Биологическое действие ксенобиотиков

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Основные представления о БА и скрининге ксенобиотиков. Примеры скрининга

Свойство живых систем быть реакционно способным по отношению к любому ксенобиотику приводит к тому, что все химические соединения обладают биологической активностью.

Принцип «попадание-реакция» означает, что любое проявление биологической активности ксенобиотика связано с его способностью пройти путь от внешней среды до мишени, связаться с ней и вызвать ее реакцию.

Начало этого пути - первый контакт химического соединения с биологическим объектом может быть случайным (например, через загрязнение среды) или принудительным (например, введение лекарств), после чего чужеродное соединение и биологический объект взаимодействуют по соответствующим закономерностям.

Биологической активностью ксенобиотика называют его способность изменять функциональные возможности либо компонентов организма (in vitro или in vivo), либо живого организма в целом, либо сообщества организмов.

В практику должны вводиться только те соединения, которые подверглись биологическим испытаниям и только в соответствии с результатами этих испытаний. Таким образом, биологическим испытаниям должны подвергаться все синтезируемые ксенобиотики, т. е. необходимо создать производительную систему их испытаний на разные виды биологической активности.

Проверка большого массива ксенобиотиков на один или несколько видов биологической активности получила название скрининга.

В ХХ в. тотальная проверка большого массива химических соединений или природных объектов, направленная на выявление потенциальных лекарств, получила свое развитие как один из основных методов поиска новых лекарств и вообще химических соединений с заданным типом биологической активности.

Система тестирования ксенобиотиков по видам биологической активности может включать два взаимосвязанных подхода. Первый - уровень целевого объекта испытаний (человек, животное, растение, биогеоценоз), на который должно быть направлено действие искомого ксенобиотика, исходя из целей поиска (лекарства, ветеринарное средство, гербицид и т.д.), и второй подход - совокупность тест-объектов, базирующихся на использовании более примитивной организации живой материи, чем целевой. Использование второго подхода оправдано в тех случаях, когда первый не обеспечивает достаточной производительности и т.д. ксенобиотик трофический пестицид

Традиционный путь поиска, например, лекарственных средств (точнее, активных субстанций будущих лекарств) в современной фармакологии в довольно схематическом виде выглядит следующим образом. На фармакологических тестах организменного уровня определяют биологическую активность ряда химических соединений, затем улучшают их свойства путем химической модификации в соответствующих рядах соединений. После этого проводят новые испытания модифицированных веществ, снова их улучшают и т.д.; это делается до тех пор, пока указанная процедура не приведет к созданию наиболее эффективного в данном ряду соединения.

Однако эти реальные подходы ограничиваются одним или несколькими видами биологической активности и сравнительно малой выборкой ксенобиотиков из массива.

2. Особенности биотрансформации, поступления и выведения ксенобиотиков у разных организмов

Основные пути поступления токсических ксенобиотиков (промышленных ядов, пестицидов) в организм человека - это органы дыхания и кожа, а также пищеварительный тракт.

Проникая через биологические мембраны в сосудистое русло, ксенобиотик далее попадает в ткани к клеточным мишеням. Ряд гидрофильных ксенобиотиков выводится из организма человека в неизменном виде, но большая часть выделяется только после метаболических превращений.

Существенным фактором, влияющим на распределение ксенобиотиков и их способность к дальнейшей биотрансформации и экскреции является растворимость в липидах (коэффициент распределения).

Экскреция ксенобиотиков и их метаболитов через различные выделительные системы - заключительный этап в процессе поступления и трансформации. Экскреция осуществляется через почки, легкие, кожу, кишечник, слюнные, потовые, слезные, сальные железы, а также молочные железы при лактации.

Почечная экскреция ксенобиотиков - основной путь удаления из организма ксенобиотиков и продуктов их биотрансформации. В основе почечной экскреции лежат следующие биологические процессы: клубочковая фильтрация (вода, глюкоза, аминокислоты, белки с молекулярной массой менее 60 кД и ксенобиотики-неэлектролиты), канальцевая секреция (осуществляется с помощью ферментных систем мембранного транспорта, этим путем в мочу попадают химические вещества, являющиеся органическими кислотами или органическими основаниями), канальцевая реабсорбция (обратное всасывание метаболитов и ксенобиотиков в канальцах нефрона, кроме реабсорбции путем активного транспорта, в проксимальных и дистальных канальцах нефрона неионизированные формы веществ подвергаются реабсорбции и экскреции путем пассивной диффузии).

У растений нет специализированных путей поступления и выведения ксенобиотиков. Поступление чужеродных веществ в растения происходит главным образом через корни и листья.

Ксенобиотик проникает в ткань листа через устьица или кутикулу. Через кутикулу соединения диффундируют медленнее, чем через устьица.В последующем распределении ксенобиотиков в тканях и органах растений большую роль играют сосуды ксилемы и флоэмы. Ксенобиотики, переносимые по сосудам ксилемы (например, ряд гербицидов), поступая в корни растений, быстро создают фототоксические концентрации в наземных органах растений. В то же время очень редко отмечается аккумуляция флоэмнобильных ксенобиотиков в корнях при поступлении их через листья. Такая ситуация обусловлена главным образом экскрецией чужеродных веществ в ризосферу.Растения не имеют системы выделения, сравнимой с системой выделения животных, но их защитный механизм может включать связывание посторонних веществ некоторыми молекулами углеводов и накопление их в местах, лишенных метаболической активности (например, в вакуолях). Микроорганизмы способны разлагать многие сложные органические соединения на диоксид углерода и воду.

Различия между организмами в их реакции на действие ксенобиотиков могут быть очень существенными и обусловлены разной способностью метаболизировать эти вещества. В пределах одного вида уровень микросомной активности зависит от пола организма и стадии его развития. В разных органах - печени, кишечнике, легких и т. д. - активность также различна.

Микроорганизмы обычно содержат большое число ферментов, участвующих в процессах трансформации ксенобиотиков. Между микроорганизмами, обитающими во внешней среде и живущими внутри организма, существуют значительные различия в метаболизме ксенобиотиков. Так, многие микроорганизмы внешней среды, в отличие от кишечной микрофлоры, способны к более глубокой деградации ксенобиотиков (разрыву ароматических ядер и гетероциклических колец). Продукты расщепления служат для микроорганизмов единственным источником углерода.

В микробиологической трансформации ксенобиотиков различаются процессы метаболизма и кометаболизма. Под первым понимают превращение соединения до конечного продукта реакции, который не участвует в трансформации. Кометаболизм - это изменение структуры молекулы ксенобиотика, катализируемое ферментами микроорганизмов, которые выросли на субстратах или их метаболитах. Субстраты оказывают индуцирующее действие на такие ферменты.

Среди микроорганизмов чаще всего встречаются штаммы, осуществляющие неполную деградацию ксенобиотиков. Поэтому полное разрушение, например, пестицидов требует, как правило, совместного действия нескольких организмов и абиотических факторов.

Очень важен тот факт, что генетическая способность некоторых штаммов бактерий разрушать тот или иной ксенобиотик зависит от наличия в клетках плазмид.

В метаболизме некоторых ксенобиотиков бактериями действуют окислительные ферменты - диоксигеназы. В отличие от монооксигеназ диоксигеназы внедряют два атома кислорода в субстрат.

Растения способны к метаболическому превращению ксенобиотиков, не имеют органа или специальной ткани, ответственных за их метаболизм. Различные части растений содержат ферменты, катализирующие превращение ксенобиотиковМикросомальная система, участвующая в процессах биотрансформации, распространена в разных растительных органах и тканях: корнях, корнеплодах, корневищах, листьях и зрелых плодах. Трансформация ксенобиотиков у растений происходит, как и у животных, за счет реакций окисления, восстановления, гидролиза и последующей конъюгации. Цель у растений, как и у животных, одна - инактивировать ксенобиотик и довести его до растворимого состояния с тем, чтобы в дальнейшем либо изолировать в клеточных вакуолях, либо вывести через корневую систему и листья. Для растений характерна конъюгация с глюкозой; иногда происходит конъюгация ксенобиотика с аминокислотой или белками

3. Влияние ксенобиотиков на физико-химические свойства цитоплазмы, проницаемость биологических мембран и метаболические процессы в клетке

Цитоплазма - главное содержимое любой живой клетки - основа клеточной организации. Физико-химические изменения в цитоплазме являются ведущими в процессах жизнедеятельности клетки.

Вязкость. цитозоль, заполняющее пространство между клеточными органеллами, содержит систему микрофиламентов. Коллоидный раствор может быть золем (невязким) или гелем (вязким). Внешние слои цитоплазмы по своей конституции ближе к гелям.

Взаимодействие гидратированных ионов ксенобиотиков с заряженными белковыми молекулами цитоплазмы может вызывать переходы золь - гель и обратно. Катионы, имеющие поливалентный заряд, притягиваются сильнее к заряженной коллоидной частице по сравнению с одновалентными. Поэтому в первом случае молекула коллоидной частицы теряет часть гидратной воды, и цитоплазма превращается в вязкую гелеобразную массу. Во втором случае из-за слабого притяжения гидратные оболочки белка и иона сливаются и цитоплазма оводняется, превращается в жидкий раствор - золь.

Движение цитоплазмы. Движение цитоплазмы в животных и растительных клетках довольно распространенное явление, которое играет важную роль в осуществлении обмена и распределении веществ внутри клетки, а также характеризует уровень жизнедеятельности клетки.Скорость движения цитоплазмы (СДЦ) зависит от света, температуры, рН, ксенобиотиков.

Изоэлектрическая точка цитоплазмы. Все амфолиты способны давать двойственные ионы: положительные и отрицательные (аминокислоты с группами NH₂ и СООН). Кислые группы, теряя протон, становятся отрицательно заряженными СОО^- +Н⁺, основная группа, присоединяя протон, становится положительно заряженной NН₂+Н⁺>NН₃⁺.При конденсации полипептидов образуется белковая молекула, сохраняющая амфотерный характер, а также кислые и основные группы. Эти ионные группы и определяют электрические свойства белковых молекул (заряд белковой молекулы равен сумме зарядов ионных групп).

На ионизацию кислых и основных групп белка сильно влияет значение рН среды. В кислой среде аминокислоты присоединяют ион водорода (R-NН₂+Н⁺>R-NН₃⁺), образуя положительный заряд, в щелочной диссоциирует карбоксильная группа (СООН<>СОО^- +Н⁺), становясь отрицательно заряженной.

Значение рН, при котором белок имеет минимальный электрический заряд, принято называть ИЭТ. В растворе с рН, равном ИЭТ, белок не движется ни к одному из полюсов, тогда как в кислой перемещается к катоду, а в щелочной - к аноду. Различные ксенобиотики, имеющие кислотные или щелочные свойства, способны сдвигать величину рН в ту или иную сторону и тем самым изменять ИЭТ цитоплазмы.Влияние ксенобиотиков на проницаемость мембран. Биологическая способность ксенобиотиков определяется их способностью взаимодействовать с клеточной мембраной и, следовательно, изменять ее проницаемость для ионов и органических субстратов. За счет структурных перестроек изменяется условия для диффузии,т.е. изм-ся ионный канал. актиный транспорт ингибируется за счет воздействия на переносчики

4. Общие представления об избирательном действии ксенобиотиков. Определение понятия избирательности. Роль физико-химических свойств ксенобиотиков в процессах избирательности

Избирательность вещества - это его способность воздействовать на клетки, ткани, организмы только одного определенного типа и не влиять на другие, даже находящиеся в контакте с первыми.Существует три основных фактора (механизма), определяющих возможность проявления избирательного действия вещества:

Избирательность действия, обусловленная преимущественным накоплением и распределением вещества, может быть вызвана морфологическими особенностями.Этот тип избирательности основывается на различии в распределении и накоплении. Агент, токсический как для полезных, так и для вредных клеток, накапливается только в последних. Примеры: избирательное действие серной кислоты на посевы; йод, избирательно накапливающийся в щитовидной железе и т.д.

Избирательность, обусловленная биохимическими различиями. Избирательность действия ксенобиотиков определяется различиями в процессах их биотрансформации, а также зависит от его влияния на какой-либо важный биохимический процесс, который у чувствительного организма имеется, а у устойчивого или отсутствует, или не столь чувствителен к данному веществу. Примеры.Одним из избирательных эффектов ДДТ, проявляющихся у птиц, является наблюдаемое под его действием нарушение кальциевого обмена, вследствие чего яичная скорлупа оказывается более тонкой. Такие яйца при насиживании раздавливаются, и птицы не выводят птенцов.

Цитологические различия как основа избирательного действия. Известно, что строение клеток у животных и растений различно. Клетки состоят из отдельных компонентов (клеточных органелл, компартментов и др.), у которых видовые особенности выражены очень четко. Различаются между собой даже клетки одного организма, но разных тканей.Примеры.У растений нет нервной системы и мышечных клеток. Поэтому фосфорорганические соединения, блокируя проведение нервного импульса, поражают насекомых и не приносят заметного вреда растениям. На этом явлении основана весьма эффективная система химической защиты растений от насекомых.Уникальность такой структуры, как хлоропласта, представляет возможность, например, для уничтожения растений (сорняков), не причиняя вреда пчелам и др.

Свойства самого ксенобиотика оказывают большое влияние на избирательность действия и, в частности, степень его ионизации. Ионы не образуют с местами связывания ковалентных связей, а, следовательно, могут легко отрываться. Поэтому для поддержания активного центра в насыщенном состоянии необходимо, чтобы в растворе, окружающем место связывания (рецептор), постоянно находился избыток данных ионов.

5. Тестирование БА ксенобиотиков. Стандартизация и подбор тест-систем. Специфические и неспецифические модели (тест-объекты)

Когда мы говорим о биологической активности ксенобиотиков, то для ее определения, естественно, необходимы тест-объекты, на которых регистрируются определенные виды биологической реакции (гибель, изменение роста, изменение различных метаболических реакций и т. д.) при их действии; эти реакции часто называются тест-реакциями. В этой связи следует рассмотреть принципы отбора и стандартизации тест-объектов при классификации ксенобиотиков по видам биологической активности.

Совокупность набора тест-объектов клеточно-тканевого уровня должна удовлетворять главному принципу системы - представительности выбранных биологических тест-объектов (БТО) по отношению к моделям биосферы и организму человека с соответствующим набором характеристик (тест-реакций), т. е. максимально удовлетворять поставленным задачам.

Предлагается подбирать тест-объекты по следующим критериям: по молекулярным рецепторам, являющимся мишенями для веществ с данными видами активности; по принципу надмолекулярной организации и молекулярному составу (близость по структуре); по функциональному сходству; по органному или тканевому происхождению; по близости патологического состояния тест-объекта и реального объекта.

И, естественно, следует учитывать последний признак - близость патологического состояния тест-объекта и реального объекта.

Существует ряд методических подходов для стандартизации, подбора, приготовления тест-объектов, например: стандартизация условий содержания животных; выбор наиболее щадящих условий выделения и инкубации; использование дополнительных воздействий, переводящих тест-объект в заданное состояние и т. д.

В конечном итоге для каждого тест-объекта клеточно-тканевой природы можно создать формализованный стандарт в виде набора количественных параметров, характеризующих стационарные и кинетические показатели тест-объектов.

Необходимо отметить, что следует различать специфические и неспецифические модели тест-объектов. Первые как раз и имеют четко выраженные молекулярные мишени-рецепторы (вспомним первый критерий), реагирующие на определенные химические соединения, т.е. на определенные виды биологической активности.

Однако неспецифическая модель является обязательным компонентом для классификации ксенобиотиков. С одной стороны, оказывается возможным различать химические соединения, обладающие разными видами активности на полностью неспецифической для этих видов активности модели.

6. Реакции биотрансформации неорганических ксенобиотиков

Реакции восстановления атомов с переменной валентностью. Трансформация арсенатов As⁵⁺ в арсениты с As³⁺, селенатов с Se⁶⁺ в селениты Se⁴⁺, хлоратов Cl⁺⁶ в хлориты Cl⁺⁴. При трансформациях этого типа токсичность вещества нередко возрастает.

Реакции метилирования. Недавно было доказано, что микроорганизмы могут использовать реакции метилирования для превращения металлов в металлорганические соединения. Особое значение имеет способность некоторых микроорганизмов превращать ионы ртути в метил- и диметилртуть:

Hg²⁺ + донор метильной группы CH₃ - Hg⁺,

CH₃ - Hg⁺ + донор метильной группы CH₃ - Hg⁺ - CH₃.

В этой связи повышается опасность отравления живых организмов. В отличие от металлической ртути метилртуть почти полностью поглощается организмом и лишь незначительная часть выводится из него. Метилртуть распределяется во всех тканях, тогда как неорганическая ртуть накапливается главным образом в печени и почках. Кофактором, принимающим участие в переносе метильной группы к иону ртути, является метилкорриноид - вещество, содержащее витамин В₁₂.

Реакции конъюгации. Неорганический цианид обезвреживается в живых организмах конъюгацией с серой, в результате которой образуется тиоцианит:

SSO₃^2- + CN^- SO₃^2- + SCN^-.

Процесс катализирует роданаза. Фермент находится в митохондриях печени различных видов животных и растений. Донорами серы служат тиосульфаты, тиосульфонаты, полисульфиды.

Путь биотрансформации сернистого газа (SO₂). Довольно подробно изучен в растениях. Первая стадия - окисление в сульфиты (SO₃^2-) и сульфаты (SO₄^2-) происходит в клеточной стенке при участии пероксидазы, затем происходит включение в фотосинтетический метаболизм серы.

Аденозинфосфосульфат (АФS)-первый продукт в реакции взаимодействия SO₄^2- с АТФ. Активированный сульфат (фосфо-АФS) связывается с серосодержащим переносчиком белковой природы (СS) и образуется комплекс C-SO₃, который восстанавливается до сульфида (CS- SH) при участии света через ферродоксин (Fd_восст, Fd_окисл). При переносе на о-ацетилсерин (AS) образуется цистеин и метионин. В случае высокого содержания сульфаты аккумулируются в виде глутатиона. Если восстанавливающая сила превышает имеющиеся в наличии источники углерода, сера, соединяясь с водородом, образует дисульфид (H₂S), который теряется в результате газового обмена.

Эффективность реакций детоксикации ограничена. При продолжительном поглощении SO₂ и увеличении кислотности буферная способность цитоплазмы становится недостаточной, уровень сульфитов в хлоропластах увеличивается, и SO₂ занимает места связывания СО₂ на рибулозодифосфаткарбоксилазе. В результате этого происходит ингибирование вторичных процессов фотосинтеза и разрушение третичной структуры ферментов.

7. Общие представления о стадиях биотрансформации ксенобиотиков. Ферментные системы, основные закономерности действия ферментов. Индукция защитных свойств организма

Все биохимические реакции в живых системах носят ферментативный характер.

Все ферменты имеют белковую макромолекулярную природу и упрощенно могут быть представлены в виде сферических или палочковидных образований, на поверхности которых располагаются активные и регуляторные центры. Как сам фермент, так и его центры состоят из упорядоченно расположенных, создающих определенный пространственный узор полимерных нитей, построенных из аминокислот. Эти аминокислоты последовательно сшиты между собой ковалентными (пептидными) связями. Для каждого фермента характерен свой строго обязательный геометрический узор активного и регуляторного центров, что определяет его высокую специфичность к превращаемым веществам-субстратам.

Реакция начинается после того, как образуется фермент-субстратный комплекс, для чего необходимо строгое геометрическое соответствие их форм (пространственных и зарядовых геометрий).

Как же ферменту все-таки удается резко ускорить течение реакции? Для процесса взаимодействия двух веществ А и В с образованием продукта С необходимо, чтобы к моменту столкновения А и В они обладали таким запасом энергии, которого было бы достаточно для критической деформации электронных облаков молекулы, т.е. для разрыва и новообразования прочных химических связей, превращающих субстраты А и В в новый продукт С. Этот энергетический барьер, так называемая энергия активации, - главный ограничитель скорости химического процесса. Действие же фермента сводится к снижению высоты барьера. С этой целью фермент вступает в прямой контакт (комплекс) с молекулами субстрата, снижая энергетический барьер несколькими способами. Во-первых, на упругом полимерном каркасе фермента может растянуться и ослабиться «неугодная» химическая связь между атомами субстрата. Во-вторых, субстрат на ферменте может приобрести способность принимать множество конфигураций, из которых хотя бы одна облегчит переход к новому веществу. В-третьих, не исключена возможность сближения и принятия нужной ориентации реагирующих молекул субстрата. Все эти события разыгрываются на активных центрах.

Есть еще и регуляторные центры. В них не происходят каталитические превращения. В зависимости от избытка или недостатка продуктов ферментативной реакции эти центры замедляют или ускоряют ход процесса. В самом простом случае при избытке продукт присоединяется к центрам и предотвращает наработку новых. Когда продукта мало, регуляторные центры освобождаются и перестают тормозить работу активных центров.

8. Принципы организации системы тестирования БА ксенобиотиков. Биологический эпиморфизм. Основные цели биотестирования

Цели определения биологической активности в общем виде сводятся к следующим:- Выявление соединений, обладающих полезными для человеческого организма свойствами).- Обнаружение вредных для человеческого организма биологических активностей у испытуемых ксенобиотиков; Нахождение ксенобиотиков, влияющих на продуктивность и биологическое равновесие естественных и искусственных экосистем.- Установление таких биологических активностей у испытуемых чужеродных соединений, которые могут вызвать неконтролируемое опасное или недостаточно прогнозируемое нарушение биологического равновесия природных экосистем (способность соединений резко увеличивать вероятность гибридизации вирусов гриппа).- Нахождение химических соединений, которые могут быть реактивами для исследовательских работ в биологии и медицине и которые могут привести к развитию принципиально новых методов исследования. - Накопление знаний, позволяющих предсказать виды биологической активности по химической структуре вещества.

Индустриальные масштабы испытаний и их промышленная организация требуют введения нового принципа, который позволил бы на порядки увеличить производительность системы и обеспечить возможность работы с малым количеством испытуемого вещества.

Поэтому возникает необходимость обратиться к исследованиям на тканевом, клеточном, молекулярном уровнях строения живого, что, в свою очередь, необходимо для выяснения механизма действия конкретного ксенобиотика. Вот здесь вступает в право использование принципа качественного подобия - эпиморфизма тест-объекта и целевого объекта в отношении определенного биологического свойства ксенобиотика. Главные методологические трудности при использовании эпиморфных моделей заключаются в том, чтобы определить оптимальный уровень детализации модели по отношению к моделирующему процессу, т.е. целостному организму. Этого можно достичь исходя из того, что в системе тест-объектов на клеточном уровне организации представляются все царства живого и основные типы тканей организма человека, а также из того, что у тест-объектов в совокупности определяются все основные реакции (гибель, повреждение, адаптация, проницаемость, метаболизм ксенобиотиков, синтез белка и ДНК, возбудимость и т.д.).

Общий принцип организации биологических испытаний чужеродных соединений - это многоуровневый набор тестов с повышающейся на каждом уровне сложностью биологического тест-объекта (модели) и соответственно растущей детализацией и надежностью прогноза вида биологической активности. Первый уровень - базовый, через него проходят все соединения, которые в соответствии с результатами прохождения этого первого уровня направляются затем к специализированным тестам.

Базовый уровень состоит из трех подуровней. Биологическая активность ксенобиотика уже включена в его химическую структуру. Поэтому на первом подуровне сведения о структуре и некоторых свойствах соединений вводятся в компьютер, который производит первичный анализ принадлежности соединения данной структуры к определенным уже известным классам биологической активности. На втором подуровне эта классификация производится на основании экспериментального определения дополнительных физико-химических характеристик веществ. На третьем подуровне в систему вводятся тест-объекты. Основным тест-объектом этого подуровня является изолированная клетка. На этом подуровне регистрируется способность чужеродных химический соединений влиять на такие основные свойства живой клетки, как рост, дыхание, энергетика, биосинтез, способность к генетическим изменениям и т. д. База пропускает весь массив испытуемых ксенобиотиков, выдавая для каждого из них единообразный набор характеристик - основной биологический «паспорт».

Второй уровень, меньший по пропускной способности, - надстройка. Надстройка работает в режиме преимущественной ориентации на первые две цели: нахождение химического соединения, обладающего полезными для человеческого организма свойствами, и обнаружение вредных для человеческого организма биологических активностей испытуемых химических соединений.

Испытанию ксенобиотиков на множество видов биологической активности должна предшествовать операция предварительной сортировки на моделях, допускающих создание испытательных систем высокой производительности, т.е. на предварительном этапе на упрощенных (модельных) системах необходимо предсказать вид биологической активности и определить ксенобиотики, которые, по вероятным оценкам, не обладают определенными видами активности (резус) или являются токсичными (исключаются из системы испытаний).

Основная идея предиспытания состоит в том, чтобы реализовать следующий методологический подход. Заменить модели организменного уровня некоторой совокупностью моделей доорганизменного уровня. Таким образом, достигается цель более экономного расхода химического соединения на единичное испытание и реальнее становится автоматизация испытаний с технологической стороны. В этом случае при определении наиболее важных видов биологической активности и перенесении закономерностей на целостный организм подбирается совокупность адекватных моделей на основе принципа биологического эпиморфизма. Вначале исследуются два массива ксенобиотиков: новые и известные. Это связано с тем, что среди известных соединений, не испытывавшихся ранее на биологическую активность, могут быть обнаружены искомые лекарства. Кроме того, для известных тестируемых ксенобиотиков могут быть выявлены новые виды биологической активности. Все это заставляет включить в систему испытаний как вновь синтезируемые, так и уже испытанные на отдельные виды биологической активности ксенобиотики.

При дальнейших испытаниях проводится предварительная оценка безопасности отобранных ксенобиотиков. С учетом полученных результатов по фармакологической активности на более простых моделях последующая проверка ксенобиотиков проводится на животных. Ксенобиотики, у которых обнаружена нужная для практических целей активность, проходят испытания по полной программе, включая тестирование на основные и побочные виды активности.

9. Биоаккумулирование ксенобиотиков. Коэффициент накопления. Одно- и многоразовые дозы

Способность накапливать различные элементы даже при очень низком содержании их в среде называется аккумулированием вещества организмом (кумулятивный эффект).

Способность организмов к накоплению веществ характеризуется таким параметром, как коэффициент накопления.

содержание (концентрация) вещества в организме

N = ---------------------------------------------

содержание (концентрация) в окружающей среде

Разовая доза и период полувыведения из организма. Введение в организм разовой дозы вещества приводит к появлению определенного количества этого вещества в тканях. В процессах метаболизма и экскреции это вещество выводится из организма с определенной скоростью.

Многократное дозирование. В природной среде воздействие вещества на организм редко ограничивается разовой дозой. Если в окружающей среде вещество распределено повсеместно, организм подвергается его воздействию непрерывно.

Важно отметить, что со временем содержание вещества в организме достигает некоторого предельного максимального значения, так как при повышении концентрации в тканях ежедневное его выведение увеличивается и становится равным дозе, вводимой ежедневно.

При увеличении первоначальной вводимой дозы повышается количество выводимого вещества и его содержание в организме, т.е. устанавливается новое равновесие.

Максимальная концентрация вещества в тканях зависит от размера дозы (повышается при ее увеличении) и от периода полувыведения или скорости выведения. Вещества с большим периодом полувыведения накапливаются в больших концентрациях, чем вещества с меньшим периодом полувыведения. Другим важным фактором является время, необходимое для достижения состояния равновесия.

Следует отметить, что организмы, таким образом, накапливают вещество в своих тканях в соответствии со скоростями его введения и выведения. Причем степень накопления вещества в организме изменяется в широких пределах и во многих случаях коррелирует с коэффициентом распределения вещества.

10. Характеристика факторов, влияющих на биоаккумулирование ксенобиотиков. Трофические цепи и экологические пирамиды

Поскольку явление аккумулирования включает взаимодействие вещества с организмом, то факторы, определяющие степень его накопления, должны включать характеристики как самого ксенобиотика, так и организма. Одной из характеристик самого вещества является устойчивость. Для того чтобы ксенобиотик мог накапливаться в организме, его воздействие на организм должно быть достаточно длительным, особенно когда оно осуществляется через цепь питания. Следовательно, любое аккумулирующееся вещество должно быть устойчивым к возможным в данной среде процессам разрушения.

Площадь поверхности. Если процесс аккумулирования включает физические стадии (адсорбция, диффузия), степень накопления чужеродного вещества в большей мере зависит от площади поверхности контакта организма с окружающей средой (адсорбция растениями пестицида из воздуха после опрыскивания).

Величина поверхности на единицу массы или объема повышается при уменьшении размера частицы. Следовательно, если адсорбция в процессе аккумулирования играет значительную роль, то можно ожидать, что более мелкие организмы будут накапливать в единице объема большее количество вещества, чем более крупные.

Распределение. Большинство организмов содержит значительные жировые отложения; в этих тканях накапливаются ксенобиотики с большими значениями коэффициента распределения.

Способность ксенобиотика распределяться в жировых депо организма также может влиять на его период полувыведения. Жировые ткани в процессах метаболического преобразования являются не самыми активными. Следовательно, если вещество распределилось в таких тканях, оно может сохраняться там до тех пор, пока организм не израсходует весь жир.

Устойчивые в окружающей среде ксенобиотики очень плохо растворяются в воде. Следовательно, среда обитания конкретного организма может существенно влиять на его способность аккумулировать ксенобиотики. Организмы, обитающие на дне среди осадков, подвергаются воздействию более высоких концентраций ксенобиотика, чем находящиеся в верхних слоях того же самого участка водоема.

На процесс аккумулирования может влиять и размер частиц, проглатываемых организмами. Поскольку на более мелких частицах, как уже отмечалось, адсорбированное на их поверхности чужеродное вещество содержится в более высоких концентрациях, организмы, проглатывающие такие частицы, будут подвергаться воздействию более высокого содержания ксенобиотика.

Важным фактором является и количество потребляемой пищи. Организмы, нуждающиеся в относительно большом количестве пищи, могут аккумулировать чужеродное вещество из окружающей среды в большей степени при условии, что процесс накопления ксенобиотика не компенсируется более активным процессом его выведения.

Цепь питания. Ксенобиотики в массовых количествах поступают в неорганические элементы биосферы (воздух, воду, почву). Находясь во внешней среде, чужеродные соединения взаимодействуют с различными органическими элементами биогеоценозов - микроорганизмами, растениями, животными, поступая в конечном итоге по трофическим цепям в организм человека.

Установлено, что по мере движения ксенобиотика по пищевой цепи к следующему консументу, в организме которого он метаболизируется в незначительной степени, происходит существенное увеличение концентрации чужеродного вещества.

Для лучшего понимания закономерностей движения по пищевым цепям продуктов питания, а также попавших в биоценозы ксенобиотиков строятся так называемые экологические пирамиды. В экологических пирамидах схематически учитывают плотности популяций (число особей на 1 м²), биомассы (грамм сухого или влажного вещества на 1 м²) или продуктивность в энергетических эквивалентах (джоулей на 1 м² в год) для всех членов каждого трофического уровня в данном биоценозе.

В условиях поступления в организм чужеродных химических веществ, которые не могут быстро метаболизироваться и полностью экскретироваться во внешнюю среду, начинается накопление этих веществ по ходу пищевой цепи. При этом, поскольку организмы-потребители, стоящие на более высоких уровнях экологической пирамиды, обладают меньшей суммарной биомассой по сравнению с организмами предыдущего уровня, происходит последовательная биоконцентрация токсикантов, достигающая максимальных значений у конечных консументов, которыми могут являться люди.

Итак, в результате процессов абсорбции, распределения и биоконцентрации, зависящих как от физико-химических свойств ксенобиотиков, так и от экологических взаимоотношений в пищевых цепях, в организмах человека, животных и растений происходит аккумулирование ксенобиотиков, сопровождающееся в ряде случаев их специфическим токсическим действием.

11. Разнообразные виды БА, причины ее обуславливающие. Системы классификации биологического действия ксенобиотиков

Достаточно общее определение биологической активности ксенобиотиков, большое число потенциальных мишеней приложения чужеродных соединений приводят к огромному разнообразию видов биологической активности, которое определяется факторами:

множеством биологических объектов, их состояний и протекающих в них реакций. Поскольку любой живой организм индивидуален, можно говорить об индивидуальной реакции на данный ксенобиотик;

способом попадания в организм (доза, физическая форма вещества, временной режим введения, место введения и т.д.);

наличием или отсутствием дополнительных воздействий, которые предшествуют, сопутствуют или следуют за введением химического соединения. Такими воздействиями могут быть другие вещества или их комбинации, другие искусственные или естественные факторы (физически-электромагнитные, гравитационные поля, температура, давление и т.д.; биологические, обусловленные влиянием, например, других организмов). Одновременное действие нескольких ксенобиотиков может изменить биологические эффекты каждого из них;

способом, временем наблюдения, принципом подбора биообъекта, анализом информации и т.д.

В более широком плане, кроме токсичности и опасности, всякое влияние ксенобиотика на объект можно охарактеризовать некоторыми элементами проявления его биологического действия, на основании которых возможно создать систему классификации наблюдаемых явлений, используя различные критерии:

1. По типу биологического действия на мишень (мембранотропные вещества, разобщители дыхания, ингибиторы биосинтеза ДНК, РНК и др.).

2. По видам токсичности и опасности (эмбриональная, мутагенная, канцерогенная).

3. По избирательности действия ксенобиотиков: вещества могут быть токсичными по отношению к разным организмам.

4. По концентрационным пределам (пороговым значениям) токсического и/или опасного действия.

5. По характеру фармакологического действия (снотворные, нейролептики, гормональные и т. д.).

12. Система оценки первичной безопасности ксенобиотиков: характеристика тест-объектов и тест-реакций.

Рассмотрим, как можно решить одну из упомянутых целей биологического испытания - первичную оценку биологической безопасности ксенобиотика на субклеточном и тканевом уровнях в автоматизированном режиме. В этом случае система включает три подсистемы: информации, экспериментальную и управляющую.

Первая подсистема производит автоматизированный сбор, обработку полученных теоретических экспериментальных данных и формирует итоговый документ о биологической активности испытуемого ксенобиотика. Управляющая подсистема в соответствии с целями и задачами производит работы по последовательному переключению испытаний на соответствующую тест-систему, осуществляет смену и дозировку экспериментальных растворов, поддерживает заданный (временной) режим испытаний и т.д. Основные события по выявлению биологической активности ксенобиотика разыгрываются в экспериментальной подсистеме, базирующейся на многоуровневом подборе тест-объектов, позволяющих провести оценку токсических, мутагенных, канцерогенных и других эффектов.

Примерный перечень тест-объектов и тест-реакций, используемых в системе первичной оценки безопасности ксенобиотиков

Биологическая активность	Тест-объект	Функциональное назначение (тест-реакция)
Генерализированная реакция клеток	Водоросли, бактерии, дрожжи	Определение концентрации, при которой наблюдаются изменения формы, размеров клеток, отделы структур и т. д.
Проницаемость	Кожа лягушки, стенка желудка и стенка тонкого кишечника крысы и др.	Определение скорости проникновения ксенобиотика, оценка изменений
Острая токсичность	Бактерии, дрожжи, водоросли, эритроциты, лимфоциты	Установление зависимости эффект-концентрация (доза) - время (LD50 , LC50 )
Токсичность для Элементов генетической системы	Бактерии, дрожжи, водоросли, клетки высших растений, дрозофила	Определение тропности к ДНК, способность вызывать мутации
Токсичность для иммунной системы и клеток крови	Эритроциты, лимфоциты, альбумиты, сыворотка крови	Установление концентрационно-временных эффектов, реакция антиген-антитело, бласттрансформация лимфоцитов
Токсичность для Половых клеток	Сперматозоиды, яйцеклетки	Влияние на подвижность, деление

13. Экологический мониторинг среды. Биотесты и биоиндикаторы. Использование приемов биотестирования в системе экологического мониторинга

Технологические и технические решения, реализованные в системе биологических испытаний, могут быть широко использованы в конкретных системах и комплексах для контроля за состоянием окружающей среды и отдельных ее блоков: атмосфера, вода, почва. Обращение к этой системе может стимулировать развитие одного из наиболее перспективных направлений в процедуре контроля - использование биологических объектов и разработке на их основе биодатчиков.

Все чаще начинают использовать биологические методы контроля, с помощью которых наблюдение ведется за реакцией на загрязнение живого объекта, т.е. объект выступает как составная часть измерительной системы.

Возможны три различных подхода к применению биологических объектов (БО) в качестве тестовых:

1. Использование организмов, входящих в данный биогеоценоз, за состоянием которых ведется слежение (биоиндикаторы).

2. Использование организмов, исходно не имеющих отношения к тестируемому биогеоценозу, но вводимых туда искусственно (экзогенные биоиндикаторы).

3. Использование объектов, не имеющих отношения к данному биогеоценозу, выращенных или взятых в контролируемых условиях и применяемых в качестве чувствительных элементов прибора, контролирующего состояние среды (биодатчик).

Одной из неотложных задач охраны природы является создание мониторинга - системы непрерывного контроля за химическим загрязнением среды. В настоящее время в мониторинге предпочтение отдается физико-химическим методам контроля, позволяющим измерять концентрации компонентов или других показателей среды. Законодательно допустимый уровень загрязнения среды химическими веществами определяется предельно допустимой концентрацией (ПДК) для каждого вещества.

Для создания системы мероприятий, обеспечивающей безопасность людей в среде, загрязненной продуктами химической деятельности человека, необходимы: разработка научно обоснованных подходов для выбора критериев, определяющих безопасность человека и других живых компонентов биосферы, а также развитие технологических и инженерно-технических методов и техники экспресс-анализа, обеспечивающих непрерывный контроль за состоянием среды.

При проведении фундаментальных исследований система дает возможность установить корреляцию между действием определенных типов биологической активности на различных уровнях сложности живой материи и ее компонентов (организм, ткани, клетки, субклеточные структуры, биополимеры). Методологически это открывает подходы к пониманию механизмов «отрицательного» действия определенных классов ксенобиотиков и ведет к тому, чтобы сформулировать на этой основе задания на разработку защитных мероприятий.

14. Простая и облегченная диффузия ксенобиотиков через биологические мембраны, их отличительные черты

При пассивной диффузии ксенобиотики проходят через мембрану в результате случайного молекулярного движения, и величина потока линейно зависит от концентрации и коэффициента проницаемости мембраны для данного вещества.

Биологические мембраны, как известно, представляют собой мозаичную структуру, состоящую из липидов, структурных белков, белков-ферментов и других компонентов. «Сердцевина» мембраны представляет собой в основном гидрофобную область, поэтому неполярные вещества сравнительно легко проникают в клетки.

Пассивный перенос - это движение вещества по градиенту электрохимического потенциала без затраты энергии, т. е. движущей силой пассивного транспорта веществ служит градиент электрохимического потенциала.

Хорошо проникают через мембраны такие гидрофильные вещества, как глицерин, мочевина и др., радиус молекул которых не превышает 0,3 нм. Предполагают, что эти молекулы проходят через особые участки мембраны, так называемые «поры» (каналы). Аналогично считают, что заряженные частицы (ионы) движутся через ионные каналы.

Через ионные каналы осуществляется не только транспорт веществ, они также непосредственно участвуют в передаче сигнала возбудимым клеткам (генерация потенциала действия). Существуют хемовозбудимые (рецепторы ацетилхолина, -АМК, глутамата, глицина и др.) и электровозбудимые (натриевые, калиевые, хлорные и др.) каналы.

Довольно подробно изучены ацетилхолиновый, натриевый и другие каналы мембран различных клеток.

Канал - это две макромолекулы, образующие в мембране пору через бислои липидов. В поре имеется узкий селективный фильтр вблизи наружной поверхности мембраны и воротное устройство вблизи ее внутренней поверхности. Пространство между селективным фильтром и воротами получило название туннеля. Сенсор напряжения, расположенный в липидном слое, управляет открытием ворот под влиянием внутримембранного поля. Расширенные части канала у наружной и внутренней поверхности образуют устья (или вестибюли).

Облегченная диффузия. Вещества, нерастворимые в липидах, с размером молекулы более 0,3-0,4 нм, не диффундируют через мембраны. Для объяснения высокой проницаемости клеточных мембран по отношению к сахарам, аминокислотам и некоторым другим соединениям была выдвинута концепция «переносчиков», связывающихся с транспортируемым веществом и таким образом «облегчающих» их прохождение через мембрану. Такая облегченная диффузия происходит по градиенту концентрации без затрат энергии и относится к ё транспорту.

В основе механизма облегченной диффузии лежит обратимое соединение транспортируемого вещества со специфическим переносчиком, и образующийся комплекс вещество-переносчик диффундирует внутри мембраны от наружной поверхности к внутренней, где комплекс диссоциирует с высвобождением вещества внутрь клетки. Свободный же переносчик диффундирует назад к наружной поверхности мембраны, где соединяется с новой молекулой вещества, и цикл повторяется.

Развивается также тетрамерная модель облегченного переноса. Согласно этой модели транспорт осуществляется не в результате присоединения переносимого субстрата к подвижному переносчику, а путем «внутреннего» переноса субстрата через белковый тетрамер, встроенный в мембрану (фиксированный переносчик).

Можно отметить ряд характерных отличий между облегченной и простой диффузией.

1. При простой диффузии поток вещества пропорционален внешней концентрации и все время возрастает с увеличением последней. При облегченной диффузии кривая, описывающая поток веществ через мембрану, стремится к насыщению при концентрациях, обеспечивающих связывание всех молекул переносчика.

2. Наличие специфических переносчиков, взаимодействующих с веществами определенного строения, обусловливает резко выраженную зависимость проникающей способности вещества от его химической структуры и, в частности, от пространственной конфигурации его молекул.

3. Облегченная диффузия, в отличие от простой, может ингибироваться некоторыми соединениями (иногда в весьма малых концентрациях), которые блокируют переносчик.

15. Влияние физиологических, генетических и факторов окружающей среды (ОС) на биотрансформацию ксенобиотиков

Скорость, с которой протекают реакции метаболизма, и их относительная важность зависят от многих факторов, в результате чего происходят изменения в картине метаболизма и возникают различия в токсичности. Эти факторы по своему происхождению могут быть генетическими, физиологическими или связанными с условиями окружающей среды.

К генетическим факторам относятся видовые различия и различия внутри одного вида.

К физиологическим факторам, которые влияют на метаболизм, относятся возраст, пол, состояние питания, заболевания и т.д.

К факторам окружающей среды можно отнести стресс из-за неблагоприятных условий, облучение ионизирующей радиацией, свет, ОВП и т.д., наличие других ксенобиотиков, а также большое влияние на процессы (скорость) метаболизации оказывает природа (структура) самих ксенобиотиков

Стресс. Неблагоприятные внешние условия приводят к увеличению микросомального окисления, зависящего от НАДФН₂, т.е. интенсивность метаболического превращения повышается.

...