержащих веществ) оказались неуспешными.

Колонизация почвы микроорганизмами (в том числе не содержащимися в ассоциациях в данном участке) все же ограниченно возможна, если не лимитируется следующими условиями:

а) наличием пригодного места в данный момент (в реальных микрозонах обитания микроорганизмов, а не вообще в почве);

б) присутствием в достаточном количестве субстрата, обеспечивающего длительное развитие данного организма;

в) способностью использовать многие источники энергии и пищи в экосистеме, и причем более эффективно, чем аборигенная микрофлора;

г) высокой толерантностью (выносливостью) попадающего организма к микроэкологическим факторам -- колебаниям рН и температуры, осмотическому давлению, содержанию кислорода, окислительно-восстановительному потенциалу, влажности и другим, обеспечивающим вегетативный рост;

д) наличием механизмов активного воздействия на другие организмы -- образованием физиологически активных метаболитов, способностью к антагонизму и устойчивостью к продуктам жизнедеятельности других организмов.

Несоблюдение указанных условий и даже некоторых из них делает невозможным активное поселение микроорганизмов в почве. Более того, как уже отмечалось, входящие в состав ценоза микробы при отсутствии возможностей приспособиться к изменившимся условиям среды выпадают из активного участия в деятельности ценоза, переходя в переживающее состояние.

Список используемой литературы

1. Емцев, В. Т. Микробиология: учебник для вузов / В. Т. Емцев, Е. Н. Мишустин. -- 5-е изд., перераб. и доп. -- М. : Дрофа, 2005. - 445, [3] с.: ил.

2. Гусев М.В. Микробиология: учебник для студ. биол. специальностей вузов/ М.В.Гусев, Л.А.Минеева. - 4-е изд. стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - 464 с.

3. Нетрусов А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений/ А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. - М.: Издательский центр «Академия», 2006. - 352 с.

4. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - М.: Мир, 1987. - 567 с., ил.

5. Громов Б.В.Строение бактерий: Учеб. Пособие. - Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1985. - 192 с.

Размещено на Allbest.ru