Вплив основних умов культивування на рівень синтезу гіберелінів обраним продуцентом - представником роду Fusarium

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ і науки України НТУУ “КПІ”

факультет біотехнології і біотехніки

ДОМАШНЯ КОНТРОЛЬНА РОБОТА

З КУРСУ «ЗАГАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ-1»

вАРІАНТ № 39

Виконав: студент групи БМ-31

Нгуєн М.Х.

Перевірив: доц. Тодосійчук Т.С.

Київ 2015

Гібереліни - стимулятори росту рослин, що виділені з продуктів життєдіяльності деяких грибів та вищих рослин. Це тетрацикліні моно-, ди- і три карбонові кислоти терпеноїдної (C19 і С20) природи. Гібереліни вперше виявлені в 1926 р. у культурі фітопатогенного гриба Gibberella fujikuroi як фактори, що викликають різке подовженя рисових пагонів. [1]

Водні розчини гіберелінів застосовуються для обприскування рослин. Гібереліни стимулюють цвітіння, збільшують число зав'язей, порушують період спокою насіння, бульб, підвищують урожай, прискорюють дозрівання плодів та ін.[2]

До теперішнього часу об'єднаними зусиллями вчених різних країн як у виділеннях фузарієвих грибів, так і в тканинах вищих рослин відкрито понад 55 форм гібереліну, кілька розрізняються за хімічною будовою і впливу на рослини. Зважаючи на складність будови цих речовин їх отримують не хімічним, а біологічним шляхом, подібно пеніциліну та деяким іншим антибіотиків. [3]

У нашій країні роботи з гіберелінами почалися вперше в 1957 р в Інституті фізіології рослин ім. К. А. Тімірязєва АН СРСР, в якому одночасно було організовано широке випробування препарату гібереліну англійського виробництва, яке показало перспективність застосування гіберелінів в рослинництві. У наступному році на основі комплексної роботи Інституту фізіології рослин, Інституту мікробіології АН СРСР, Всесоюзного інституту добрив і агроґрунтознавства і двох заводів медичних препаратів було розпочато виробництво вітчизняного препарату гібереліну, і вже в 1959 р було отримано до 10 кг гібереліну, який піддався широким випробуванням [3]. На початку 60-х років було розпочато промислове виробництво гібереліну, і в 1979 р випуск кристалічного гібереліну склав 205 кг, а в 1980 г.- понад 300 кг.

Гібереліни позначають символом А з індексом, що позначає порядковий номер, який присвоюється кожному новому гібереліну по мірі виділення та ідентифікації (Табл.1).

Таблиця 1

Характеристика деяких гіберелінів[4]

Способи отримання гібереліну

Промислове отримання гіберелінів здійснюють при культивуванні грибів, що відносяться до аскоміцетів, зокрема Gibberella fujikuroi (в конідіальной стадії - Fusarium moniliforme). Виділяють гібереліни з фільтрату культуральної рідини.[4]

Відомі продуценти гібереліну А3 гриби виду Gibberella fujikuroi (Saw.), Недосконала стадія Fusarium moliforme (Sheld.) [7], гібереліну А4 гриби роду Sphaceloma [8]. Продуцент гібереліну А7 (мікроорганізм, який утворює в якості основного метаболіту гібберелліновой природи гіберелін А7 не відомий, тому використовують суміші ГА4/ГА7, в яких співвідношення А4 / А7 сильно варіює. [9]

Fusarium moniliforme Sheld - збудник рожевої цвілі і гігантизму зернових, кореневої гнилі, опіків, низькорослості і гіпертрофії органів багатьох рослин. [6]

Відомий спосіб отримання технічного гібереліну з культуральної рідини Fusarium moniliforme (Sheld.) F-446, отриманої на комплексному середовищі. Отримання штаму включало обробку протопластів УФ-світлом. [5]

Даний спосіб отримання технічного гібереліну відрізняється та є відома тим, що культуральну рідину, отриману на поживному середовищі, що складається з крохмалю, гліцерину, соєвого борошна та кукурудзяного екстракту, піддають центрифугуванню з наступним висушуванням отриманої маси у вакуумі в замороженому стані (ліофільне сушіння) та подрібненню, що дозволяє спрощувати технологічний процес. [5]

Технічний гіберелін, отриманий за даним способом, наряду з фізіологічно активним початком (гібереліном) містить також мінеральні солі та деякі вітаміни, що необхідні для росту рослин. [5]

Культурально-морфологічна характеристика штаму мікроміцета Fusarium moniliforme ВКПМ F-446 - продуцента фітогормонів гіберелінів А4, А7

Зростання на щільних середовищах

Штам формує колонії повстяного або ватного типу з добре розвиненим повітряним міцелієм, що забарвлюється з віком. Не утворює екстрацелюлярного пігменту і макроконідіі.

На сусло-агарі культура швидкозростаюча. Гриб утворює субстратний і повітряний міцелій. Повітряний міцелій білий, пухнастий. Колонії тяжкі, щільні, білі. Гриб утворює мікроконідії розміром 4,18 х 5,4 мкм.

На картопляно-глюкозного (сахарозному) агарі повітряний міцелій розвинений від слабкого до помірного, щільний, притиснутий до субстрату, білий. Субстрат не забарвлений. Мікроконідії одноклітинні або з однією перегородкою, овальної форми. Спороношення не рясне. Мікроконідії одиничні з 2-3 перегородками, подовжено-овальної форми.

На середовищі Ролен-Тома повітряний міцелій помірно розвинений, щільний, притиснутий. Від білого до слабо-фіолетового відтінків. Субстрат не забарвлений. Поодинокі мікроконідії, овальні, одноклітинні. Макроконідії не відзначається.

Фізіолого-біохімічні властивості

Строгий аероб. Максимум зростання на агарових середовищах при 28?C. Утилізує джерела: вуглецю - глюкоза, сахароза, розчинний крохмаль, рослинні масла; азоту - сульфат амонію, нітрат амонію, сечовина. Періодично культура пересіюється. Штам зберігається на одвірках з картопляно-глюкозним агаром в холодильнику при 4 ?C без пересівань протягом 1-2 місяців. При обмеженому доступу повітря (пробки, залиті парафіном) - протягом 8-10 місяців. Дисоціації при зберіганні не відзначається.

Занурене культивування

У зануреній культурі гриб росте рівномірно, має кашоподібний вигляд. Культуральна рідина брудно-сірого кольору.

Аналізи HPLC (високоефективна хроматографія) і ГХ-МС (газова хромато-мас спектрометрія) показує, що основним метаболітом штаму F-446 є ГА7. Гіберелін А4 присутній в культуральній рідині штаму F-446 в якості мінорного метаболіту (5-15%), гіберелін А3 - менше 3%. [9]

Отримання гіберелінів за допомогою F. moniliforme розглядається як типовий двофазний процес мікробіологічного синтезу, при якому спочатку відбувається інтенсивне накопичення біомаси, а потім утворення продукту. Головною умовою, що забезпечує високу продуктивність культури, слід вважати виснаження джерел азоту в середовищі при збереженні високого рівня сполук вуглецю. Характерна особливість процесу біосинтезу гіберелінів - низьке значення рН середовища (3,0-4,5), при якому відбувається їх утворення. [4]

Умови культивування гриба Fusarium moniliforme F-446

Для отримання ГА7 штам F-446 вирощують на скошеному картопляно-цукровому агарі або на агаризованму солодовому суслі протягом 20-24 днів при 28?C. Міцеліальну суспензію гриба у стерильній воді вносили в модифіковане рідке посівне середовище наступного складу (в масових долях):

· сахароза - 3% ;

· (NH4)2SO4 - 0,05% ;

· CaCO3 - 0,7%;

· кукурудзяне або соєве борошно - 0,5%;

pH перед стерилізацією - 5,0-5,5.

Режим стерилізації 0,5 доб.атм. протягом 20 хвилин. Рідкий посівний матеріал вирощують протягом 46-48 годин в колбах на ротаційній качалці 240 об/хв при 28?C. Потім його використовують для інокуляції колб з ферментаційним середовищем в кількості 1/10 об'єму середовища. Ферментаційні середовища містили в якості джерела вуглецю рослинне масло (6,0-8,0%), джерело азоту NH4NO3 (1,0%) або пептон (1,0%).

Сольова основа ферментаційних середовищ (в масових долях):

· KH2PO4 - 0,1%;

· MgSO4 - 0,02%;

pH нейтральний. Можливе додавання в середу кукурудзяного або дріжджового автолізату (0,1) і 1 мл розчину суміші мікроелементів.

Ферментацію проводять на ротаційній качалці 240 об/хв, протягом 8-10 днів при 28?C. Кількість інокулюму 5-10% Вміст ГА7 в культуральній рідині визначають за допомогою високоефективної рідинної хроматографії і ГХ-МС.

Приклад. Гриб Fusarium moniliforme F-446 вирощують на скошеному картопляно-глюкозному агарі протягом 14 діб. В якості посівної використовували середовище з цукром і кукурудзяним борошном, pH перед стерилізацією 5,5, після стерилізації 6,0, режим стерилізації 0,5 доб. атм. протягом 20 хвилин. Вирощування посівного матеріалу проводять на ротаційній качалці 240 обертів/хв, при 28?C, в колбах на 500 мл.

Тривалість культивування гриба в посівному середовищі 46 годин, в ферментаційному 10 діб (у тих же умовах).

Склад ферментаційної середовища (у масових долях):

· масло рослинне 8%

· NH4NO3 - 0,1%

· дріжджовий автолізат (Serva) - 0,1%

· KH2PO4 - 0,1%

· MgSO4 - 0,02%

· K2SO4 - 0,02%

pH перед стерилізацією - 5,8.

У результаті отримується культуральна рідина, що містить 976 мг/л гіберелінів, з яких 75% припадає на частку А7, 13% на частку А4 і 3,6% на частку А3.

Вплив початкового рН на продукцію гіберелінових кислот А3, А4 та А7, що продукуються культурою Fusarium moniliforme

штам культивування гриб мікроміцет

Таблиця 2

Біомаса гіберелінової кислоти, що міститься в культурі Fusarium moniliforme [10]

Таблиця 3

Концентрації гіберелінових кислот А3, А4 і А7, виділений з культурального фільтрату Fusarium moniliforme [10]

Таким чином, пропонований штам гриба Fusarium moniliforme F-446, що є продуцентом фітогормону гібереліну А4/A7, характеризується переважним утворенням ГА7.

При аналізі данних впливу вихідного рН поживного середовища на склад синтезованого комплексу Fusarium moniliforme було встановлено, що штам-продуцент росте в кордонах рН 2.5 до 6.5. Слід відмітити, що початкове рН середовища істотно впливає на продуктивність штаму і склад синтезуємого їм біологічно активного комплексу. Велика продукція гіберелінових кислот отримана при культивуванні штаму-продуцента на комплексному живильному середовищі з рН 4.5 і 5.5. Комплекс, що синтезувався, містить гіберелінові кислоти А3, А4 і А7. Їх співвідношення в комплексі змінюється зі зміною вихідного рН середовища. Найвища концентрація А3 в комплексі відзначена при рН 3.5, а А4 і А7-при рН 6.5.

Таким чином, можемо стверджувати, що кількісний склад гіберелінового комплексу в основному можна регулювати зміною рН.

Список використаної літератури

1. Дорохов В. І. Природні стимулятори росту рослин / В. І. Дорохов, Т. В. Складенко // Хімічні аспекти екології: зб. матеріалів VІІ міжфак. наук.-пізнав. конф. викладачів та студентів кафедри хімії ЖНАЕУ. Житомир, 2014. С. 15-18.

2. Гончаров А.И. Справочник по химии. 2-е изд., перераб. И доп. К.: Вища школа, 1976. 308 с.

3. Чайлахян М. Х. Регуляторы роста в жизни растений и в практике сельского хозяйства // Вестник АН СССР. 1982. 01. С. 11--26.

4. Столярова В.А. Новый справочник химика и технолога. Сырье и продукты промышленности органических и неорганических веществ. Часть I - СПб: "Мир и Семья", 2002. 988 с.

5. Пат. 152142. СССР Класс 45дб 402 Способ получения технического гиббереллина /П.Т. Болгарев, Г.С. Муромцев и М.Н. Нестюк/. Заявл. 25.01.1962 г. за № 762055/23-4, публ. в «Бюллетене изобретений» № 23 за 1962 г.

6. Выприцкая А.А. Грибы рода Fusarium Link et Fr. на подсолнечнике в Тамбовской области /А.А. Выприцкая, А.М. Пучнин, А.А. Кузнецов/ - Вестник ТГУ, т.17, вып.1, 2012. С. 394 - 398.

7. Kumar, P.K.R., Lonsane, B.K. Adv. Appl. Microbiol., 1989. P.29-139.

8. Rademacher, W., Graebe, J.E.: Gibberellin A4 produced by Sphaceloma manihoticola, the cause of the superelongation disease of cassava (Manihot escelunta). Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. P. 35 - 40.

9. Пат. 2084531 РФ C12P27/00, A01N63/04, C12N1/14, C12N1/14, C12R1:77 Штамм микромицета Fusarium moniliforme - продуцент фитогормонов гибберелинов А4, А7./ Г.С. Муромцев, Л.М. Краснопольская/. № 95116634/13; заявл. 27.09.1995, публ. 20.07.1997.

10. Ганчева В. Влияние на началното рН върху продукцията на гиберелиновата киселини А3, А4 и А7, синтезирани от Fusarium moniliforme / Ганчева В., Рачев Р., Божкова С./ Институт по микробиология, БАН, 1992. с. 63 - 64.