Вікові особливості мітохондріального дихання та перекисного окиснення ліпідів у тварин при активації системи оксиду азоту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет Імені івана франка

УДК 612.3:612.33:612.34:612.814

ВІКОВІ ОСОБЛИВОСТІ МІТОХОНДРІАЛЬНОГО ДИХАННЯ ТА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У ТВАРИН ПРИ АКТИВАЦІЇ СИСТЕМИ ОКСИДУ АЗОТУ

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

муращук катерина михайлівна

Львів 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент Гордій Степан Костянтинович, Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри фізіології людини і тварин

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, доцент Островська Галина Віталіївна Київський національний університет імені Тараса Шевченка професор кафедри цитології, гістології та біології розвитку

кандидат біологічних наук, доцент Терлецька Оксана Іванівна Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, доцент кафедри нормальної фізіології

Захист відбудеться “25 ” січня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету імені Івана Франка, аудиторія № .

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий " 24 " грудня 2007 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук, доцент _________ В.В. Манько

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Старіння - складний процес, який супроводжується поступовим розладом фізіологічних функцій організму та зменшенням його адаптивних можливостей. Багатогранність цього процесу є причиною існування на сучасному етапі розвитку науки багатьох теорій та гіпотез, які пояснюють закономірності та напрямок вікових змін організму. Однією із таких є вільнорадикальна теорія Хармана (Harman, 1992), згідно якої старіння та захворювання які його супроводжують, є наслідком нагромадження з віком вільнорадикальних ушкоджень структур клітини. Це виникає внаслідок надмірної інтенсифікації процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) чи недостатності функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ). Харманом висунуто припущення про те, що так званим біологічним годинником живих організмів є мітохондрія (МХ), оскільки основна кількість активних форм кисню (АФК) та його метаболітів утворюється в ході функціонування ланцюга переносу електронів (Beckman, Ames, 1998; Szewczyk, Wojtczak, 2002). Це припущення лежить в основі мітохондріальної гіпотези старіння, якій присвячено велику кількість досліджень останніх років (Beckman, Ames, 1998; Navaro, Boveris, 2002-2004). Попри це дані літератури не дають вичерпної та однозначної відповіді щодо змін функціонування МХ, напрямленості процесів ПОЛ та стану системи АОЗ на різних етапах індивідуального розвитку. Тому дослідження вікової динаміки функціонування МХ та комплексна оцінка стану системи АОЗ у тканинах організмів різних вікових груп, з метою запобігання чи геронтотерапії патологічних станів, які супроводжують старіння, є актуальною проблемою сучасної фізіології.

Експериментальне доведення локалізації NO-синтази на внутрішній мембрані МХ (Giulivi, 1998), а також здатність NO впливати на процеси мітохондріального енергозабезпечення (Cleeter et al., 1994; Brown, 1995; Navaro, Boveris et al., 2004) свідчать про його участь у регуляції кисень-залежних процесів, зокрема МХ дихання, процесів ПОЛ та вплив на активність ферментів системи АОЗ. NO запобігає порушенням електронтранспортного ланцюга МХ (Giulivi, 1998) та має широкий спектр регуляторних впливів у ссавців (Іккерт, Кургалюк, Гордій та співавт., 2003). З'ясовано, що цикл оксиду азоту функціонально пов'язаний з циклом трикарбонових кислот (ЦТК) (Реутов и соавт., 1998). Проте з віком змінюється активність NO-синтаз (Navaro, Boveris et al., 2004), а отже відбуваються зміни продукування NO та його впливу на процеси за участю кисню. Модулюючи активність NO-синтази, шляхом використання попередника біосинтезу оксиду азоту амінокислоти L-аргініну або блокатора NO-синтаз N-нітро-L-аргініну (L-NNA), можна впливати на функціональний стан мітохондрій, змінюючи рівень енергопродукції у клітині. Зрозуміло, що дослідження функціонування мітохондрій печінки та міокарда, інтенсивність процесів ПОЛ та стан системи АОЗ у тканинах щурів різних етапів онтогенезу під впливом L-аргініну та N-нітро-L-аргініну є актуальними для сучасної фізіології та мають прикладне значення у геріатрії та медицині.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в межах держбюджетної теми “Кисень-залежні процеси та кальцієва регуляція секреторних клітин травних залоз у процесі старіння”, № держреєстрації 0106U001275, кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка, а також за сприяння Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Дослідити вплив модуляторів системи оксиду азоту амінокислоти L-aргініну та блокатора NO-синтази L-NNA на функціонування МХ печінки та міокарда, процеси ПОЛ, стан системи АОЗ у щурів на різних етапах постнатального онтогенезу. Мета досягалась вирішенням таких завдань: дихання мітохондрія печінка щур

З'ясувати особливості впливу модуляторів системи оксиду азоту на регуляцію процесів АДФ-стимульованого дихання та енергозабезпечення мітохондрій печінки та міокарда щурів статево незрілого, молодого та старого віку за окиснення б-кетоглутарату та сукцинату.

Вивчити особливості МХ дихання та енергозабезпечення печінки щурів різного віку за введення L-аргініну та L-NNA та окиснення субстратів трансаміназного шунтуючого шляху.

Дослідити зміни інтенсивності процесу ліпопероксидації та стан системи АОЗ у печінці, міокарді та крові статево незрілих, молодих і старих щурів під впливом L-аргініну та інгібітора синтази оксиду азоту L-NNA.

Об'єкт досліджень: вікові зміни функціонування мітохондрій печінки та міокарда щурів за впливу модуляторів NО-ергічної ланки.

Предмет досліджень: процеси дихання та окисного фосфорилювання в мітохондріях печінки та міокарду, інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів, активність системи АОЗ у тканині печінки, міокарді та крові щурів статево незрілого, молодого та старого віку.

Наукова новизна одержаних результатів. Автором вперше проведено комплексне дослідження вікових особливостей протікання процесів за участю кисню у тканинах щурів та впливу попередника біосинтезу оксиду азоту L-аргініну і блокатора NO-синтази L-NNA на ці процеси.

Отримано високі швидкості МХ дихання в 3-ох функціональних станах за Чансом у печінці та міокарді щурів молодого віку, тоді як ефективність фосфорилювання максимальною є у статево незрілих тварин. З'ясовано, що у щурів на ранньому та пізньому етапах онтогенезу ефективніше функціонує НАД-залежний шлях надходження відновних еквівалентів у ланцюг переносу електронів МХ печінки. Аналіз із використанням інгібітора сукцинатдегірогенази (СДГ) підтвердив таке припущення і вказав на сукцинат-залежний внесок у окиснення НАД-залежних субстратів.

Показано вікову динаміку окиснення субстратів трансаміназних перетворень у печінці, із переважанням окиснення пірувату у статево незрілому та малату у молодому віці. При цьому із збільшенням віку швидкість АДФ-стимульованого дихання знижується, а показники енергозабезпечення, аспартатамінотрансферазна та аланінамінотрансферазна активність печінки зростають.

Показано тканиноспецифічність вікових змін інтенсивності ПОЛ та активності системи АОЗ. Інтенсивність ліпопероксидації, активність СОД і КТ у печінці та крові з віком знижується, а у міокарді зростає. Головну роль у антиоксидантному захисті тканин і крові старих щурів відіграють ферменти глутатіон-залежної ланки.

Отримані автором результати підтверджують субстратну залежність дії оксиду азоту, яка має місце на усіх етапах онтогенезу. Підвищення концентрації оксиду азоту більше впливає на окиснення ФАД-залежних субстратів, оскільки за окиснення СК відсоток змін показників дихання та ОФ у мітохондріях був вищим, як за окиснення КГ. За окиснення СК введення попередника оксиду азоту L-аргініну призвело до зниження швидкостей мітохондріального дихання та енергозабезпечення у печінці статево незрілих щурів та зростання цих показників у міокарді.

Активація NO-ергічної ланки регуляції у щурів статево незрілого та молодого віку за використання субстратів переамінування веде до посилення споживання кисню МХ, а у старих щурів до інтенсифікації окисного фосфорилювання. Вперше показано, що максимально чутливими до зміни концентрації оксиду азоту є про- та антиоксидантні властивості тканин старих щурів. Ці результати відображають підвищення антиоксидантного потенціалу організмів шляхом введення L-аргініну чи інгібітора L-NNA. Введення L-аргініну сприяло зміні інтенсивності ліпопероксидації у тканинах щурів різного віку за рахунок зниження споживання кисню або підвищення активності ферментів АОЗ.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати поглиблюють уявлення про вікові зміни протікання кисень-залежних процесів у тканинах щурів. Вони можуть використовуватись як теоретична основа для розробки методів діагностики захворювань, що супроводжують старіння. Здатність L-аргініну та інгібітора L-NNA регулювати інтенсивність процесів за участю кисню на різних етапах онтогенезу створює теоретичне підґрунтя для подальшої розробки фармакологічних засобів геротерапевтичної дії на основі модуляторів системи оксиду азоту. Результати досліджень можуть бути використаними при читанні загального курсу “Фізіологія людини і тварин”, спецкурсів “Вікова фізіологія” та “Біоенергетичні аспекти фізіологічних процесів”.

Особистий внесок здобувача полягає у проведенні всієї експериментальної частини, статистичної обробки отриманих результатів, відборі та опрацюванні даних літератури, плануванні напрямків досліджень, аналізі та узагальненні отриманих результатів.

Апробація результатів дослідження. Матеріали результатів дисертації доповідались і обговорювались на: ХІ Ювілейній Міжнародній конференції “Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне використання”, присвяченій 16-річчю інформотерапії, 2005 р., м. Київ; ІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”, 2006 р., м. Львів; XVII з'їзді Українського фізіологічного товариства з міжнародною участю пам'яті академіка О.О. Богомольця, 2006р., м. Чернівці; VII Міжнародному симпозіумі “Биологические механизмы старения”, 2006 р., м. Харків; IX Український біохімічний з'їзд, 2006 р., м. Харків; Міжнародній науковій конференції, приуроченій до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені Івана Франка “Механізми функціонування фізіологічних систем”, 2006 р., м. Львів; ІІІ Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”, 2007 р., м. Львів; ІІІ Міжнародній конференції молодих науковців “Біорізноманіття. Екологія. Адаптація. Еволюція”, приуроченій до 100-ліття з дня народження Марії Макаревич, 2007 р., м. Одеса; щорічних наукових конференціях біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка 2005-2007 роки.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 друкованих праць, з них 3 статті у фахових наукових виданнях, 9 у збірниках і тезах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел (214 назв). Робота викладена на 147 сторінках, ілюстрована 18 таблицями і 54 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень

Досліди виконували на 243 лабораторних безпородних щурах-самцях трьох вікових груп: статево незрілих - віком до 6 тижнів, масою тіла 50-60 г.; молодих - віком 5-6 місяців, масою тіла 180-210 г. та старих щурах - віком 18-24 місяці, масою тіла 450-500 г. Окрім точних відомостей про вік тварин, при поділі на групи, враховували масу тіла та зовнішній вигляд тварини (пожовтіння шерстяного покриву, огрубіння епідермального шару шкіри для старих щурів та ін.). Особливу увагу звертали на збалансованість раціону, оскільки зміна калорійності у харчуванні є одним із факторів сповільнення чи пришвидшення старіння.

Для дослідження впливу NO-ергічної ланки, перед дослідом, тварин кожної із вікових груп поділяли на контрольну (введення 1 мл фізіологічного розчину) та дві дослідні, котрим вводили відповідно L-аргінін дозою 600 мг/кг (“Sigma”, США) та L-NNА дозою 35 мг/кг (“Sigma”, США) (Кургалюк, Іккерт та співавт., 2003). Декапітацію проводили через 30 хв. після введення препаратів.

Мітохондрії печінки та міокарда виділяли за методом, що дозволяє зберегти їх нативність (Кондрашова и соавт., 1985). Поглинання кисню та процеси окисного фосфорилювання (ОФ) досліджували полярографічним методом (Сhance, Williams, 1955). Як субстрати окиснення застосовували (мМ): сукцинат (СК) - 0,35, б-кетоглутарат (КГ) - 1, піруват - 3, глутамат - 2,5, малат - 2,5. Також використовували інгібітор СДГ - 2 мМ малонат. Дихання стимулювали додаванням 200 мкМ АДФ. На основі полярографічних записів розраховували швидкості поглинання кисню у станах 2, 3 та 4 за Чансом (V₂, V₃, V₄), показники часу, швидкості та ефективності окисного фосфорилювання (Т_ф, V_ф, АДФ/О), спряженості дихання та ОФ за Чансом (V₃/V₄), та відношення (V₃/V₂).

Інтенсивність процесів ПОЛ в тканинах та крові щурів оцінювали за накопиченням продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою - ТБК-реактивних продуктів (ТБКРП) (Гаврилов и соавт., 1987; Тимирбулатов и соавт., 1988). Активність ферментів системи АОЗ у крові, печінці та міокарді визначали наступними методами: супероксиддисмутази (СОД) (Костюк и соавт., 1990), каталази (КТ) (Королюк, 1988), глутатіонредуктази (ГР) (Путилина, 1982), глутатіонпероксидази (ГПO) (Моин, 1986). У печінці активність аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ) визначали методом (Осадчая, 1982), а активність СДГ методом (Ещенко, Вольский, 1982). Вміст білку у пробах оцінювали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951).

Всі отримані результати опрацьовували статистично за Стьюдентом, а вірогідними вважали зміни, де Р?0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив введення L-аргініну та L-NNA на процеси мітохондріального енергозабезпечення у печінці щурів різного віку. Відомо, що з віком змінюється структура МХ (набрякання, зміна форми крист тощо) та знижується активність мітохондріальних ферментних комплексів (МХФК), зокрема І та IV, у печінці щурів (Navaro, Boveris, 2004). Враховуючи це, ми досліджували вікові зміни функціонування МХ печінки та інтенсивність процесів ліпопероксидації у цій тканині. Наші результати дозволяють стверджувати, що окиснення СК супроводжувалось інтенсифікацією поглинання кисню МХ печінки щурів статево незрілого, молодого та старого віку. Окиснення КГ характеризувалось інтенсифікацією процесів енергетичного забезпечення. Саме такий реципрокний характер використання субстратів дозволяє організму краще пристосовуватись до різноманітних впливів на різних етапах онтогенезу.

У віковому аспекті найвищими показники МХ дихання у трьох станах за Чансом, як за окиснення СК так і КГ, були у молодих щурів. При цьому ефективність ОФ максимальних значень сягала у статево незрілих щурів і була вищою, ніж у молодих та старих щурів на 104 % (Р?0,001) та 42 % (Р?0,001) за окиснення СК та на 124 % (Р?0,001) і 19 % (Р?0,001) за окиснення КГ відповідно (табл. 1). Вищі показники ефективності ОФ статево незрілих щурів пов'язані із підвищеними потребами енергозабезпечення організму цього віку, оскільки препубертатний період характеризується початком гормональних перебудов та статевого дозрівання організму. Економізацію енергопродукції у молодих щурів можна пояснити стабілізацією метаболічних процесів у цьому віці. На пізньому етапі онтогенезу, як за окиснення СК так і КГ, досліджено підвищення спряженості процесів дихання та окисного фосфорилювання за Чансом, що сприяло підвищенню ефективності синтезу АТФ, попри низькі швидкості мітохондріального дихання.

Таблиця 1

Вплив L-аргініну та L-NNA на швидкість мітохондріального дихання у стані 2 (нг-ат. О/хв/мг білка) та ефективність фосфорилювання (Мкмоль АДФ/нг-ат. О) печінки щурів різного віку (M±m) (n=6)

Примітки: тут і далі * - достовірно щодо статево незрілих щурів; ^ - достовірно щодо молодих щурів;

* - достовірно щодо контролю.

За окиснення КГ із одночасним інгібуванням СДГ шляхом додавання малонату, показники ефективності ОФ були вищими, як за окиснення “чистого” КГ. Пряме вимірювання активності СДГ вказало на її низьку величину у статево незрілих щурів та підвищення у молодих і старих щурів на 116 % (Р?0,001) та 125 % (Р?0,001) відповідно (рис. 1).

Така вікова динаміка активності СДГ пояснює отримані нами вищі показники енергозабезпечення за окиснення КГ, особливо у щурів препубертатного періоду та вказує на СК-залежне підсилення окиснення НАД-залежних субстратів тварин цього віку.

Важливим для клітини є функціонування швидких (шунтуючих) циклів перетворення субстратів у ЦТК, які активізуються за підвищених потреб клітини у енергозабезпеченні. Активність шунтуючих шляхів, зокрема амінотрансферазного, є одним із показників здатності клітин переключатись із повільного на швидке окиснення. Головною особливістю окиснення глутамату і малату у статево незрілих щурів було те, що показники мітохондріального дихання та ОФ були надзвичайно низькими. Пряме визначення активності АсАТ у печінці показало, що її величина у статево незрілих щурів була на 69 % (Р?0,001) нижчою, як у молодих та на 27 % (Р?0,001), як у старих. Це вказує на те, що у статево незрілому віці цей амінотрансферазний шлях є малоактивним. Переважаючим для статево незрілих організмів є АлАТ-ний шунтуючий шлях перетворення субстратів, оскільки за окиснення глутамату та пірувату ефективність ОФ була на 120 % (Р?0,001) та 38 % (Р?0,001) вищою, ніж у молодих та старих щурів відповідно. Це пов'язано із високими значеннями піруватдегідрогенази у печінці статево незрілих щурів (Карпов та співавт., 2006). Зниження активності піруватдегідрогенази з віком обумовлює досліджене нами зменшення показників МХ дихання з віком за окиснення пірувату.

Рис. 1 Активність сукцинатдегідрогенази (%), аланін- та аспартатамінотрансфераз (%) у печінці щурів різного віку

Ідентифікація на внутрішній мембрані мітохондрій NO-синтази (Giulivi, 1998) дає можливість розглядати NO, як регулятор процесів мітохондріального енергозабезпечення. Відомо, що вплив NO залежить від функціонального стану цих органел, а також субстрату окиснення (Кургалюк, Іккерт та співавт., 2003). Аналіз отриманих результатів за введення L-аргініну та L-NNA вказав на субстратну залежність впливу системи оксиду азоту на показники МХ функціонування, яка зберігається на усіх досліджуваних етапах онтогенезу.

Найбільш чутливими до впливу екзогенного оксиду азоту були мітохондрії щурів статево незрілого віку, в яких досліджено зниження показника енергозабезпечення за введення L-аргініну при окисненні СК та КГ на 40 % (Р?0,001) та 29 % (Р?0,001), порівнюючи із контролем (табл. 1). При цьому за окиснення СК знижувалися показники МХ дихання у стані 2 на 28 % (Р?0,001) за введення L-аргініну та на 13 % (Р?0,001) за введення L-NNA. Тому підсилення NO-ергічної ланки на цьому етапі онтогенезу доцільне лише за умов, коли необхідно обмежити споживання кисню. Це пов'язано і з іншими причинами, про які було згадано вище, головною із яких є та, що організм “готується” до статевого дозрівання, а отже АТФ використовується для синтезу статевих гормонів і підготовки організму до гормональних перебудов. У молодих тварин за окиснення СК досліджено зниження показників окисного фосфорилювання на 13 % (Р?0,05) та 14 % (Р?0,01), як за активації синтезу оксиду азоту, так і за інгібування NO-cинтази. Відомо, що активність останньої з віком знижується (Мойбенко, Сагач та співавт., 2004). Тому у результаті введення L-аргініну старим щурам, і таким чином, підсилення NO-синтазної активності нами виявлено економізацію енергозабезпечення: підвищення ефективності ОФ за окиснення СК без зміни швидкостей мітохондріального дихання. За цих умов знижується ризик надмірної генерації АФК та ініціації процесів ПОЛ на пізньому етапі онтогенезу.

Аналіз із використанням інгібітора СДГ показав, що вплив NО на окиснення НАД-залежних субстратів є СК-залежним, оскільки за використання малонату система оксиду азоту виявляла схожий, як за окиснення КГ, вплив. Безпосереднє визначення активності СДГ у печінці показало, що у молодих щурів цей показник знижувався на 25 % (Р?0,001) щодо контролю за введення L-NNA, а у старих на 19 % (Р?0,001) за введення L-аргініну та на 21 % (Р?0,001) за введення L-NNA. Механізм впливу NO на МХФК ІІ полягає у його здатності взаємодіяти із [Fe-S] - вмісними білками, в результаті чого утворюються Fe^I(NO)₂(SR)₂ групи, які інгібують активність фермента (Hibbs, 1987). Таке інгібування може бути незворотнім (із руйнуванням структури фермента) чи зворотнім (без ушкодження його структури) (Radi, 1996).

За окиснення глутамату та малату введення L-аргініну щурам молодого віку призводило до зниження швидкості МХ дихання у стані 2 на 41 % (Р?0,001) та ефективності ОФ на 16 % (Р?0,01) щодо контролю. У старих щурів за введення L-аргініну, попри незмінні показники МХ дихання та зниження активності АсАТ на 18 % (Р?0,01), відбувалось підвищення АДФ/О на 12 % (Р?0,05). При використанні, як окисних субстратів, глутамату та пірувату вплив L-аргініну у щурів статево незрілого віку проявлявся у підвищенні V₂ на 53 % (Р?0,001) і зниженні АДФ/О на 46 % (Р?0,01). У молодих щурів введення L-аргініну за цих умов викликало зниження показника АДФ/О на 15 % (Р?0,01). Введення L-аргініну старим щурам супроводжувалось підвищенням швидкості поглинання кисню МХ у стані 2 на 90 % (Р?0,001) та ефективності ОФ на 20 % (Р?0,01) щодо контролю. Визначення активності АлАТ за введення L-аргініну показало, що цей показник підвищувався на 26 % (Р?0,001) та 10 % (Р?0,01) у молодих та старих щурів щодо контролю відповідно. Таким чином, отримані нами результати показали, що за активації NO-ергічної ланки регуляції при використанні субстратів переамінування посилюється споживання кисню МХ щурів статево незрілого та молодого віку. Це узгоджується із високими потребами ростучих організмів у забезпеченні киснем. В старих щурів введення L-аргініну сприяє інтенсифікації окисного фосфорилювання. А цей факт, та те, що активність АсАТ та АлАТ у старих щурів була на високому рівні, вказує на досконале функціонування трансаміназого шунтуючого шляху у цих тварин.

Вплив модуляторів системи NО на функціональні показники мітохондрій міокарда щурів різного віку. Відомо, що порушення функціонування серцево-судинної системи, яке спостерігається при старінні організмів, зумовлене порушенням енергетичного обміну та репаративних процесів у них (Мойбенко, Сагач та співавт., 2004). Висока чутливість МХ міокарда до зовнішніх впливів може безпосередньо чи опосередковано обумовлювати розвиток серцево-судинних захворювань та старіння. Аналіз отриманих результатів показав, що за окиснення КГ найвищими показники мітохондріального дихання та енергозабезпечення були у молодих щурів. Так показник V₂ у молодих щурів був на 66 % (Р?0,001) та 81 % (Р?0,001), а АФД/О на 11 % (Р?0,001) та 25 % (Р?0,001) вищими, ніж у статево незрілих та старих щурів відповідно (табл. 2).

Таблиця 2

Швидкість дихання (нг-ат О/хв/мг білка) та ефективність фосфорилювання (Мкмоль АДФ/нг-ат. О) МХ міокарда щурів різних етапів онтогенезу за введення L-аргініну та L-NNA(M±m) (n=6)

Висока ефективність ОФ у молодих щурів за окиснення КГ вказує на переважання у цьому віці НАД-залежних шляхів надходження відновних еквівалентів у дихальний ланцюг.

У міокарді статево незрілих щурів ефективність ОФ за окиснення СК була вищою відносно інших вікових груп. Це свідчить про переважання на ранньому етапі онтогенезу регуляторного впливу симпатичної нервової системи, оскільки згідно гормонально - субстратно - нуклеотидної теорії регуляція клітинного окиснення СК здійснюється симпатичною нервовою системою (Кондрашова, Гордій, Бабський та співавт., 1985).

Зареєстровані нами показники мітохондріального дихання у статево незрілих та молодих щурів за додавання малонату були нижчими, ніж за окиснення екзогенного КГ, тоді як показник АДФ/О підвищувався. Безпосереднє визначення активності СДГ у міокарді вказало на її підвищення з віком. Так у молодих та старих щурів активність СДГ була на 126 % (Р?0,001) та 45 % (Р?0,01) вищою, ніж у статево незрілих (рис. 1). Такі результати вказують на ФАД-залежний внесок в окиснення НАД-залежних субстратів, що, як і у тканині печінки, має місце в усіх досліджуваних вікових групах.

Введення L-аргініну статево незрілим щурам підвищувало швидкість поглинання кисню у стані 2 при окисненні КГ та СК на 14 % (Р?0,01) та 46 % (Р?0,001) відповідно (табл. 2). При цьому зростала ефективність ОФ на 17 % (Р?0,001) та 63 % (Р?0,001). У молодих щурів достовірні зміни отримано за введення інгібітора NO-с - L-NNA. За цих умов при окисненні КГ, попри стабільність показників мітохондріального дихання, ефективність ОФ знижувалась на 25 % (Р?0,001), а при окисненні СК підвищувались показники V₂ та АДФ/О на 14 % (Р?0,01) та 6 % (Р?0,01). У старих щурів введення L-аргініну та використання як субстрату окиснення КГ, показники МХ функціонування залишались на рівні контролю, а за окиснення СК знижувався показник V₂ на 19 % (Р?0,05) та зростав АДФ/О на 41 % (Р?0,001) (табл. 2). Таким чином, оксид азоту істотніше впливав на показники мітохондріального дихання у щурів різного віку за окиснення СК, ніж за окиснення КГ. На нашу думку, такі результати є закономірними, зважаючи на той факт, що згідно (Giulivi, 1998) однією із “мішеней” дії NO на комплекси дихального ланцюга є СДГ. Зміна активності цього ферменту впливає на інтенсивність поглинання кисню мітохондріями у основних функціональних станах за Чансом. Безпосереднє визначення активності СДГ у міокарді показало, що у статево незрілих та старих щурів за введення L-аргініну вона зростала на 16 % (Р?0,001) та 14 % (Р?0,05), а у молодих знижувалась на 32 % (Р?0,001). Введення L-NNA викликало протилежний ефект: зниження активності СДГ у міокарді молодих та старих щурів на 20 % (Р?0,001) та 29 % (Р?0,001) щодо контролю. За інгібування СДГ вплив оксиду азоту на окиснення НАД-залежних субстратів зростав. Ймовірно, активна СДГ “екранує” вплив оксиду азоту на МХФК І, що особливо проявляється у статево незрілих щурів і підтверджує статус адренергічних шляхів регулювання фізіологічних функцій на ранньому етапі онтогенезу.

Інтенсивність ліпопероксидації та стан системи антиоксидантного захисту у тканинах щурів різного віку за введення L-аргініну та L-NNA. Перекисне окиснення ліпідів властиве для усіх клітин та тканин організму і проходить, в основному, в мембранах та ліпопротеїнових комплексах. Цей процес відбувається в організмі постійно, відіграючи важливу роль в оновленні ліпідів мембран клітин. Його інтенсивність підтримується на стабільному рівні системою АОЗ. Одним із джерел АФК у клітині є ланцюг переносу електронів мітохондрій, а саме НАДФН-оксидаза (Bejma, 2004). Для комплексної оцінки кисень-залежних процесів нами проведено серію досліджень процесів ліпопероксидації та активності системи АОЗ у печінці, міокарді, та крові щурів різного віку. Отримані нами результати показали, що у печінці вміст ТБКРП знижувався із віком і був у молодих та старих щурів на 29 % (Р?0,001) та 72 % (Р?0,001) нижчим, як у статево незрілих (табл. 3). Високі показники ліпопероксидації у статево незрілих щурів пов'язані із дослідженими нами високими показниками мітохондріального функціонування печінки за окиснення СК та КГ. Ці результати узгоджуються із даними дослідників, котрі вказують, на високий рівень ТБКРП у перші дні постнатального онтогенезу і зниження вмісту цього продукту ПОЛ з віком (Данченко, Калитка, 2002). Активність КТ у печінці знижувалась із зростанням віку, а активність СОД виявляла коливний характер із максимальним значенням у молодих щурів. Вища активність СОД, порівняно із іншими ферментами АОЗ, свідчить про те, що у молодому організмі підвищений ризик надмірної генерації АФК через високі швидкості МХ дихання печінки молодих щурів. Високою була активність ферментів глутатіон-залежної ланки АОЗ на пізньому етапі онтогенезу у печінці. Так активність ГПО у старих щурів була 42 % (Р?0,001) та 176 % (Р?0,001), а активність ГР на 67 % та у 2,5 рази (Р?0,001) вищою, ніж у статево незрілих та молодих щурів (табл. 3).

Введення L-аргініну знижувало рівень ТБКРП у печінці статево незрілих щурів на 17 % (Р?0,001), а L-NNA на 54 % (Р?0,001). У старих щурів L-NNA підвищував цей показник на 44 % (Р?0,01). Чутливими до дії L-аргініну були ферменти АОЗ старих щурів. Так за цих умов зростала активність СОД у 2,3 рази (Р?0,001) та КТ - на 34 % (Р?0,001). За введення L-аргініну досліджено підвищення активності ГПО у печінці трьох досліджуваних вікових груп: на 53 % (Р?0,001) у статево незрілих, 76 % (Р?0,001) у молодих та 45 % (Р?0,01) у старих щурів. Протилежними були зміни активності ГР. Введення L-аргініну спричинило зниження активності цього ферменту на 46 % (Р?0,001) у статево незрілих, на 41 % (Р?0,001) у молодих та на 29 % (Р?0,001) у старих щурів.

Отже, вплив системи оксиду азоту на прооксидантні та антиоксидантні властивості печінки залежить від віку тварин. У статево незрілих щурів дія L-аргініну напрямлена на зниження інтенсивності ПОЛ. У старих щурів введення L-NNA викликало підвищення рівня МДА. На ферменти АОЗ введення L-аргініну та L-NNA виявляло активуючий вплив. Зниження ж активності ГР за цих умов може вказувати на зменшення відновних та репараційних можливостей у печінці та дії неферментативних антиоксидантів під впливом системи оксиду азоту. Така тенденція має місце на усіх досліджуваних етапах індивідуального розвитку.

У міокарді вміст ТБКРП з віком зростав і у старих щурів був на 135 % (Р?0,001) вищим, ніж у статево незрілих та на 73 % (Р?0,001), ніж у молодих. Активність СОД характеризувалась схожими, як і у тканині печінки, віковими змінами, тоді як каталазна активність міокарда у статево незрілих та молодих щурів була на стабільному рівні і знижувалась у старих щурів на 11 % (Р?0,001) щодо попередніх вікових груп. Глутатіон-залежна ланка найвищих значень досягала у старих щурів: активність ГПО була на 128 % (Р?0,001) та 159 % (Р?0,001), а ГР на 42 % (Р?0,001) та у 2,7 рази (Р?0,001) вищою, ніж у статево незрілих та молодих відповідно. Отримані нами дані підтверджують поширену у геронтології думку про вікову оксидативну вразливість міокарда і узгоджуються з результатами інших авторів (Мойбенко, Сагач, та співавт. 2004; Утко, 2004). Аналіз отриманих нами результатів показав, що вміст ТБКРП у міокарді щурів старого віку був на 65 % (Р?0,001) та 38 % (Р?0,001) вищим щодо цього показника у печінці та крові цієї ж вікової групи щурів відповідно. Проте, на нашу думку, високі показники ТБКРП у міокарді старих щурів свідчать не стільки про інтенсифікацію процесів ПОЛ у цій тканині з віком, скільки про утруднення утилізації цих продуктів. Адже відомо, що вміст МДА - величина інтегративна і свідчить не стільки про інтенсивність ПОЛ у даний момент, скільки про те, що ліпопероксидація у тканині мала місце.

Таблиця 3

Вплив L-аргініну та L-NNA на вміст ТБКРП (мкмоль МДА · мг^-1білка), активність СОД (од.акт. · хв^-1 · мг^-1білка), КТ (нмоль Н₂О₂ · хв^-1 · мг білка), ГПО (мкмоль глутатіону · хв^-1 · мг ^-1 білка) та ГР (мкмоль НАДФН·хв^-1·мг^-1білка) у тканинах щурів різного віку

Висока активність СОД та КТ у старих щурів і невеликий відсоток зниження щодо інших вікових груп є фізіологічно обумовлені. Згідно (Суворова, Давидов, 2004) при старінні створюються сприятливі умови для окисних ушкоджень перенощиків дихального ланцюга і, таким чином, посилюється генерація АФК. Підвищена активність КТ у міокарді щодо інших тканин, на нашу думку, пов'язана із тим, що у ньому, на відміну від печінки та крові, КТ локалізована не лише у пероксисомах, а і у МХ (Барабой, 2006).

Система оксиду азоту достовірний вплив виявляла на вміст МДА у міокарді старих щурів. Нами досліджено зниження цього показника на 13 % (Р?0,01) за введення L-аргініну та на 25 % (Р?0,01) за введення L-NNA, що можна пов'язати із здатністю NO безпосередньо впливати на рівень споживання кисню тканинами серця та на ефективність його використання. Введення інгібітора NO-синтази - L-NNA знижувало активність СОД у статево незрілих щурів на 14 % (Р?0,001), проте підвищувало у старих на 42 % (Р?0,001) у порівнянні із контролем. Активність КТ підвищувалась у статево незрілих щурів на 25 % (Р?0,001) за введення L-аргініну та знижувала у молодих і старих на 33 % (Р?0,01) та на 9 % (Р?0,001) відповідно. Активність глутатіонової ланки під впливом L-аргініну зазнавала схожих змін, а саме активність ГПО зростала, а ГР знижувалась в усіх вікових групах. З даних літератури (Фоліна, 2005) відомо, що оксид азоту може впливати на систему АОЗ шляхом безпосередньої взаємодії із активним центром ферменту, проявляючи, таким чином, про- та антиоксидантні властивості. Отримані результати показали, що ці зміни мають вікову залежність і на різних етапах онтогенезу система оксиду азоту різноспрямовано впливає на активність КТ та СОД міокарда. Максимальний вплив модуляторів NO на систему АОЗ міокарда виявлено у старих щурів.

У крові старих щурів досліджено підвищення вмісту МДА на 37 % (Р?0,001) щодо молодих, що пов'язано із його підвищенням у міокарді. Активність системи АОЗ крові відображала активність цих ферментів у інших тканинах, із переважанням глутатіонової ланки на пізньому етапі онтогенезу.

Введення L-аргініну статево незрілим щурам призводило до зниження МДА на 10 % (Р?0,001), а старим щурам до зростання цього показника на 19 % (Р?0,001) у крові, що пов'язано із аналогічною динамікою цього показника у печінці та міокарді. Введення L-аргініну супроводжувалось зростанням активності СОД у крові молодих щурів на 63 % (Р?0,001) та у старих щурів у 2,3 рази (Р?0,001); активність КТ при цьому зростала на 79 % (Р?0,001). Підвищення активності СОД у крові старих щурів за введення L-аргініну та L-NNA пов'язане із взаємодією утвореного оксиду азоту із металами, наявними у складі ферменту. Адже, відомо, що у крові наявна Mn, та CuZn - вмісні форми СОД (Барабой, 2006). Зміна активності КТ, ймовірно, пов'язана із вивільненням мембранозв'язаної форми каталази та збільшенням її кількості у крові під впливом системи оксиду азоту. Менш чутливою, ніж у печінці та міокарді, до дії L-аргініну та L-NNA була активність глутатіон-залежної ланки АОЗ у крові. Досліджено достовірне зниження ГПО на 16 % (Р?0,001) при введенні L-NNA статево незрілим та молодим щурам. Введення L-аргініну призводило до зниження активності ГР у крові статево незрілих щурів на 44 % (Р?0,001) та у старих щурів на 17 % (Р?0,05).

Таким чином, отримані результати вказують на тканиноспецифічність вікових змін інтенсивності ПОЛ та активності системи АОЗ, що також може визначати інтенсивність процесів старіння та схильність до захворювань, які його супроводжують.

Інтенсивність процесів ПОЛ у печінці та крові максимальною була у статево незрілих щурів. На нашу думку, це фізіологічно обумовлено високою інтенсивністю окисних процесів у цьому віці. Висока інтенсивність радикалоутворення у статево незрілому віці регулюється СОД та КТ, активність яких до періоду статевого дозрівання і під час нього є високою. У міокарді, з віком, збільшувалась інтенсивність ПОЛ, а система АОЗ залишалась на високому рівні протягом життя тварин. Основною характеристикою вікових особливостей ГПО та ГР є підвищення їх активності у печінці, крові та міокарді старих щурів. Це дає можливість вважати глутатіон-залежну ланку системи АОЗ домінуючою на пізньому етапі онтогенезу.

Висновки

У дисертації, відповідно до поставленої мети, вирішене актуальне наукове завдання, що стосується взаємозв'язку між функціонуванням NО-ергічної ланки регуляції та протіканням кисень-залежних процесів у щурів на різних етапах онтогенезу і зроблено наступні висновки:

1. Активація NО-залежної регуляторної системи у статево незрілих щурів шляхом внутрішньоочеревинного введення L-аргініну призводить до зниження показників мітохондріального дихання та енергозабезпечення у печінці незалежно від субстрату окиснення. За аналогічних умов у молодих щурів показники енергозабезпечення за окиснення сукцинату знижуються, а за окиснення б-кетоглутарату - підвищуються. У старих щурів введення L-аргініну призводило до протилежних змін - підвищення енергозабезпечення мітохондрій печінки при окисненні сукцинату та його зниження при окисненні б-кетоглутарату.

2. У міокарді активація NO-ергічної ланки за окиснення ФАД-залежних субстратів призводить до підвищення показників енергозабезпечення статево незрілих та старих щурів, тоді як введення інгібітора NО-синтази L-NNA сприяє підвищенню швидкостей поглинання кисню мітохондріями. Введення L-аргініну за окиснення НАД-залежних субстратів супроводжується зростанням показників АДФ-стимульованого дихання мітохондрій міокарда старих щурів.

3. За окиснення субстратів трансаміназного шунтуючого шляху введення L-аргініну призводить до підсилення споживання кисню та зниження ефективності окисного фосфорилювання у мітохондріях печінки статево незрілих та молодих щурів. Інгібування активності NO-синтази внутрішньоочеревинним введенням L-NNA в аналогічних умовах призвело до підвищення показників мітохондріального енергозабезпечення печінки старих щурів.

4. У міокарді із збільшенням віку інтенсифікуються процеси ліпопероксидації, тоді як у печінці та крові пероксидація ліпідів знижується. Активація системи L-аргінін-оксид азоту призводить до зниження вмісту ТБК-реактивних продуктів у печінці та крові статево незрілих та у міокарді старих щурів. Введення інгібітора NO-синтази L-NNA підвищує показник ліпопероксидації у печінці та крові старих щурів та знижує його у міокарді.

5. Активність супероксиддисмутази та каталази у тканинах щурів із віком знижується. Найбільш чутливою до зміни активності NO-ергічної ланки є активність ферментів системи антиоксидантного захисту старих щурів, у яких введення L-аргініну та L-NNA суттєво підвищує активність супероксиддисмутази та каталази печінки, міокарда і крові.

6. Основну роль у підтриманні антиоксидантного статусу організму на пізньому етапі онтогенезу відіграють ферменти глутатіон-залежної системи. Введення L-аргініну та L-NNA супроводжувалось підвищенням активності глутатіонпероксидази у печінці та міокарді статево незрілих, молодих і старих щурів та зниженням активності глутатіонредуктази.

Список публікацій за темою дисертації

1. Іккерт О.В., Муращук К.М., Гордій С.К., Гальків М.О. Особливості процесів перекисного окиснення ліпідів та активності ферментів антиоксидантного захисту у нестатевозрілих щурів за дії L-аргініну // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. 2005.№ 4. С. 19-23.

Здобувач провела дослідження по з'ясуванню впливу L-аргініну на про- та антиоксидантні особливості тканин статево незрілих щурів.

2. Муращук К., Іккерт О., Гальків М., Гордій С. Вплив L-аргініну на вікові зміни процесів перекисного окиснення ліпідів та активність системи антиоксидантного захисту у тканинах щурів // Укр. біохім. журн. 2007. Т.79, №5. C. 38-43.

Здобувач самостійно провела дослідження по вивченню ролі системи оксиду азоту на процеси ліпопероксидації та активність антиоксидантної системи у щурів різних етапів онтогенезу, взяла участь у аналізі даних та оформленні статті.

3. Муращук К. М., Іккерт О. В. Роль системи L-аргінін-оксид азоту у процесах енергозабезпечення щурів різних вікових груп // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна - 2007. вип.44, - С. 121-127.

Здобувач самостійно провела всі дослідження та статистичну обробку результатів, взяла участь в обговоренні та аналізі даних, написанні та оформленні статті.

4. Муращук К. М., Іккерт О. В., Гордій С. К. Процеси перекисного окиснення ліпідів та стан системи антиоксидантного захисту у щурів різного віку // Матеріали ХІ Ювілейної Міжнародної конф. “Інформотерапія: теоретичні аспекти і практичне використання”, присвяченої 16-річчю інформотерапії. Київ. 2005. С. 60.

Здобувач самостійно провела дослідження, взяла участь в статистичній обробці даних, їх аналізі, написанні та оформленні тез.

5. Муращук К.М., Іккерт О.В., Гордій С.К., Гальків М.О., Корчук Л.М. Роль NO у протіканні кисень-залежних процесів на різних етапах розвитку організму // Матеріали ІІ Міжнародної конф. студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. Львів. 2006. С. 435.

Здобувач самостійно провела дослідження, взяла участь в статистичній обробці даних, їх аналізі, написанні та оформленні тез, представила доповідь на конференції.

6. Муращук К.М, Іккерт О.В., Гальків М.О., Гордій С.К. Система антиоксидантного захисту старих щурів при дії L-аргініну // Матеріали IX Українського біохімічного з'їзду. Харків. 2006. С. 345.

Здобувач самостійно провела дослідження, взяла участь в статистичній обробці даних, їх аналізі, написанні та оформленні тез, представила доповідь на конференції.

7. Муращук К.М., Іккерт О.В., Гордій С.К. Оксид азоту та кисень-залежні процеси у нестатевозрілих щурів // Фізіол. журн. 2006. Т.52, №2. С. 6.

Здобувач самостійно провела дослідження, взяла участь в статистичній обробці даних, написанні та оформленні тез.

8. Муращук К.М., Іккерт О.В., Гордій С.К., Гальків М.О. Стан системи антиоксидантного захисту та функціонування мітохондрій печінки статево незрілих щурів за активації системи оксиду азоту // Матеріали VII Міжнародного симпозіумі “Биологические механизмы старения”. Харків. 2006. С. 37.

Здобувач самостійно провела дослідження, взяла участь в статистичній обробці даних, їх аналізі, написанні та оформленні тез, представила доповідь на конференції.

9. Муращук К., Іккерт О., Гордій С., Гальків М. Зміни активності ферментної ланки системи антиоксидантного захисту та інтенсивності процесів ліпопероксидації у тканинах щурів різного віку // Матеріали Міжнародної наукової конф., приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету імені Івана Франка “Механізми функціонування фізіологічних систем”. Львів. 2006. С. 105.