Основы молекулярной биологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования. молекулярный биология белок рибонуклеиновый

Современный человек может произвольно и направленно изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека.

Появились беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные).

Все это возникло на базе революционных прорывов в фундаментальной науке (молекулярная биология), которые затем и породили биотехнологическую революцию.

Эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века стал предложенный в 1983 г. американским исследователем Кэрри Б. Мюллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации.

«Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ.

В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция.

Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны.»

В данной работе я рассмотриваю механизм полимеразной цепной реакции (механизм амплификации ДНК в искусственных условиях), физические явления, лежащие в основе ПЦР - анализа (эффект Пельтье), а также важнейшие области применения полимеразной цепной реакции.

Цель: Изучить методы молекулярной биологии.

Задачи: Изучить этапы развития молекулярной биологии;

Изучить исследования структур ДНК и РНК;

Рассмотреть первые исследования структуры белка.



Глава1. Методы исследования молекулярной биологии

Методы молекулярной биологии делятся на две большие группы. Первая группа занимается исследованием структуры и функции белковых молекул.

Молекулярная биология использует широкий арсенал биологических, физических и химических методов, как известных ранее, до возникновения дисциплины, так и созданных в процессе ее собственного развития специально для работы с молекулярными объектами.

Физические методы изучения структуры и свойств нуклеиновых кислот и белков: рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия, седиментационный анализ, хроматография.

Химические методы: «метод хирургии молекул», методы определения первичной структуры биополимеров, метод адресованных реагентов. Модификация биологических макромолекул in vivo и in vitro и изучение их функциональных свойств.

Биологические и биохимические методы: культуры клеток, гибридные клетки, бесклеточные системы, клеточные линии гибридов, получение моноклональных антител, гель-фильтрация, изоэлектрофокусирование, гель-электрофорез, другие методы фракционирования биополимеров.

Методы генетической инженерии: рекомбинантные ДНК, рестрикция ДНК. Ферменты генетической инженерии. Рестриктазы и их виды, свойства и особенности воздействия на ДНК. Клонирование ДНК. Плазмиды. Векторы молекулярного клонирования.

Гибридизация нуклеиновых кислот. ДНК-зонды. Блоттинг, его виды.

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК: метод Максама - Гилберта, метод Сангера - Коульсона, их модификации.

Химико-ферментативный синтез генов. Получение генов с использованием обратной транскриптазы.

Достижения и перспективы генетической инженерии. Получение пептидных гормонов: гормон роста человека, соматотропный гормон, инсулин. Среди методов работы с генами и нуклеиновыми кислотами в наборе молекулярной биологии можно отметить экспрессию генов, полимерно-цепную реакцию, различные виды блоттинга генов, а также методики по определению последовательностей ДНК.

Оценивая молекулярную революция в контексте истории биологии, нетрудно заметить, что рождение молекулярной биологии было кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений, сделанных под микроскопом.

Ранние исследователи пытались понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне.

С конца XVIII в. все большее внимание уделялось описанию особенностей химических молекул, производящихся живыми организмами. Так в трудах выдающихся химиков, таких как Юстус Либих, родилась физиологическая химия, предшественница современной биохимии, в свою очередь, обязанной своим рождением Эдуарду Бухнеру.

Однако между молекулами, которые изучали химики, и тонкими структурами, заметными под микроскопом, например, хромосомами, лежала область неизвестного, «мир упущенных измерений», как его называл выдающийся физико-химик Вольфганг Освальд.

1.1 Первые исследования молекул

Оценивая молекулярную революция в контексте истории биологии, нетрудно заметить, что рождение молекулярной биологии было кульминацией длительного процесса, который начался с первых наблюдений, сделанных под микроскопом.

Ранние исследователи пытались понять, как функционируют живые организмы на микроскопическом уровне.

С конца XVIII в. все большее внимание уделялось описанию особенностей химических молекул, производящихся живыми организмами. Так в трудах выдающихся химиков, таких как Юстус Либих, родилась физиологическая химия, предшественница современной биохимии, в свою очередь, обязанной своим рождением Эдуарду Бухнеру.

Однако между молекулами, которые изучали химики, и тонкими структурами, заметными под микроскопом, например, хромосомами, лежала область неизвестного, «мир упущенных измерений», как его называл выдающийся физико-химик Вольфганг Освальд.

Этот мир населяли коллоиды, химические соединения, структура и свойства которых оставались неясными.

Поворотным пунктом в этом процессе стала работа Лайнуса Полинга 1949 г., в которой впервые болезнь человека, серповидноклеточная анемия, была связана с мутацией в молекуле гемоглобина.

При рождении молекулярной биологии произошла встреча двух дисциплин, переживавших в первой половине ХХ века период бурного развития: биохимии и генетики.

Биохимики изучали структуру и функции молекул, из которых состоит живая материя. Между 1900 и 1940 гг. были описаны центральные процессы метаболизма: пищеварение и усваивание питательных веществ, в частности, углеводов.

Каждый из элементарных химических процессов, из которых состоит метаболизм, катализируется особым ферментом.

Ферменты -- это белки, так же как антитела крови и белки, отвечающие за сокращения мускулатуры.

Поэтому изучение структуры и функции белков стало одной из важнейших задач биохимии. Генетики, благодаря введению Томасом Морганом плодовой мушки дрозофилы в качестве модельного организма, установили справедливость законов Менделя и открыли множество новых фактов и закономерностей в отношениях между генами.

В частности, Морган показал, что гены локализованы на хромосомах. Тем не менее, химическая природа генов и молекулярные механизмы их действия оставались загадкой.

1.2 Исследования структуры ДНК

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) - один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов.

Основная роль ДНК в клетках - долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

С химической точки зрения ДНК - длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков - нуклеотидов.

Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счет дезоксирибозы и фосфатной группы.

В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула спирализована.

В ДНК встречаются четыре вида азотистых оснований - аденин, гуанин, тимин и цитозин.

Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями по принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином, гуанин - только с цитозином.

Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК).

Все эти типы РНК синтезируютя на матрице ДНК за чсет копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) представляет собой биополимер (полианион), мономером которого является нуклеотид.

Каждый нуклеотид состоит из остатка фосфорной кислоты присоединённого по 5'-положению к сахару дезоксирибозе, к которому также через гликозидную связь (C--N) по 1'-положению присоединено одно из четырёх азотистых оснований.

Именно наличие характерного сахара и составляет одно из главных различий между ДНК и РНК, зафиксированное в названиях этих нуклеиновых кислот (в состав РНК входит сахар рибоза).

Пример нуклеотида -- аденозинмонофосфат -- где основание, присоединённое к фосфату и рибозе, это аденин, показан на рисунке.

Исходя из структуры молекул, основания, входящие в состав нуклеотидов, разделяют на две группы: пурины (аденин [A] и гуанин [G]) образованы соединёнными пяти- и шестичленным гетероциклами; пиримидины (цитозин [C] и тимин [T]) -- шестичленным гетероциклом.

В виде исключения, например, у бактериофага PBS1, в ДНК встречается пятый тип оснований -- урацил ([U]), пиримидиновое основание, отличающееся от тимина отсуствием метильной группы на кольце, обычно заменяющее тимин в РНК.

Следует отметить, что тимин и урацил не так строго приурочены к ДНК и РНК соответственно, как это считалось ранее. Так, после синтеза некоторых молекул РНК значительное число урацилов в этих молекулах метилируется с помощью специальных ферментов, превращаясь в тимин. Это происходит в транспортных и рибосомальных РНК.

Полимер ДНК обладает довольно сложной структурой. Нуклеотиды соединены между собой ковалентно в длинные полинуклеотидные цепи. Эти цепи в подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, обладающих одноцепочечными ДНК-геномами), в свою очередь, попарно объединяются при помощи водородных связей в структуру, получившую название двойной спирали.

Остов каждой из цепей состоит из чередующихся фосфатов и сахаров. Фосфатные группы формируют фосфодиэфирные связи между третьим и пятым атомами углерода соседних молекул дезоксирибозы, в результате взаимодействия между 3'-гидроксильной (3' --ОН) группой одной молекулы дезоксирибозы и 5'-фосфатной группой (5' --РО₃) другой.

Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три прим) и 5' (пять прим). Полярность цепи играет важную роль при синтезе ДНК (удлинение цепи возможно только путём присоединения новых нуклеотидов к свободному 3' концу).

Как уже было сказано выше, у подавляющего большинства живых организмов ДНК состоит не из одной, а из двух полинуклеотидных цепей.

Эти две длинные цепи закручены одна вокруг другой в виде двойной спирали, стабилизированной водородными связями, образующимися между обращёнными друг к другу азотистыми основаниями входящих в неё цепей.

В природе эта спираль, чаще всего, правозакрученная. Направления от 3' конца к 5' концу в двух цепях, из которых состоит молекула ДНК, противоположны (цепи «анти параллельны» друг другу).

Первую точную модель ДНК Уотсон и Крик построили в 1953 г. на основании данных, полученных к этому моменту Франклин.

Их открытие вызвало необыкновенный энтузиазм как у ученых, так и у широкой публики. Статья Уотсона и Крика была опубликована в Nature 25 апреля.

Ее содержание было дублировано публичным докладом заведующего лабораторией, в которой работали Уотсон и Крик, Уильяма Брэгга, 14 мая.

1.3 Исследования структуры РНК

Ранние работы по исследованию структуры РНК также относятся к 1950 м годам. Уотсон и Крик предполагали, что наличие у рибозы 2`OH группы препятствует образованию двойной спирали, характерной только для ДНК.

Были сомнения даже в способности этой макромолекулы к образованию любой спиральной структуры. Высокая степень гетерогенности очищенных образцов препятствовала получению на РНК отчетливых снимков дифракционной картины и их рентгеноструктурному анализу.

В 1955 г. был открыт фермент полинуклеотидфосфорилаза, с помощью которого стал возможен искусственный синтез гомогенных нуклеиновых кислот, и данные рентгеноструктурного анализа значительно улучшились. Оказалось, что РНК не только может образовать спираль, но, как и ДНК, способна к созданию двойной спирали, хотя ее структура и отличалась от двойной спирали ДНК.

В конце 1950 -- начале 1960х годов было опубликовано множество результатов исследований РНК, в том числе о гибридизации РНК и ДНК с образованием двойных спиралей из цепей обеих макромолекулы и даже тройной спирали РНК, а также о структуре небольших фрагментов РНК и динуклеотидов G-C и A-U, кристаллизованных в виде завитков спирали. Современный обзор этих работ был опубликован в 2009 г.

К середине 1960х годов были открыты рибосомы, показана их роль в синтезе белка и необходимость информационной РНК для их сборки. Кромеинформационной РНК и РНК, входящей в структуру рибосом, в синтезе белка участвовали также транспортные РНК, доставляющие аминокислоты к рибосоме.

В 1965 г. была определена первичная структура первой транспортной РНК, а к 1968 г. сразу несколько групп ученых получили кристаллы транспортных РНК, хотя еще недостаточно хорошего качества, чтобы стало возможно определить их пространственную структуру.

Эта цель стала достижимой благодаря кристаллизации в 1971 г. тРНК^PHE из дрожжей. Работа по исследованию пространственной структуры тРНК^PHE была закончена к 1973 г.

Впоследствии методы этой пионерской работы были применены к кристаллизации и исследованию пространственной структуры и других тРНК. Оказалось, что кроме линейной или спиралевидной формы, по крайней мере, такие РНК, как транспортные, как и белки могут иметь компактную глобулярную структуру.

Рибозимы и структура рибосомы

В 1980х годах было показано, что некоторые РНК способны к аутокаталитическому расщеплениИ РНК, способные, как и ферменты, катализировать химические реакции, такие как аутокаталитическое расщепление, назвали рибозимами.

В 1990х годах у некоторых из рибозимов была изучена пространственная структура. Это были первые глобулярные РНК кроме транспортных, у которых стало возможно изучать пространственную структуру.

На этой основе далее были проведены исследования особенностей формирования структуры РНК, выявление консервативных структурных мотивов, локальных стабилизирующих взаимодействий между фрагментами нуклеотидной последовательности и т. д.

Эти достижения стали возможными, благодаря появлению метода транскрипции in vitro. Кроме того, для изучения структуры РНК начали применять ядерный магнитный резонанс, который оказался особенно полезен для исследования малых РНК (RNAs)

Впоследствии развитие методов изучения структуры РНК позволило исследовать пространственную структуру еще целого ряда макромолекул этого вида, включая рибосомальную РНК.



Глава 2. Первые исследования структуры белка

Белки (протеины - «первые», «важнейшие») - нерегулярные биополимеры, мономерами которых являются L - аминокислоты.

Занимают первое место среди всех макромолекул живой клетки (50-80 % сухого веса клетки).

Это молекулярные инструменты, посредством которых генетическая информация организма получает свое реальное воплощение.

Разнообразие белков, их свойства и особенности. Функции белков. Структурная организация. Примеры связи структуры и функций белков. б-спирали, в-складчатые листы.

Структурная классификация. Сверхвторичные структуры. Домены. Фолдинг. Молекулярные шапероны, их роль в фолдинге полипептидных цепей. Метаболоны.

Белковая инженерия. Конструирование абзимов и перспективы их применения. Прионы, патологические последствия.

Первое выделение и классификация.

Как особый класс биологических молекул, белки были определены еще в XVIII в. Антуаном де Фуркруа.

Вначале их называли альбуминами (matiиres albuminoides, albuminoids или Eiweisskцrper) и их характерными свойствами считали способность к свертыванию или коагуляции при обработке теплом или кислотой.

Сходство между свертыванием яичного белка и створаживанием молока было известно с древнейших времен.

Даже само слово альбумин было предложено еще Плинием Старшим и происходит от латинского выражения albus ovi (белок яичный).

Якоб Берцелиус и Геррит Ян Мульдер провели элементный анализ растительных и животных белков и пытались определить их эмпирическую формулу.

К их удивлению, у всех белков формула оказалась приблизительно одинаковой: C₄₀₀H₆₂₀N₁₀₀O₁₂₀, различными были лишь содержание серы и фосфора, присутствовавшие в относительно небольших пропорциях.

Мульдер предполагал, что существует единая базовая белковая субстанция (Grundstoff), которая синтезируется в растениях и усваивается животными при переваривании. Берцелиус поддержал эту идею, назвав субстанцию протеином.

Мульдер также идентифицировал продукты деградации протеина, в частности, аминокислоту лейцин, и определил ее молекулярную массу, 131 Da.

Очистка и определение массы.

Минимальная молекулярная масса протеина, согласно анализу Мульдера, была примерно 9 kDa, в сотни раз больше, чем у большинства других молекул, с которыми ему доводилось сталкиваться.

Поэтому химическая структура протеина (точнее, первичная структура) оставалась неизвестной до 1949 г., когда Фредерик Сенгер определил аминокислотную последовательность первого белка, которым был инсулин.

Франц Хофмайстер и Эмиль Фишер предсказали, что белки представляют собой линейную цепь из аминокислотных остатков, соединенныхпептидными связями.

Многие ученые сомневались, что столь длинные аминокислотные цепи могут оставаться стабильными в растворе, и существовали также альтернативные теории о возможном строении белков. Например, согласно коллоидной гипотезе, белки состоят из циклолов.

То, что белки все-таки являются макромолекулами с определенной структурой, а не коллоидными смесями, показал Теодор Сведберг с помощью аналитического ультра центрифугирования.

При помощи очистки из ткани трудно получить белок в количестве более, чем несколько миллиграммов. Поэтому ранние исследования проводили на протеинах, легко очищаемых из яичного белка, крови, а также различных токсинов и пищеварительных соков, получаемых со скотобоен. Техника очистки белка быстро развивалась во время Второй мировой войны в связи с необходимостью получать очищенные белки крови для лечения раненых солдат.

В конце 1950 г. американская компания Armour and Company очищала в больших количествах рибонуклеазу А и бесплатно предоставляла ее для исследований.

В результате РНКаза А на несколько десятилетий стала основным объектом фундаментальных исследований для множества научных групп.

В частности, на ней было сделано несколько работ, удостоенных Нобелевской премии.

Пространственная структура.

Исследования пространственной структуры белка начались в 1910х годах, когда Крик и Мартин показали, что при коагуляции выпадению белка в осадок предшествует другой процесс, денатурация, при которой белок теряет растворимость и ферментативную активность, но приобретает дополнительные химические свойства.

В середине 1920х годов было отмечено, что иногда денатурация может быть обратимой и изменение свободной энергии при этом процессе существенно меньше, чем при обычных химических реакциях, а к 1929 г. появились представления о том, что денатурация представляет собой изменение конформации аминокислотной цепи, при которой остатки, ранее находившиеся внутри белковой глобулы, теперь экспонированы в растворитель.

В начале 1960 г. Кристиан Анфинсен показал, что РНКаза А действительно денатурирует обратимо, и что естественная конформация этого белка соответствует глобальному минимуму свободной энергии.

Когда структура белка еще не была известна, Дороти Ринч и Ирвинг Ленгмюр для обоснования гипотезы о циклолах предположили, что эти структуры стабилизируются за счет гидрофобных связей. Хотя идею о гидрофобных взаимодействиях поддержал сам Джон Бернал, она в 1930х годах была отвергнута вместе с гипотезой о циклолах Лайнусом Полингом и другими исследователями.

Полинг был сторонником водородных связей, теорию которых развивал Уильям Астбери.

Несмотря на то, что роль водородных связей в стабилизации структуры белка в конце концов оказалась незначительной, это не помешало Полингу верно сформулировать представления об основных структурных элементах белка, альфа-спиралях и бета-складках.

Значимость гидрофобных связей прояснилась лишь к 1959 г., когда было показано, что ионизация части аминокислотных остатков, показанная еще Арне Тиселиусом, играет роль лишь на поверхности белковой глобулы, где полипептидная цепь входит в контакт с растворителем.

Пространственную структуру глобулярных белков вначале изучали лишь гидродинамическими методами и ультра центрифугированием. В 1950х годах появились спектральные методы, включая круговой дихроизм, флуоресценцию, определение спектров поглощения в ультрафиолетовой и инфракрасной областях.

Кристаллография и рентгеноструктурный анализ для определения пространственной структуры гемоглобина были впервые применены Перуцом и Кендрю в 1960х годах.

За эту работу они были удостоены Нобелевской премии. В 1980х годах начали также применятьядерный магнитный резонанс.

К 2006 г. Protein Data Bank содержал данные о пространственной структуре 40 тысяч белков.

Благодаря выявлению консервативных доменов, гомологичные структуры разных белков теперь можно реконструировать при помощи компьютерных программ, а для исследования структуры больших межбелковых комплексов применяют криоэлектронную микроскопию.



2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК -- синтетических праймеров.

Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания -- охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она быстро инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК.

Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий.

Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР.

Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой.

Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'>5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq.

Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (Cetus), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош (Hoffmann-La Roche) за 300 млн долларов.

Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году, в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г

Полимеразная цепная реакция - экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале.

Такой процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом - полимеразой. ДНК-полимераза - фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК.

Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведется считывание.

ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это приводит к элонгации (удлинению) цепочки в направлении 5'-3'.

Ни одна из известных ДНК-полимераз не способна создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3'-гидроксильной группе.

По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере - короткой последовательности нуклеотидов (чаще 20-25), комплементарной концевым участкам изучаемого гена - к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят всегда из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания.

Праймеры синтезируются другим ферментом - праймазой. Еще один фермент - геликаза - необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК.

Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает из неправильный нуклеотид из цепочки, затем вставляет на его место правильный, после чего репликация продолжается в обычном режиме.

2.2 Разновидности ПЦР

«Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) -- применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции.

Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

«Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) -- используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности.

Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.

Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) -- используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК.

Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

Ассиметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) -- проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа.

ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) -- используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) -- в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) -- с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта.

Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают.

При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony - PCR Colony) -- акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР.

В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)

ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) -- модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше).

Используют две полимеразы, одна из которых -- Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая -- ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью.

Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК -- используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы.

В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 -- 25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов.

Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н -- А, Т или С

2.3 Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет колоссальное значение для решения многих проблем микробиологии и эпидемиологии.

ПЦР-метод позволил разработать новые диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания.

В частности, его используют для ранней диагностики наличия в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что не удается осуществить другими методами.

При этом не требуется работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения ДНК и окраски их бромистым этидием.

Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий.

К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции.

Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза ; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов В,С и G; В гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

В криминалистике ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев».

Необходим образец генетического материала с места преступления -- кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого.

Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически -- одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют с помощью гель-электрофореза.

Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

На лизатах индивидуальных сперматозоидов человека продемонстрирована возможность одновременно анализировать два локуса, расположенных на разных негомологичных хромосомах.

Такой подход обеспечивает уникальную возможность тонкого генетического анализа и изучения хромосомной рекомбинации, ДНК-полиморфизма и др.

Метод анализа индивидуальных сперматозоидов сразу нашел практическое применение в судебной медицине, так как HLA-типирование гаплоидных клеток позволяет определять отцовство.

ПЦР нашла применение и в персонализированной медицине. Известно, что большинство лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30-70 % их числа.

Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов.

Причины этого -- отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне.

Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого -- менее.

Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР-анализ перед применением лекарства.

Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).



Заключение

Молекулярная биология, возникшая во второй половине 20 века, изучает особенности структуры и функций нерегулярных биополимеров - нуклеиновых кислот и белков, обеспечивающих существование биологической формы движения материи, механизмы хранения, передачи и реализации генетической информации.

Идентификация ДНК как носителя генетической информации.

Работы по рентгеноструктурному анализу ДНК, выяснению химического состава нуклеиновых кислот.

Доказательство универсальности ДНК в животном и растительном мире. Создание биспиральной модели молекулы ДНК.

Расшифровка структуры ряда белков. Выявление связи между структурой и функцией белков.

Становление основного постулата молекулярной генетики: ДНК > РНК > белок. Выявление основных этапов биосинтеза белков и принципов его регуляции. Расшифровка генетического кода.

Химический синтез гена. Изучение структурной организации рибосомы. Выяснение основных механизмов синтеза нуклеиновых кислот.

Открытие обратной транскрипции. Исследование первичной структуры ДНК. Получение рекомбинантных ДНК.

Открытие сплайсинга, рибозимов и аутосплайсинга. Мобильные генетические элементы.

Изучение молекулярной организации мембран. Возникновение белковой инженерии и инженерной энзимологии.

Современные аспекты: проект «Геном человека», расшифровка структур геномов, создание банка генов, геномная дактилоскопия, полимеразная цепная реакция, изучение молекулярных основ эволюции, адаптации, био разнообразия, канцерогенеза и др.).

ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации.

«Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла.

Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте.

За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция.

Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны».



Список использованной литературы

1. Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Москва: Мир, 2002.

2. Сингер М., Берг П. Гены и геномы - Москва: Мир, 1998.

3. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия -- Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004

4. В мире Науки (Scientific American). Июнь № 6 1990 г

5. Трофимова Т. И. Курс физики. Москва: Высшая школа, 2002

6. Стильбанс Л. С. Физика полупроводников. Москва, 1967.

Размещено на Allbest.ru

...