Закономерности поглощения света биологическими системами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Карагандинский государственный медицинский университет

Кафедра медицинской биофизики и информатики

Лекция

Закономерности поглощения света биологическими системами

Тема: Закономерности поглощения света биологическими системами

Спектрофотометрические методы исследования

Взаимодействие электромагнитных волн с веществом

Подтема: Закономерности поглощения света биологическими системами

Цель: Дать студентам понятия о предмете и задачах квантовой биофизики. Определить основные физические закономерности взаимодействия света и молекулярных систем. Показать возможности расчета конформаций молекул и их изменений с помощью методов спектрометрии поглощения. Определить возможности спектроскопии поглощения в медико-биологических исследования.

ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ КВАНТОВОЙ БИОФИЗИКИ

Квантовая биофизика изучает электронную структуру биологически важных молекул, электронные переходы в этих молекулах и пути превращения энергии возбужденного состояния молекул в энергию их продуктов.

Квантовая биофизика рассматривает ряд конкретных вопросов.

1. Структуру электронных энергетических уровней молекул.

2. Донорно-акцепторные свойства биомолекул.

3. Электронные переходы при поглощении света веществом.

4. Свойства свободных радикалов и механизмы свободно-радикальных процессов.

5. Химические превращения электронно-возбужденных молекул, природу первичных фотопродуктов и их реакционную способность.

6. Механизмы хемилюминисценции, связанной с превращением энергии, выделяющейся в ходе биохимических реакций в энергию электронно-возбужденных состояний.

Методы кван-товой биофизики имеют важное диагностическое и науч-но-практическое значение в медицине. К ним относятся все методы спектрофотометрии, люминесцентный анализ, фотохимические методы, ЭПР-спектрометрия, хемилюминисценция и др.

ЭЛЕКТРОННЫЕ ПЕРЕХОДЫ В БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫХ МОЛЕКУЛАХ.

Каждый электрон в молекуле находится на определенной орбитали и обладает определенной энергией. Таким образом, в молекуле существует система электронных энергетических уровней. Для химических и оптических свойств молекулы наиболее важны два уровня это верхняя (по энергии) заполненная молекулярная орбиталь и нижняя свободная молекулярная орбиталь. Значение энергии верхней заполненной орбитали определяет энергию потенциала ионизации молекулы, а следовательно и отдавать электроны (донорные свойства). Потенциалом ионизации называют энергию, которую необходимо затратить, чтобы оторвать электрон от моле-кулы. Чем выше энергия верхней заполненной молекулярной обитали, тем ниже потенциал ионизации молекулы и тем лучший она донор электронов.

Энергия нижней свободной орбитали определяет акцепторные свойства. Количественно акцепторные свойства характеризуются электронным сродством, которое равно количеству энергии, освобождающейся при переносе свободного электрона из бесконечности на незанятую электронную орбиталь.

На каждом заполненном энергетическом уровне могут находиться только два электрона, имеющие противоположные спины (собственные магнитные моменты).

Таким образом, в молекулярной структуре возможно перемещение электроном по подуровням. Для этого электрон должен получить дополнительную энергию, например в виде кванта света (фотона). Фотон представляет собой частицу масса покоя которой равна 0. Это электромагнитная волна, распространяющая со скоростью 300 000 м/с, характеризующаяся длиной волны или частотой колебания. Энергия такой волны прямо пропорциональна скорости света и обратно пропорциональна длине.

При скорости света, скорости перемещения фотона, имеет место обратная зависимость импульса фотона только от длины волны.

Если молекуле сообщить энергию, например, в виде кванта света, то поглощение его переводит молекулу в возбужденное состояние в результате переброски одного электрона на более высокий энергетический уровень. Обратный переход из возбужденного состояния в основное может сопровождаться испусканием кванта света - люминесценции.

Чаще всего таким фотоэлектроном сложных органических молекул является -электрон, участвующий в образовании системы делокализованных двойных сопряженных связей молекулы.

ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА БИОСИСТЕМАМИ. ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ.

Способность молекул поглощать свет лежит в основе спектрофотометрии, широко используемой в биологии и медицине для качественного и количественного анализа и для выяснения химической структуры вещества.

В конечном счете все оптические и спектрофотометрические свойства молекул, дающие информацию об их строении определяются расстоянием между энергетическими уровнями молекулы и вероятностями перехода между ними. Эти уровни отвечают различным электронным, колебательным и вращательным состояниям молекул.

Электронные переходы полипептидных и полинуклеотидных цепей и, тем самым, белков и нуклеиновых кислот расположены в ультрафиолетовой области спектра.

Несмотря на большую сложность макромолекул, в них содер-жатся отдельные составные элементы - хромофоры, обладающие определенными индивидуальными структурными и спектральными ха-рактеристиками. Пептидная группа >СО - NH - основной характеристический хромофор полипептидных цепей дает полосу поглоще-ния при 190 нм, обусловленную --* переходом (слайд 7). Другой хромофорной группой является карбонильная группа - С = О, сущест-вующая у всех аминокислот. Образование такого типа связи представлено на примере формальдегида (слайд 7,8),

В поглощение в ультрафиолетовой об-ласти спектра вносят свой вклад не только --* переходы, но и так называемые n--* переходы. Они обусловлены тем, что на р-орбитали (n-уровень) кислорода расположена не поделенная пара электронов, не участвующая в образовании связи с уг-леродом (слай. Поглощение света в области 225 нм вызывает n--пи* -переходы, в результате которых электрон от не поделенной пары электронов кислорода попадает на разрыхляющую *-орбиталь. (Слайд 9,10)

Однако основными хромофорами белка являются остатки аро-матических аминокислот: триптофан и в меньшей степени тирозин и фенилаланин. Спектр поглощения триптофан, обусловленный его индольным кольцом, с системой сопряженных связей, обладает двумя полосами поглощения при 220 и 280 нм.

В нуклеиновых кислотах основными хромофорами являются пуриновые (аденин и гуанин) и пиримидиновые (цитозин и тимин и ДНК, цитозин и урацил из РНК) азотистые основания нуклеотидов. Наряду с пи--пи* переходами (основная полоса при 260 нм) вклад в общее поглощение дают и n - * переходы («плечи» в области 280-320 нм) с участием не поделенной пары электронов гетероатомов азота и кислорода.

КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОМОЛЕКУЛ

Качественный спектрофотометрический анализ.

Качественный анализ вещества предполагает, во-первых, молекулярный анализ - обнаружение в веществе определённых молекул, во-вторых, структурный анализ - обнаружение отдельных структурных фрагментов и определение их взаимного расположения.

Качественный спектрофотометрический анализ основан на том, что каждое соединение имеет характерный для него спектр поглощения. Положение и интенсивность полос поглощения вещества определяется содержащимися в нём хромофорными группами.

Для отождествления измеренного спектра поглощения со спектром какого-либо вещества определяют следующие параметры (слайд 6):

1) количество максимумов в спектре поглощения;

2) спектральное положение максимумов ( _max ) полос поглощения;

3) полуширину полос поглощения ( _1/2 ) - разность между двумя длинами волн, при которых оптическая плотность составляет половину от максимальной;

4) амплитуду максимумов ( ^max );

5) отношение амплитуд максимумов ( ₁^max / ₂^max ).

При этом необходимо помнить, что экспериментальные условия, при которых проводятся абсорбционные измерения, существенным образом влияют на форму спектра поглощения. Так, в частности, все перечисленные выше параметры могут изменяться в зависимости от рН среды, ее температуры, полярности растворителя, концентрации исследуемого вещества и т.д.

Далее спектр исследуемого соединения сравнивают с полученным при таких же экспериментальных условиях спектром данного соединения, приведённым в литературе или с полученным ранее с использованием заведомо известного образца. Наличие в исследуемом спектре всей совокупности полос с совпадающими с точностью до 1 нм положениями максимумов и до 10% значениями максимальных коэффициентов экстинкции свидетельствует о тождественности исследуемого и сравниваемого соединений. Появление лишних полос или увеличение интенсивности отдельных максимумов может быть вызвано присутствием примесей в исследуемом растворе.

свет поглощение биологический электронный

Спектральные характеристики отдельных хромофорных групп сильно отличаются по величине. Поэтому для обнаружения определённых функциональных групп следует записывать спектры таких растворов, концентрация которых даёт возможность получить искомую полосу с оптимальной оптической плотностью в пределах 0,2 - 0,8. При использовании стандартных сантиметровых кювет концентрации (С) можно подбирать из соотношения С 0.43 / ^max.

Количественный спектрофотометрический анализ

Рассмотрим законы, дающие возможность определить зависимость интенсивности света от концентрации поглощающего вещества, т.е.

Закон Бугера - Ламберта - Бэра

Поглощение света проявляется в ослаблении светового пото-ка после прохождения через исследуемый объект, и оно тем боль-ше, чем выше концентрация вещества. Согласно закона Бугера - Ламбера - Бэра, интенсивность света, прошедшего через слой поглощающего вещества толщины l, равна:

[1]

где I_o - интенсивность падающего света,

c - концентрация поглощающего вещества ( в моль/л)

е- молярный коэффициент поглощения (в л/моль*см)

В случае монохроматического света закон может быть выражен:

[2]

где D - называется оптической плотностью вещества.

где D - оптическая плотность; I₀ и I - интенсивность падающего и вышедшего из образца пучка света соответственно; T - пропускание образца; С - концентрация поглощающего вещества, выраженная в моль/л; l - толщина образца, см; - молярный коэффициент экстинкции, М^-1см^-1.

Для определения концентрации вещества в растворе можно использовать следующие подходы.

1). Если заранее известно значение коэффициента молярной экстинкции при данной длине волны монохроматического света (лучше всего в одном из главных максимумов поглощения) то, зная толщину поглощающего слоя кюветы (длину оптического пути l), которая обычно указывается на ее боковой стенке, можно рассчитать концентрацию исследуемого вещества по формуле:

С = D / l

Для многих веществ хорошо известны и представляют собой табличные значения. Однако при использовании заранее известного значения необходимо стараться точно воспроизвести условия, при которых оно было определено.

2). Если есть возможность приготовить стандартный раствор вещества с известной концентрацией (С_ст) (взяв точную навеску), то можно определить концентрацию вещества в исследуемом растворе (С_х), не зная .

3). Графический метод, основанный на построении калибровочного графика в координатах D и C. Для построения калибровочного графика измеряют поглощение серии растворов данного вещества с известной концентрацией. Получаемый график обычно представляет собой прямую линию, тангенс угла наклона ( tg ) которой равен l (при l = 1 см tg = ). Измерив D исследуемого раствора, можно по калибровочному графику определить концентрацию вещества.

4). С помощью абсорбционного анализа можно одновременно определять концентрацию нескольких веществ в растворе при условии, что спектры их поглощения различаются по форме. Если компоненты смеси не взаимодействуют между собой, то измеряемая оптическая плотность будет представлять сумму оптических плотностей компонентов (поскольку D есть величина аддитивная).

Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется не всегда. Зависимость D от С может по разным причинам отклоняться от линейной. Количественное определение вещества по результатам измерения спектров поглощения можно проводить в том случае, если выполняются следующие требования:

измеряющий световой пучок является монохроматическим;

поглощающие молекулы распределены по всему объему образца равномерно;

поглощающие молекулы в пределах исследуемых концентраций не изменяют характера взаимодействия друг с другом и молекулами среды ( = соnst для данной длины волны);

выходящий световой поток ослабляется только за счет поглощения фотонов (светорассеяние, отражение, люминесценция и другие явления не влияют на регистрируемый световой поток);

интенсивность измеряющего светового пучка и время жизни поглощающих молекул в возбужденном состоянии таковы, что концентрация невозбужденных (способных поглощать свет) молекул не изменяется в ходе измерения;

измеряющий световой пучок не вызывает фотохимических превращений поглощающих молекул.

В случае отклонений от закона Бугера-Ламберта-Бера нужно строить градуировочные графики, связывающие наблюдаемые величины оптической плотности и известные концентрации, и путём графической интероляции находить концентрации исследуемых растворов.

При количественном спектрофотометрическом анализе главная задача исследователя - измерить концентрации, а значит, и оптические плотности растворов с большей возможной точностью. Ошибка измерения оптической плотности в сильной мере зависит от самой величины измеряемой оптической плотности

Спектрофотометрический анализ биологических объектов

Для исследования физико-химических свойств биологических объектов широко используют различные спектральные методы, в том числе и абсорбционную спектрофотометрию. Регистрируемые при этом спектральные параметры поглощения (положение полос поглощения, их полуширина, соотношение амплитуд максимумов и т.д.) дают информацию о качественном и количественном соотношении компонентов биологической системы, их состоянии и структурной организации.

Однако в некоторых случаях исследуемый объект состоит из частиц, образующих скорее суспензию, чем раствор (например, суспензии клеток, клеточных органелл и т.д.). Это приводит к тому, что кроме поглощения света в изучаемом образце может наблюдаться его рассеяние. Под светорассеянием в данном случае понимается отклонение квантов измерительного пучка света, проходящего через образец, от их первоначального направления распространения. В результате этого на фотоэлемент, расположенный за объектом, попадает меньше света, что в свою очередь приводит к завышению измеряемой оптической плотности. Кроме того, если исследуемая суспензия довольно "густая", то светорассеяние может быть многократным, т.е. после рассеяния кванта света на одной частице может произойти его рассеяние на второй, третьей частице и т.д. Это приводит к увеличению фактической длины оптического пути луча света, проходящего через образец, в результате чего оптическая плотность рассеивающего объекта также повышается.

В общем случае светорассеяние сказывается на форме спектров поглощения следующим образом: 1) потеря части светового потока приводит к общему подъему спектральной кривой; 2) подъем кривой часто более значителен в коротковолновой области вследствие увеличения светорассеяния с уменьшением длины волны; 3) увеличение оптической плотности более выражено в минимумах поглощения, поэтому сглаживаются различия между минимумами и максимумами.

Вещества, поглощающие свет в биологических системах, обычно не распределены равномерно по всему объёму, а сосредоточены в клеточных структурах: хлоропластах, митохондриях и т. д. Часть лучей, пронизывая поглощающие частицы, сильно ослабляется, тогда как другая часть лучей "проскакивает" через толщу образца без поглощения. Это так называемый эффект "сита" (или "проскока"). Эффект «сита» приводит к тому, что в интенсивных максимумах поглощения оптическая плотность становится меньше, чем оптическая плотность хромофора той же концентрации.

Литература

1. Физика и биофизика : руководство к практ. занятиям: учеб. пособие / В. Ф. Антонов [и др.]. - 2-е изд., испр. и доп. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 336 с.

2. Самойлов В.О. Медицинская биофизика. СПб.: СпецЛит, 2004. -496 с.

3. Рубин А.Е. Биофизика. Т1, Т2 М.: Университет «Книжный дом», 2004.

4. Физика и биофизика: Учебник / В. Ф. Антонов, Е. К. Козлова, А. М. Черныш. - 3-е изд., испр. и доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 472 с. : ил.

5. Физика и биофизика. Краткий курс: Учебное пособие для вузов / В. Ф. Антонов, А. В. Коржуев. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 256 с.: ил.

6. Физика и биофизика: Курс лекций для медвузов / Антонов, Валерий Федорович, Коржуев А.В. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 236 с.

7. Медицинская и биологическая физика: Учеб.для вузов / Ремизов, А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. - 7-е изд., стереотип. - М. : Дрофа, 2007. - 558 с. : ил. - (Высшее образование).

8. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А. Н. Ремизов, А. Г. Максина, А. Я. Потапенко . - 10-е изд., стереотип. - М.: Дрофа, 2011. - 558 с. : ил.

9. Учебник по медицинской и биологической физике / Ремизов А.Н., Максина А.Г., Потапенко А.Я. - Изд.5-е, стереотип.6-е изд., стер. - М. : Дрофа, 2004, 2005. - 560 с. : ил.

10. Медицинская и биологическая физика: Курс лекций с задачами: Учеб. пособие / В. Н. Федоров, Е. В. Фаустов. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010, 2008. - 592 с.

11. Физика и биофизика: учебник для вузов / В.Ф Антонов [и др.]. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 480 с.: ил.

Размещено на Allbest.ru