Изолированные протопласты, получение и применение

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Биологический факультет

Кафедра биохимии и биотехнологии

Реферат

на тему: «Изолированные протопласты, получение и применение»

Выполнила: Сазанова К.В.

Уфа - 2015

Изолированные протопласты

Изолированные протопласты представляют собой клетки, лишенные оболочки. Оболочка растительных клеток состоит главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ.

Для ее разрушения применяют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Впервые изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов было осуществлено Е. Кокингом.

В настоящее время технология получения протопластов отработана для ряда культурных растений: табак, перец, баклажан, картофель, томаты, соя, клевер люцерна морковь, рапс и др. (рис.1).

а б

Рис. 1 Протопласты табака (а) и томата (б) (Бричкова Г.Г., Богуш Н.А., Плюта А.В. Манешина Т.В., 2003)

Растительные протопласты способны восстанавливать клеточную оболочку, в результате делений образовывать каллус и в результате регенерации формировать растения. Благодаря этой способности протопласты нашли широкое применение в биотехнологии при гибридизации соматических клеток, переносе субклеточных частиц, клеточной селекции и генетической инженерии. (Рис. 2).

Рис. 2 Клеточная инженерия на основе изолированных протопластов (Бутенко,1990).

Отсутствие клеточной оболочки облегчает проникновение в протопласт из окружающего раствора макромолекул ( белки, нуклеиновые кислоты) и частиц (клеточные органеллы, микроорганизмы.).

Получение протопластов, таким образом, позволяет переходить с организменного уровня на клеточный и обратно, манипулировать содержанием растительной клетки, изменяя ее генетический аппарат.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений- листья, корни, семядоли, гипокотили, пыльцевые зерна, каллусные и суспензионные культуры. Оптимальные условия для выделения протопластов индивидуальны для различных растений и типов тканей. Главными факторами являются состав ферментов, рН среды, выбор осмотического раствора, физиологическое состояние, возраст и условия выращивания исходного растения. Вероятность получения жизнеспособных протопластов увеличивается, если растения находятся в состоянии активного роста. Эксплант растения подвергается стерилизации. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом или за сутки до опыта. Стерилизацию ферментов раствора производят через бактериальные фильтры. Важным фактором для выделения жизнеспособных протопластов является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого обычно используют сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит ); а также ионные осмотики - растворы солей СаСl2 , Na2 HPO4 , KCl. Среда должна быть гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Для получения протопластов из листьев их нарезают узкими полосами, после чего помещают на поверхность ферментного раствора в чашки Петри ( 1 г листовой ткани в 10 мл ферментного раствора ). Ферментацию листьев табака или картофеля проводят при 28-30 С в течение 15-18 часов. Ферментные смеси для мезофилла табака содержат 0,5 % целлюлазы, 0,5 % мацеразы, 0,2 % дриселазы. Для мезофилла листа картофеля используют смесь 1% целлулизина, 0,5 % мацеразы и 0,2 дриселазы. Ферментные смеси растворяют в растворе , содержащем 0,5 М сахарозы и 50 мМ СаСl2 при рН 5,5 - 5,6.

Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием , затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре, переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля . В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста ( клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны). После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов . Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности, добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз , отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 104-105/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности. Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 оС.

Важным фактором для жизнеспособности ИП является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого выступают сахара (маннит, сорбит, ксилоза, сахароза, глюкоза) или ионные осмотики (СаСЬ, Na₂HP0₄, КС1). Концентрация стабилизатора обычно около 0,3-0,8 моль/л: осмотик должен быть слегка гипертоничным, чтобы протопласты были немного плазмолизиро- ваны (при этом тормозятся метаболизм и регенерация клеточной стенки). Так же эмпирически подбирают и другие условия среды: интенсивность света (чаще используют темноту или слабый свет), рН (обычно 5,4-6,2), температуру, концентрации солей (Са²⁺, Mg²⁺, которые необходимы для стабилизации мебранной системы клетки).

После обработки ферментными препаратами протопласты нужно очищать от остатков неразрушенной ткани, осколков клеток, отмыть от ферментов. Для этого известны два способа: фильтрация с центрифугированием и флотация.

В первом варианте смесь пропускают через фильтр с порами около 40 мкм, при этом на нем остаются неразрушенные клетки и их крупные осколки. Далее центрифугируют таким образом, чтобы оседали ИГ1, а мелкие осколки клеток оставались в супернатанте. При повторной промывке протопласты отмываются от ферментов и переносят в среду культивирования. Этот метод довольно грубый, так как разрушает хрупкие протопласты.

Флотация основана на том, что ИП имеют более низкую плотность, чем куски клеток, клеточных стенок и органеллы. К фракции протопластов добавляют раствор маннита (0,3-0,6 моль/л) или сорбита, затем проводят мягкое центрифугирование (40-350 g), после чего ИГ1 остаются в растворе, а осколки оседают.

Хорошим выходом считается изолирование (1- 5)10⁶ жизнеспособных протопластов из 1 г свежей массы ткани растения или культивируемых клеток. Качество суспензии ИП оценивается по проценту жизнеспособных протопластов и по степени очистки фракции от клеток с неразрушенной стенкой, остатков клеток, органелл и других включений.

Для того чтобы получить жизнеспособные ИП, нужно аккуратно подбирать параметры выделения (ферменты, рН, осмотик, температуру), а также учитывать физиологическое состояние растительного материала, возраст, условия выращивания. Обычно факторы, активирующие рост растения, будут увеличивать вероятность получения жизнеспособных протопластов. Жизнеспособность их можно повысить, если кусочки листьев без эпидермиса предварительно инкубировать 1,5-2,0 дня на среде для клеточных культур.

При получении протопластов из клеточных и суспензионных культур лучше использовать позднюю стадию логарифмической фазы роста. В этот период клеточные стенки легче поддаются энзиматическому разрушению, а ИП наиболее жизнеспособны. Увеличение в среде ауксина и снижение сахарозы за 1 сутки до выделения протопластов также активирует их выход.

Однако необходимо иметь в виду, что при использовании культуры клеток в качестве исходного материала при выделении протопластов всегда будет наблюдаться нестабильность числа хромосом: образуется смесь эуплоидных и анеуплоидных клеток (эуплоидные -- клетки с числом хромосом, кратным X; анеуплоидные - с числом хромосом, уклоняющимся от X и от чисел, кратных X). Последние неспособны к нормальному морфогенезу, поэтому снижается частота регенерации растений из изолированных протопластов.

Для стабилизации хромосом при использовании клеточных культур в качестве источника ИП необходимо использовать некоторые особенности исходных объектов и условий культивирования: 1) выбор экспланта для культуры клеток: в тканях листа и молодых побегов диплоидных клеток больше, чем в сердцевидных клетках; 2) концентрацию регулятора роста: высокие концентрации кинстина способствуют возникновению полиплоидии; 3) поддержание условий, благоприятных для доминирования диплоидной популяции.

Получение изолированных протопластов (ИП)

Впервые протопласты выделил механически Дж. Клеркер из эпидермиса листа телореза (1892). Механический способ выделения протопластов включает плазмолиз, в результате которого протопласты отходят от клеточных стенок, с последующим разрезанием клеточных оболочек, после чего происходит выход протопластов в среду. Но при этом нарушается связь цитоплазматических структур с плазмалеммой и, возможно, происходит частичная разборка поверхностной мембраны ИП, что является существенным недостатком метода.

Ограничения метода: 1) небольшой выход протопластов; 2) выделение их только из тканей, где происходит экстенсивный плазмолиз; 3) трудность получения протопластов из меристематической или зрелой ткани; 4) длительность и трудоемкость метода.

В настоящее время применяют энзиматический способ выделения протопластов. Его сущность заключается в том, что для удаления клеточных стенок используют ферментные препараты. Этот способ имеет ряд преимуществ перед предыдущим: 1) возможность выделения больших количеств протопластов; 2) отсутствие сильного осмотического сжатия ИГ1; 3) сохранение интактности ИП; 4) быстрота.

В энзиматическом способе выделения протопластов используют препараты трех типов - целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Обработка растительных клеток чаще проводится комбинацией ферментов; соотношение их варьирует в зависимости от вида растения, типа ткани, функциональных особенностей, возраста, наличия вторичной клеточной стенки и т. д.

Приведем примеры используемых ферментов и осмотиков при выделении протопластов из разных объектов:

1) из плодов пасленовых - пектиназа;

2) из мезофилла листа табака: целлюлаза - 2,5 %; пектиназа - 0,25 %, маннит - 0,4 М;

3) из мезофилла листьев и суспензионных культур картофеля: ксиланаза -- 2 %, маннит - 0,3-0,4 М;

4) из каллусных тканей пшеницы: целлюлаза 1000 - 2 %, пектатлиаза 0,3 %,СаС1₂ - 0,25 М;

5) из гииокотилей рапса: целлюлаза - 0,5 %, мацерозим - 0,05 %, маннит 0,4 М.

Рассмотрим технику выделения протопластов, предложенную И. Такебе для листьев Nicotiana tabacum. От растения в возрасте 60-80 суток берут полностью сформировавшийся лист, стерилизуют несколько секунд в 70%-м этаноле и 15-20 мин в 10%-м гипохлорите кальция, после чего несколько раз промывают в стерильной дистиллированной воде. С подвядшего листа пинцетом снимают нижний эпидермис, разрезают скальпелем на участки площадью около 4 см², после чего кусочки ткани обрабатывают сначала пектиназой (вызывающей мацерацию ткани), затем целлюлазой (способствующей разрушению клеточной стенки).

Ферменты можно использовать одновременно, но не во всех случаях. Часто применяют совмещенные препараты, например ксиланазу, в состав которой входят: эндоксиланаза + ксилозидаза + (3-1,4-эндоглюканаза + целлобиаза + эндополигалактуроназа + пектинэстераза + протеаза (в концентрации 2-5 %).

Способы получения и культивирования протопластов

Выделение протопластов. Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

· невысокая производительность,

· можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом,

· трудоемкость и длительность.

Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

· одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),

· клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,

· клетки не повреждаются,

· метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

1. обработка ферментами,

2. выделение протопластов из клеточных стенок,

3. отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl₂, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15^о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 - 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28^оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Способы культивирования протопластов

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования. В первом случае суспензию протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45^оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28^оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или г-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

· видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,

· способ и условия выделения протопластов,

· плотность высева протопластов,

· состав питательной среды.

Применение изолированных протопластов

изолированный протопласт гибридизация клетка

Протопласты являются уникальной моделью для изучения фундаментальных физиологических проблем у растений. Они незаменимы при изучении состава, структуры и функционирования плазмалеммы в норме и при воздействии на нее гормонами, ингибиторами, фитототоксинами, а также при взаимодействии самих протопластов в популяции. Кроме того, протопласты могут использоваться для определения состава и архитектоники первичной клеточной стенки и изучения механизма ее репарации после разрушения.

На схеме (рис. 3) представлены основные направления физиологических исследований с использованием культуры изолированных протопластов.

Таким образом, изолированные протопласты имеют ряд областей применения, как теоретического, так и прикладного характера:

1. Изучение химии и структуры клеточной стенки (и при разрушении, и при синтезе «de novo»).

2. Изучение свойств плазмалеммы, трансмембранных перемещений.

3. «Мягкое» выделение органелл.

4. Наблюдение за закономерностями дифференцировки клеток при слиянии протопластов, отслеживание взаимодействия ядра и цитоплазмы в полученной гибридной клетке, изучение соматических гибридов.

5. Введение чужих органелл.

6. Введение чужеродных генов в растительную клетку (трансгенез).

Рис. 3. Изолированные протопласты - объект и модель в физиологических исследованиях (по Р.Г. Бутенко, 1981)

Размещено на Allbest.ru