Биологические основы адаптации бактерий к тяжёлой воде (d2o)

Размещено на http://www.allbest.ru/

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ АДАПТАЦИИ БАКТЕРИЙ К ТЯЖЁЛОЙ ВОДЕ (D2O)

к.х.н. О.В. Мосин (Россия)

Доктор наук, проф. И. Игнатов (Болгария)

Аннотация

В статье приводятся данные по изучению адаптации различных бактериальных штаммов- продуцентов аминокислот, белков и нуклеозидов, относящихся к различным таксономическим группам микроорганизмов (факультативные и облигатные грамотрицательные метилотрофные бактерии продуценты аминокислот фенилаланина и лейцина - Brevibacterium methylicum и Methylobacilus flagellatum, грамположительные хемогетеротрофные бактерии продуценты инозина Bacillus subtilis и фотоорганогетеротрофные бактериородопсинсинтезирующие галобактерии Halobacterium halobium) при росте на средах с максимальными концентрациями тяжелой воды. Представлены данные по росту и адаптации исследуемых штамов бактерий на средах, содержащих в качестве источников дейтерированных субстратов D2O, [D]метанол и дейтерированную биомассу метилотрофных бактерий B. methylicum, полученную в процессе многоступенчатой адаптации к D2O. Изучен качественный и количественный состав внутриклеточных аминокислот, белков и углеводов в условиях адаптации микроорганизмов в D2O. Показано, что эффекты, наблюдаемые при росте клеток на тяжёлой воде, носят комплексный многофакторный характер и связаны с изменениями физиологических параметров - величины лаг-периода, времени клеточной генерации, выхода биомассы, соотношения синтезируемых аминокислот, белков, углеводов и липидов, а также с эволюционным уровнем организации изучаемого объекта и способами ассимиляции углеродных субстратов.

адаптация аминокислота таксономический белок

Введение

Тяжёлая вода по химическому составу представляет оксид дейтерия D2O с кислородом природного изотопного состава. Химическое строение молекулы D2O аналогично строению Н2O, с очень малым различием в значениях длин водородных связей и углов между ними; молекулярная масса D2O на 10% превышает массу Н2O. Разница молекулярных масс определяет изотопные эффекты, которые для пары H/D могут быть достаточно большими [1]. В результате тяжёлая вода по своим физико-химическим свойствам отличается от обычной воды. Тяжёлая вода кипит при 101,440С, замерзает при 3,820С, имеет плотность при 200С 1,105 г/см3, причём максимум плотности приходится не на 40С, как у обычной воды, а на 11,20С (1,106 г/см3).

Химические реакции в тяжелой воде протекают с медленной скоростью, чем в обычной воде, она слабее ионизирована, чем обычная вода, константа диссоциации тяжёлой воды меньше таковой для обычной воды, растворимость органических и неорганических веществ в D2O, как правило ниже чем в D2O, водородные связи с участием дейтерия несколько прочнее обычных, подвижность ионов D3O+ на 28,5% ниже Н3O+, а ОD- - на 39,8% ниже ОН- [2].

В природных водах соотношение между тяжёлой и обычной водой составляет 1:5500 (в предположении, что весь дейтерий находится в виде D2O) [3]. В смесях тяжёлой воды с обычной водой с большой скоростью происходит изотопный обмен с образованием “полутяжелой” воды: Н2O + D2O = HDO. Поэтому дейтерий при малом содержании присутствует в воде в форме НDO, а при высоком - в форме D2O.

Долгое время считалось, что тяжёлая вода несовместима с жизнью. Эксперименты по выращиванию клеток различных организмов в тяжелой воде показали токсическое действие D2О; высокие концентрации тяжёлой воды приводят к замедлению метаболизма, ингибированию митоза в стадии профазы и даже в некоторых случаях вызывать спонтанные мутации [4].

Систематическое изучение воздействия D2О на клетки животных и растений в нашей стране начато сравнительно недавно [5]. Эксперименты показали, что тяжелая вода действует отрицательно на жизненные функции организмов; это происходит даже при использовании обычной природной воды с повышенным содержанием тяжелой воды [6]. Несмотря на биостатический эффект, оказываемый тяжёлой водой на клетки, некоторые бактерии способны выдерживать 90% D2О [7], в то время как растительные клетки могут нормально развиваться при концентрациях 50-75% D2О [8], а клетки животных не более 35% D2О [9]. При этом понижение содержания дейтерия в воде на 25% ниже физиологического уровня стимулирует жизненные процессы [10].

С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать для направленного синтеза дейтерированных природных соединений полученные в результате генной инженерии и мутагенеза различные штаммы-продуценты [11]. Традиционным методом при этом является выращивание бактерий на средах, содержащих максимальные концентрации тяжёлой воды и других дейтерированных субстратов, например, [D]метанол [12]. Однако данный метод редко применяется в биотехнологии, из-за трудностей роста и адаптации на средах с максимальными концентрациями D2О. Вследствие этого ряд вопросов принципиальной возможности использования различных штаммов-продуцентов для роста и биосинтеза на высокодейтерированных средах, остаются не изученными.

Целью настоящей работы было исследование физиологических параметров бактериальных штаммов продуцентов природных соединений, относящихся к различным таксономическим группам микроорганизмов, осуществляющим метилотрофный, хемогетеротрофный и фотоорганогетеротрофный способы ассимиляции углеродных субстратов, при росте на D2O-содержащих средах.

Объекты исследования и методы

Объектами исследования являлись штаммы-продуценты аминокислот, белков и нуклеозидов, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ)

Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика:

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм грамотрицательных факультативных метилотрофных бактерий, продуцент фенилаланина.

2. Methylobacillus flagellatum КТ, изолейцинзависимый штамм грамотрицательных облигатных метилотрофных бактерий, продуцент лейцина.

3. Bacillus subtilis В-3157, полиауксотрофный по гистидину, тирозину, аденину и урацилу штамм грамположительных хемогетеротрофных спорообразующих бактерий, продуцент пуринового рибонуклеозида - инозина.

4. Halobacterium halobium ЕТ 1001, пигментсодержащий штамм фотоорганогетеротрофных галобактерий, способный синтезировать бактериородопсин.

Для приготовления ростовых сред использовали D2O (99,8 ат.% D), DСl (95,5 ат. % D) и [D]метанол (97,5 ат.% D), полученные из Российского научно-исследовательского центра “Изотоп” (Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в D2О, D2O дистиллировали над KMnO4 с последующим контролем изотопной чистоты 1Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (частота 70 МГц).

В качестве источников ростовых субстратов для выращивания хемогетероорганотрофных и галобактерий использовали дейтерированную биомассу факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, полученную в условиях многостадийной адаптации на твердых агаризованных средах (2% агар) с 2%-ным [D]метанолом, содержащих ступенчато увеличивающиеся концентрации тяжёлой воды (от 0 до 98% D2О). Полученную дейтеро-биомассу B. methylicum (выход составил 100 г по влажному весу с 1 л. среды) автоклавировали в 0,5 Н растворе DСl (в D2O) (0,8 атм, 30 мин), нейтрализовали 0,1 Н КОН (в D2O) (рН 7,0) и использовали в качестве источника ростовых факторов для адаптации и выращивания хемогетеротрофных и галобактерий.

Для выращивания бактерий использовали следующие ростовые среды (количества компонентов приведены в г/л):

1. Минимальная среда М9 для выращивания метилотрофных бактерий, на основе различных концентраций D2O (см. таблицу 1 и таблицу 2) и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической потребности бактерий) или [D]метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0,5; NH4Cl 1.

2. Среда ГС1 для выращивания грамположительных бактерий (на основе 99,8 ат.% D2О): глюкоза 120; гидролизат дейтеро-биомассы B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4.7H2O 20; мел 20.

3. Среда ГС2 для выращивания галобактерий (на основе 99,8 ат.% D2О): NaCl 250; MgSO4.7H2O 20; KCl 2; CaCl2.6H2O 0,065; цитрат натрия 0,5; гидролизат дейтеро-биомассы B. methylicum 20.

Рост бактерий определяли по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред, а также по величине ОП суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 (США) при 620 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм.

Выращивание метилотрофных и хемогетеротрофных бактерий проводили при 34-350С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации, используя в качестве источников дейтерия D2O и [D]метанол. Фотоорганогетеротрофные галобактерии выращивали при 380С при освещении лампами дневного света ЛБ-40. После 4-5 суток клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В КЖ анализировали секретируемые аминокислоты и нуклеозиды. Биомассу использовали для выделения внутриклеточных белков, полисахаридов и липидов.

Секретируемые фенилаланин и инозин определяли на приборе Beckman DU-6 (США). Фенилаланин определяли при 540 нм в образцах КЖ, объёмом 10 мкл после обработки препаратов КЖ нингидрином, инозин - при 249 нм. Определение содержания глюкозы в КЖ проводили глюкозооксидазным методом.

Выделение бактериородопсина из клеточной мембраны H. halobium проводили по раннее разработанному нами методу [13], с использованием светозащитной лампы с оранжевым светофильтром ОРЖ-1X (200 x 0.5 мм).

Гидролиз белка дейтерированной биомассы проводили в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти кратном избытке 6 Н DCl (в D2O) при 1100С в течение 24 ч. Гидролиз внутриклеточных полисахаридов проводили в 25% D2SO4 путем кипячения биомассы с обратным водяным холодильником в течении 90 мин.

Масс-спектры электронного удара ЭУ получены на приборе МB-80A (Hitachi, Япония) с двойным фокусированием (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, ускоряющее напряжение 8 кВ, температура катодного источника 180-2000С) после модификации аминокислот в метиловые эфиры N-5-(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных (дансильных) производных аминокислот. Масс-спектры FAB получены на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США), снабженным цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0,6-0,8 мА.

Результаты и обсуждение

Адаптация метилотрофных бактерий M. flagellatum и B. methylicum. Для проведения адаптации к тяжёлой воде использовались представители двух различных таксономических групп метилотрофных бактерий: лейцинпродуцирующий грамотрицательный штамм облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum, ассимилирующий метанол по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазному варианту рибулозо-5-монофосфатного (РМФ) цикла фиксации углерода [14] и фенилаланинпродуцирующий грамотрицательный штамм факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, ассимилирующий метанол по РМФ-циклу фиксации углерода [15]. Для выращивания и адаптации штаммов метилотрофных бактерий использовали минимальные среды М9, содержащие в качестве источников дейтерия D2O и [D]метанол. В зависимости от физиологической потребности штаммов в углеродном субстрате в ростовых средах использовали 0.5-2% метанол/[D]метанол и их смеси. Для компенсации ауксотрофности по лейцину и изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде в концентрациях не превышающих 10 мг/л. В обычных условиях выращивания на протонированных средах М9 уровни накопления фенилаланина и лейцина в КЖ штаммов-продуцентов cоставили 0,8 г/л и 1,0 г/л соответственно.

Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации D2О в ростовых средах в присутствии 0,5-1% метанола/[D]метанола, так как мы предположили, что постепенное привыкание клеток к дейтерию будет оказывать благоприятный эффект на параметры бактериального роста (табл. 1). Для изучения влияния уровня дейтерированности источника углерода на ростовые параметры штамма в опытах (1, 4 и 7) использовали протонированный метанол и смеси метанола и [D]метанола в опытах (2, 3, 5, 6, 8). Согласно полученным данным, замена протонированного метанола его дейтерированным аналогом в условиях одинаковых концентраций D2О в среде приводила к небольшим уменьшением ростовых характеристик штаммов (табл. 1, опыты 3, 6, 8). Изменение ростовых параметров штамма M. flagellatum изменялось пропорционально увеличению градиента концентрации D2О в ростовых средах. Данный штамм метилотрофных бактерий обнаружил повышенную чувствительность к D2O: ингибирование скорости бактериального роста наблюдалось при 74,5% D2O в среде, в то время как [D]метанол не оказывал существенного влияния на скорость роста бактерий. Так, на среде, содержащей 74,5% D2О выход микробной биомассы составил 25%, что в 3.4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол (табл. 1, опыт 8), в то время как выход микробной биомассы на водной среде с 1%-ным [D]метанолом был снижен всего лишь в 1,2 раза. Из-за повышенной чувствительности к D2O, данный штамм удалось адаптировать лишь к 74,5% D2О. Выше этой концентрации D2О наблюдалось ингибирование бактериального роста. Полученные для М. flagellatum данные свидетельствуют о том, что адаптация к тяжёлой воде определяется как видовой таксономической специфичностью метилотрофных бактерий, так и особенностями ассимиляции углеродных субстратов по облигатному или факультативному типу.

Таблица 1. Влияние изотопного состава среды на рост бактерии M. flagellatum

*Данные опытов 1-7 приведены для M. flagellatum при выращивании на водных средах, содержащих 0,5-1% метанол/[D]метанол и указанное количество (об.%) D2О. Данные опыта 8 приведены для адаптированной к максимальному содержанию дейтерия в среде бактерии M. flagellatum при выращивании на водной среде, содержащей 1% [D]метанол и 74,5% D2О. В качестве контроля использовали опыт 1, где применяли обычную воду и метанол.

В опытах по адаптации B. methylicum к росту и биосинтезу фениалаланина на максимально дейтерированной среде с 98% D2О был достигнут положительный результат. Адаптация заключалась в серии из пяти адаптационных пассажей суспензии клеток на твёрдых агаризованных средах с 2%-ным [D]метанолом при ступенчатом увеличении концентрации тяжёлой воды (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98% D2О), как показано в табл. 2. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих D2О. Затем их пересевали на среды с большим уровнем дейтерированности, включая среду с 98% D2О (степень выживаемости бактерий на конечной максимально дейтерированной среде составила не более 40%). За ходом адаптации наблюдали по изменениям продолжительности лаг-периода, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по максимальному уровню накопления фенилаланина в КЖ (рис. 1).

Таблица 2. Влияние изотопного состава среды на рост бактерии В. mehylicum*

* Данные опытов 1-10 приведены для B. methulicum при выращивании на водных средах, содержащих 2% метанол/[D]метанол и указанное количество (об.%) D2О. Данные опыта 10' приведены для адаптированной к максимальному содержанию дейтерия в среде бактерии B. methulicum при выращивании на водной среде, содержащей 2% [D]метанол и 98% D2О. В качестве контроля использовали опыт 1, где применяли обычную воду и метанол.

Как и в случае с M. flagellatum, замена протонированного метанола [D]метанолом при одинаковых концентрациях D2О в ростовых средах приводила к небольшим уменьшениям ростовых характеристик штамма (табл. 1, опыты 2, 4, 6, 8 и 10). Поэтому в дальнейших опытах использовали среды с D2О и [D]метанолом. На контрольной протонированной среде (1) с водой и метанолом продолжительность лаг-периода и времени клеточной генерации B. methylicum составили 20 ч и 2,2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л КЖ (табл. 1, опыт 1). В промежуточных опытах (2-10) ростовые параметры изменялись пропорционально концентрации D2О в ростовых средах. Выявленная закономерность заключалась в увеличении продолжительности лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием самых низких значений этих параметров в максимально дейтерированной среде с 98% D2О и 2% [D]метанолом (табл. 1, опыт 10). С увеличением концентрации D2О в ростовых средах до 98% продолжительность лаг-периода увеличивалась до 60 часов (табл. 2, опыт 10). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением концентрации D2O в ростовых средах постепенно увеличивается, достигая 4,9 ч. на среде с 98% D2O и 2% [D]метанолом (табл. 2, опыт 10). В отличие от D2О, [D]метанол не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выход микробной биомассы. Напротив, на максимально дейтерированнной среде выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по сравнению с контролем. Важно то, что выход микробной биомассы и уровень накопления фенилаланина в КЖ при росте адаптированного к D2О микроорганизма в максимально дейтерированной среде изменяются по сравнению с контрольными условиями на 13% и 5%, т. е. незначительно (табл. 2, опыт 10').

За ходом адаптации, условия которой cоответствуют опыту 10' (табл. 1) наблюдали, исследуя динамики роста исходного (б) и адаптированного к дейтерию (в) штамма в максимально дейтерированной среде М9 (рис. 1, контроль (а) получен в протонированной среде), а также по изменению продолжительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы. В отличие от адаптированного штамма (в), рост исходного штамма (б) в максимальной дейтерированной среде ингибировался дейтерием (рис. 1).

Рис. 1. Динамики роста В. methylicum (1a, 1б, 1в) и накопления L-фенилаланина в КЖ (2а, 2б, 2в) на средах М9 с различным изотопным составом: а - исходный штамм на протоннированной среде М9; в -адаптированный В. methylicum на полностью дейтерированной среде; б - неадаптированный штамм на полностью дейтерированной среде.

Во всех опытах выход микробной биомассы у адаптированного штамма (в) уменьшался на 13% по сравнению с контрольными условиями при увеличении времени генерации до 2,8 ч, а продолжительности лаг-периода до 40 ч. Адаптированный штамм возвращался к нормальному росту при переносе в протонированную среду после пролонгированного лаг-периода, что доказывает фенотипическую природу феномена адаптации, что наблюдалось для других адаптированных нами штаммов бактерий [16]. Улучшенные ростовые характеристики адаптированного метилотрофа существено упрощают схему получения дейтеро-биомассы, оптимальным условиям которой удовлетворяет максимально дейтерированная среда М9 с 98% D2О и 2% [2Н]метанолом (инкубационный период 5-6 сут при 350С).

Важной особенностью является то, что адаптированные к D2О клетки сохранили способность синтезировать и экзогенно продуцировать фенилаланин в КЖ. Общей особенностью биосинтеза фенилаланина в Н2О/D2O-средах было увеличение его продукции на раней фазе экспоненциального роста B. methylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. 1). Во всех опытах наблюдалось ингибирование биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, характер динамики секреции фенилаланина не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик на различных стадиях роста, что являлось подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Скорее всего, накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, не исключена возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение секретируемого фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза, что отмечено в других работах [17]. Данные по исследованию КЖ методом масс-спектрометрии ЭУ показали, что кроме фенилаланина штамм B. methylicum синтезирует и накапливает в КЖ (на уровне 5-6 ммоль) метаболически связанные аминокислоты (аланин, валин, лейцин, изолейцин), присутствие которых подтверждалось масс-спектрометрическим анализом производных аминокислот.

Во всех опытах наблюдалось специфичное возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций D2О в ростовой среде (табл. 3). Уровни включения дейтерия в молекулы разных аминокислот при одинаковых концентрациях D2О в ростовых средах различаются. Так, для индивидуальных экзогенных аминокислот, секретируемых в КЖ В. melhylicum, количество включённых атомов дейтерия по скелету молекул варьирует в пределах 49%-ной D2О и составляет для фенилаланина 27,5%, аланина - 37,5%, валина - 46,3%, лейцина/изолейцина - 47% (табл. 5). Аналогичное увеличение молекулярной массы аминокислот в зависимости от концентрации тяжёлой воды в среде было зафиксировано во всех изотопных экспериментах.

Таблица 3. Уровни включения дейтерия в молекулы экзогенных аминокислот В. melhylicum* и M. flagellation**.

* Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. methyticum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O.

Поскольку В. methylicum является ауксотрофом по лейцину, эту аминокислоту добавляли в ростовые среды в протонированном виде. Как показали исследования по включению дейтерия к молекулы экзогенных аминокислот, в условиях ауксотрофности по лейцину степень изотопного обогащения лейцина, а также метаболически связанных с ним аминокислот немного ниже, чем для других аминокислот. Так, при росте В. methylicum на среде, содержащей 98 об.% D2О и немеченный лейцин, уровни включения дейтерия в молекулу лейцина составили 51,0%, аланина - 77,5%, валина - 58,8% (табл. 5). Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина de novo. Другим объяснением наблюдаемого эффекта может быть ассимиляция клеткой протонированного лейцина из ростовой среды на фоне биосинтеза меченного изолейцина de novo.

Контроль за включением дейтерия в молекулу фенилаланина за счет конверсии дейтерометанола при росте бактерий на среде, содержащей обычную воду и 2 об.% [D] метанол (соответствуют опыту 2, табл. 1) показал незначительное количество дейтерия, поступающее в молекулу фенилаланина вместе с углеродом CD3OD. Уровень дейтерированности фенилаланина был вычислен по величине пика с m/z 413 за вычетом вклада пика примеси природного изотопа (не более 4%). Полученный результат объясняется разбавлением дейтериевой метки за счёт протекания биохимических процессов, связанных с распадом CD3OD при его ассимиляции клеткой, так и реакциями изотопного обмена и диссоциации в тяжёлой воде. Так, из четырёх атомов дейтерия в молекуле CD3OD, лишь один атом дейтерия при гидроксильной группе -OD самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием CD3OD. Три оставшихся атома дейтерия в молекуле CD3OH входят в цикл ферментативного окисления метанола, который мог привести к потере дейтериевой метки за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. В частности, такое включение дейтерия в молекулу фенилаланина подтверждает классическую схему ферментативного окисления метанола до формальдегида в клетках метилотрофов, который после этого ассимилируется у данного штамма метилотрофных бактерий РМФ-путем фиксации углерода [18].

Поскольку при работе с микробной биомассой возникают проблемы, связанные с очисткой от сопутствующих внутриклеточных компонентов (пигменты, липиды, полисахариды), было необходимо применять специальные подходы при выделении фракции суммарных белков из бактериальных источников. При выделении фракции суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий В. methylicum и M. flagellatum учитывалось наличие в них углеводов, пигментов и липидов. Гидролиз биомассы проводили после отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями (метанол-хлороформ-ацетон) в 6 Н растворе DCl для предотвращения реакций обратного изотопного обмена (H-D) в аминокислотах и их разрушения. Дейтерированные аминокислоты в составе гидролизатов суммарного белка биомассы были разделены методом обращённо-фазовой ВЭЖХ со степенью хроматографической чистоты 93-96% и выходами 75-89% в условиях, аналогичных таковым для разделения секретируемых аминокислот (табл. 6).

Во всех опытах по изучению содержания дейтерия в аминокислотных остатках белка наблюдалась корреляция между степенью изотопного насыщения среды и уровнями включения дейтерия в аминокислоты (табл. 4), Так, для индивидуальных аминокислот белковых гидролизатов количество включенных атомов дейтерия по скелету молекулы варьирует незначительно в пределах 98% D2O и составляет для глицина 90%, аланина - 97% и фенилаланина - 95%. Сниженные уровни включения дейтерия в молекулы лейцина (49%), а также в метаболически связанных аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены за счет ауксотрофности штамма в лейцине, который добавляли в среду культивирования в протонированной форме. Полученный результат по разбавлению дейтериевой метки в лейцине объясняется сохранением доли минорных реакций в биосинтезе лейцина de novo.

Как ожидалось, уровни включения дейтерия в метаболически связанные аминокислоты обнаружили определённую корелляцию. Так, уровни изотопного включения валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических кислот) совпадают. Уровни изотопного включения глицина и серина (семейство серина), аспарагина и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины. Сравнивая данные изотопного обогащения экзогенных аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарных белков, в целом, также кореллируют.

Таблица 4. Уровни включения дейтерия в аминокислотные остатки общих белков биомассы В. melhyiicum* и М. flagellatum**.

* Данные по включению дейтерия в аминокислоты приведены для В. melhyiicum при росте на средах, содержащих 2 об.% СН3ОН и 24,5; 49,5; 73,5; 98,0 об.% D2O.

Адаптация хемогетеротрофных грамположительных бактерий B. subtilis. Полученный результат в опытах по адаптации факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum к тяжёлой воде, позволил использовать гидролизаты дейтерированной биомассы B. methylicum, полученной в процессе многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде, в качестве источников дейтерированных ростовых субстратов для выращивания штамма грамположительных хемогетеротрофных бактерий В. subtillis - продуцента инозина. Усваиваемость биомассы метилотрофов клетками эукариот и прокариот составляет 85-99%, а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта достигает 50% [19]. При этом учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 55% от веса сухого вещества), а 1517% полисахаридов, 1012% липидов (в основном, фосфолипиды) и 18% зольных веществ [20]. Причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих D2О и [D]метанол. Чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного (Н-D) обмена в аминокислотных остатках молекул белков, гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0,5 Н DCl (в D2O) при 0,8 атм в течение 30 мин.

Ростовые характеристики штамма B. subtilis изучали в протонированной дрожжевой среде ГС1 с обычной водой и синтетической тяжеловодородной ГС2 среде с 98% D2О и 2% гидролизатом дейтеро-биомассы B. methylicum (рис. 2). Отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 2, 1а, 2а), выхода инозина (рис. 2, 1б, 2б) и ассимиляции глюкозы (рис. 2, 1в, 2в). При выращивании адаптированного B. subtilis в полностью дейтерированной среде, уровень накопления инозина в КЖ снижается по-сравнению с исходным штаммом в протонированной среде. Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован в опыте 1б (рис. 2, 1б) на протонированной среде при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 2, 1в). На тяжеловодородной среде выход инозина снижался в 4,4 раза (3,9 г/л) (рис. 2, 2б), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л остаточной неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 2, 2в). Сниженный выход инозина в полностью дейтерированной ГС2 среде находится в корелляции с уровнем конверсии глюкозы, которая в D2O ассимилировалась не полностью, что свидетельствует о том, что при росте в 2Н2О глюкоза расходуется менее эффективно, чем в контрольных условиях.

Рис. 2. Динамики роста B. subtilis (1a, 2a), накопления инозина в культуральной жидкости (1б, 2б) и конверсии глюкозы (1в, 2в) и на средах с различным изотопным составом: 1 а,б,в - B. subtilis на обычной протонированной ГС1 среде; 2 а,б,в - B. subtilis на полностью дейтерированной ГС2 среде с гидролизатом дейтеро-биомассы факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum.

Полученный результат по уровню конверсии глюкозы на D2О-среде требовал изучение содержания глюкозы и других внутриклеточных углеводов штамма продуцента, проведенное методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Ultrasorb CN, 10 мкм, 10x250 мм с подвижной фазой 75% ацетонитрил + 25% вода (табл. 5). Смесь внутриклеточных углеводов в табл. 5 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных углевода с временами удерживания 3,08 мин (15,63%), 4,26 мин (7,46%), 7,23 мин (11,72%) и 9,14 мин (7,95%) (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21,4% от сух. веса, то есть выше, чем фруктозы (6,82%), рамнозы (3,47%), арабинозы (3,69%) и мальтозы (11,62%). Их выходы существенно не отличались от контроля на Н2О, за исключением сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектируется (табл. 5).

Табл. 5. Качественный и количественный состав углеводов, выделенных из гидролизатов биомассы B. subtilis.

Секретируемый инозин выделяли из КЖ адсорбцией/десорбцией на поверхности активированного угля, экстракцией 0,3 М NH4-формиатным буфером (рН 8,9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле и колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенным 0,3 М NH4-формиатным буфером с 0,045 М NH4Cl со степенью хроматографической чистоты 92%.

Уровень дейтерированности молекулы инозина, исследованный методом масс-спектрометрии FAB, составил 5 атомов дейтерия с включением 3 атомов дейтерия в рибозный и 2 атомов дейтерия в гипоксантиновый фрагменты молекулы. Полученный результат подтверждается присутствием в масс-спектре FAB дейтерированного инозина ионизированного протоном пика молекулярного иона инозина [М+H]+ c m/z 274, 28% (вместо [М+H]+ c m/z 269,43% в контрольных условиях), а также двух “тяжелых” пиков фрагментов рибозы А m/z 136, 46% (вместо m/z 133, 41%) и гипоксантина Б m/z 138, 55% (вместо m/z 136, 48%), а также пиков низкомолекулярных фрагментов, продуктов распада гипоксантина В m/z 111, 49% (вместо m/z 109, 45%) и Г m/z 84, 43% (вместо m/z 82, 41%) (ри. 3)

Рис. 3. Масс спектры FAB инозина (глицериновая матрица) в различных экспериментальных условиях: природный инозин (а); инозин, выделенный из тяжеловодородной ГС2 среды (б). Интервал сканирования при m/z 50-350, базовые пики с относительной интенсивностью 100% при m/z 52 и m/z 54, условия ионизации: цезиевый источник, ускоряющее напряжение 5 кВ, ионный ток 0.6-0.8 мА. Разрешающая способность 7500 усл. ед. I - относительная интенсивность пиков (%).

При анализе уровня дейтерированности инозина учитывались следующие аспекты. Вследствие того, что протоны (дейтероны) в С'1-C'2 положениях рибозного фрагмента молекулы инозина могли происходить из глюкозы, характер биосинтетического включения дейтерия в рибозный фрагмент определяется, в основном, функционированием процессов гексозо-6-монофосфатного (ГМФ) пути, связанного с ассимиляцией глюкозы и других углеводов. Реакции (Н-D) обмена могли привести к специфическому включению атомов дейтерия по определённым положениям в молекуле инозина. Такими доступными положениями в молекуле инозина являются гидроксильные протоны ОН- и протоны при гетероатомах NH+, которые могут обмениваться на дейтерий в D2О за счёт кето-енольной таутомерии. Поэтому, три атома дейтерия в рибозном фрагменте инозина могли происходить за счёт функционирования реакций ГМФ-пути, два атома дейтерия в гипоксантиновом фрагменте могли синтезироваться de novo. В частности, гликозидный протон в положении С'1 в рибозном фрагменте мог заместиться на дейтерий в процессе реакции элиминирования СО2 на стадии образования рибулёзо-5-монофосфата из 3-кето-6-фосфоглюконовой кислоты с последующим присоединением протона (дейтерона) по С1 - положению рибулoзо-5-монофосфата. В целом, наши исследования подтверждают эту схему.

Адаптация фотоорганогетеротрофных галобактерий H. halobium. В качестве другой модельной системы для введения дейтериевой метки в белки, использовали ретинальсодержащий белок бактериородопсин (БР), выполняющий роль АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране солелюбивой палочковидной фотоорганогетеротрофной галобактерии H. halobium ET [21]. Он представляет собой хромопротеид из 248 аминокислотных остатков, связанный с остатком лизина-216, который содержит в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 13-цис- и полностью транс-ретинольного С20-каротиноида, определяющего пурпурно-красный цвет этих бактерий. Несмотря на структурно-функциональную изученность БР, он остается в центре внимания биотехнологии из-за своей высокой светочувствительности и разрешающей способности и используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал с большими перспективами использования в био- и нанотехнологии [22]. БR также привлекателен, как модельный объект для изучения функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе искусственно сконструированных энергопреобразующих мембран [23].

Рис. 4. Динамики роста галобактерий H. halobium в различных экспериментальных условиях: протонированная синтетическая среда (1); синтетическая среда с 99% 2Н2О и гидролизатом дейтеро-биомассы B. methylicum.

Учитывая фотоорганогетеротрофный путь ассимиляции субстратов этим микроорганизмом, адаптацию H. halobium проводили на свету при освещение лампами дневного света ЛБ-40 путем рассева штамма до отдельных колоний на агаризованной (2% агар) ГС2 среде с 99.8 ат.% D2О и 20% гидролизатом дейтеро-биомассы факультативной метилотрофной бактерии B. methylicum с последующим отбором устойчивых колоний. Выделенные селекцией отдельные колонии клеток H. halobium, устойчивые к D2О, выращивали в жидкой среде ГС2 с 99.8 ат.% D2О аналогичного состава. В оптимальных условиях выращивания (380С, 4-5 сут, освещение лампами ЛБ-40) в клетках синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 1.5:1 идентичный природному БР. Рост галобактерий на дейтерированной среде (рис. 4, б) ингибировался незначительно по сравнению с контролем (а) на протонированной среде, что существенно упрощает оптимизацию условий наработки дейтерированной биомассы, которая заключается в выращивании штамма в дейтерированной среде с D2O и 20% гидролизатом дейтеро-биомассы B. methylicum, получением фракции пурпурных мембран, отделением низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, с последующей солюбилизацией белка 0,5% SDS-Na и фракционированием метанолом. Поскольку белок локализуется в ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после удаления 4,3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточной РНК. Так как фракция ПМ наряду с искомым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло задачу выделения индивидуального БР с применением методов декаротинизации и делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация, заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при -5 0С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ (степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 5 на различных стадиях обработки (б) и (в) относительно природного БР (а). Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле БР приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 5, в) основная полоса (1) при максимуме поглощения 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием транс-ретинального остатка ретиналя БР568, дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M412 c депротонированной альдиминной связью между остатком транс-ретиналя и белком, а полоса (3) при 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого БR соотношение D280/D568 равно 1,5:1).

Рис. 5. Спектры поглощения ПМ (в 50%-ном этаноле) на различных стадиях обработки: нативный БР (а); ПМ после промежуточной обработки (б); очищенные от посторонних каротиноидов ПМ (в). Полоса (1) соответствует спектральной форме БР568, (2) - примесь спектральной формы М412, (3) - полоса поглощения ароматических аминокислот, (4) и (5) - посторонние каротиноиды. В качестве контроля использовали природный БР.

Гомогенность выделенного дейтерированного бактериородопсина доказана комбинацией методов разделения и анализа белка, включая электрофорез в 12.5% ПААГ с 0.1% SDS-Na, гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-200, обращенно-фазовую ВЭЖХ. Суммарный уровень дейтерированности бактериородопсина, рассчитанный по уровням дейтерированности аминокислот, составил 92-95%.

Выводы

Таким образом несложный подход по адаптации клеток к тяжёлой воде позволил получить адаптированные штаммы микроорганизмов, способные расти на максимально дейтерированых средах и синтезировать природные соединения. Полученные данные свидетельствуют о том, что способность к адаптации к тяжёлой воде у разных микроорганизмов различная и варьирует в пределах одной таксономической группы. Из этого следует, что адаптация к тяжёлой воде определяется как таксономической принадлежностью микрооорганизмов, так и особенностями их метаболизма, функционированием различных путей ассимиляции углеродных субстратов, а также эволюционной нишей, которую занимает исследуемый объект. При этом, чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он приспосабливается к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов самыми примитивными в эволюционном плане являются галобактерии, относящиеся к археобактериям, практически не нуждающие в адаптации к тяжёлой воде, что нельзя сказать о метилотрофных бактериях, относящимся к эубактериям, которые труднее всех адаптируются к тяжёлой воде. Общей особенностью роста в тяжелой воде всех изученных нами микроорганизмов было снижение ростовых характеристик и уменьшение выходов биомассы при увеличении лаг-периода и времени клеточной генерации.

Предположительно клетка реализует особые адаптивные механизмы, способствующие функциональной реорганизации работы жизненно-важных систем в тяжёлой воде. Это может происходить на уровне изменения структуры и активностей биологически важных макромолекул - нуклеиновых кислот, протеинов и ферментов, поскольку связи, сформированные атомами дейтерия различаются по прочности и энергии от аналогичных связей с участием водорода. Последний факт обуславливает различия в кинетике биохимических реакций в тяжёлой и обычной воды. Различия в нуклеарной массе атома водорода и дейтерия также могут привести к изменениям структурно-функциональных свойств жизненно-важных соединений и клеточных органелл.

Литература

1. О. В. Мосин, Исследование методов биотехнологического получения аминокислот, белков и нуклеозидом, меченных стабильными изотопами 2Н и 13С с высокими уровнями изотопного обогащения, Автореф. диссерт. к.х.н., МГАТХТ им. М. В. Ломоносова, Москва (1996), с. 1-26.

2. В. Н. Лобышев, Л. П. Калиниченко, Изотопные эффекты D2O в биологических системах, Наука, Москва (1978), с. 215.

3. G. Lis, L. I. Wassenaar, M. J. Hendry, “High-Precision Laser Spectroscopy D/H and 18O/16O Measurements of Microliter Natural Water Samples”, Analytical Chemistry, 80(1), 287-293 (2008).

4. J. F. Thomson, “Physiological effects of D2O in mammals. Deuterium Isotope Effects in Chemistry and Biology”, Annals of the New York Academy of Sciences, 84, 736-744 (1960).

5. Е. И. Денько, “Действие тяжёлой воды на клетки животных, растений и микроорганизмы”, Успехи современной биологии, 70(4), 41 (1972).

6. W. Bild, V. Nгstasг, I. Haulicг, “In vivo and in vitro research on the biological effects of deuterium-depleted water: Influence of deuterium-depleted water on cultured cell growth”, Romanian Journal Physiology, 41(1-2), 53-67 (2004).

7. О. В. Мосин, Д. А. Складнев, Т. А. Егорова, А. М. Юркевич, В. И. Швец, “Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол”, Биотехнология, 3, 3-12 (1996).

8. D. J. Kushner, A. Baker, T. G. Dunstall, “Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds”, Canadian Journal Physiology and Pharmacology, 77(2), 79-88 (1999).

9. И. Н. Варнавский, Г. Д. Бердышев, В. Д. Прилипенко, “Целебная реликтовая вода - открытие третьего тысячелетия”, Вопросы химии и химической технологии, 5, 168-174 (2002).

10. Y. Sinyak, A. Grigoriev, V. Gaydadimov, T. Gurieva, M. Levinskih, B. Pokrovskii, “Deuterium-free water in complex life-support systems of long-tern space missions”, Acta Astronautica, 52, 575 (2003).

11. О. В. Мосин, Д. А. Складнев, В. И. Швец, “Изучение адаптации к тяжёлой воде”, Биотехнология, 10, 16-23 (1099).

12. О. В. Мосин, Д. А. Складнев, В. И. Швец, “Биосинтез 2Н-меченого инозина бактерией Bacillus subtilis”, Известия РАН. Серия биологическая”, 4, 396-402 (1999).

13. О. В. Мосин, Д. А. Складнев, В. И. Швец, “Включение дейтерированных ароматических аминокислот в молекулу бактериородопсина Halobacterium halobium”, Прикладная биохимия и микробиология, 35(1), 34-42 (1999).

14. E. N. Karnaukhova, O. V. Mosin, O. S. Reshetova, “Biosynthetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum”, Amino Acids, 5(1), 125 (1993).

15. O. V. Mosin, D. A. Skladnev, V. I. Shvets, “Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 62(2), 225-229 (1998).

16. Д. А. Складнев, О. В. Мосин, Т. А. Егорова, С. В. Еремин, В. И. Швец, “Метилотрофные бактерии - источники изотопномеченых 2Н- и 13С-аминокислот”, Биотехнология, 5, 25-34 (1996).

17. Н. П. Максимова, И. Н. Олехнович, Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у метилотрофных бактерий, Биохимия и физиология метилотрофов, Пущино (1987), c. 77-85.

18. О. В. Мосин, Е. Н. Карнаухова, А. Б. Пшеничникова, Д. А. Складнев, О. Л. Акимова, “Биосинтетическое получение дейтериймеченого фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum”, Биотехнология, 9, 16-20 (1993).

19. O. V. Mosin, E. N. Karnaukhova, D. A. Skladnev, Application of methylotrophic bacteria for the preparation of stable isotope labeled amino acids. in: 7th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Quebec, Canada (1994), p. 163.

20. O. V. Mosin, E. N. Karnaukhova, D. A. Skladnev, Preparation of 2H-and 13C-labeled amino acids via bioconvertion of C1-substrates. in: 8th International Symposium on Microbial Growth on C1 Compounds, San Diego, USA (1995), p. 80.

21. D. Oesterhelt, W. Stoeckenius, “Rhodopsin - like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium”, Nature, 233(89), 149-160 (1971).

22. N. Hampp, D. Oesterhelt, Bacteriorhodopsin and its Potential in Technical Applications. In: Nanobiotechnology (Ch. Niemeyer and C. Mirkin, eds.), Wiley-VCH-Verlag, Weinheim (2004), p. 146-167.

23. O. V. Mosin, E. N. Karnaukhova, A. B. Pshenichnikova, J. S. Reshetova, Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin. in: Sixth International Conference on Retinal Proteins, Leiden, The Netherlands (1994), Abstr.115.

Размещено на Allbest.ru