Микробиологический синтез фотопреобразующего трансмембранного белка бактериородопсина галобактерий Halobacterium halobium

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ФОТООБРАЗУЮЩЕГО ТРАНСМЕМБРАННОГО БЕЛКА БАКТЕРИОДОПСИНА ГАЛОБАКТЕРИЕЙ Halobacterium halobium

к.х.н. О.В. Мосин (Россия) Доктор наук, проф. И. Игнатов (Болгария)

Аннотация

Разработан микропрепаративный микробиологический синтез природного фотопреобразующего трансмембранного хромофорного белка бактериородопсина (выход 8- 10 мг), способного преобразовывать световую энергию в электрохимическую энергию генерируемых протонов H⁺ и АТФ, что важно для наноиндустрии новых современных отечественных фотопреобразующих наноматериалов и биомолекуляной электроники. Белок выделен из пурпурных мембран экстремальной аэробной галобактерии Halobacterium halobium после выращивания на специальной селективной среде с аминокислотами, нуклеотидами и витаминами обработкой бактериальной биомассы ультразвуком, спиртовой экстракцией низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, с последующей солюбилизацией белка 0,5% ДДС-Na и фракционированием метанолом. Гомогенность синтезируемого бактериородопсина доказаны комбинацией методов выделения и белкового анализа, включая УФ-спектроскопию, электрофорез в 12,5% ПААГ с 0,1% ДДС-Na и гель-проникающую хроматографию на сефадексе G-200.

ВВЕДЕНИЕ

Галофилы (лат. “любящие соль”), относящиеся по таксономической классификации к древним археобактериям Archebacteria, занимают особое место среди микроорганизмов. Это единственные организмы, способные существовать в средах с высоким содержанием солей. В Мертвом море, например, концентрация соли достигает 26-27% в некоторые годы повышается до 30%, а при 35% соль выпадает из раствора в осадок. Биохимический аппарат клеток, ферменты и рибосомы галофилов за счет сформировавшейся системы осморегуляции не только нечувствителен к высоким концентрациям солей, но нуждается в них и эффективно функционирует только в растворах с насыщенными концентрациями NaCl. При удалении из соленой среды, их клеточная стенка растворяется, а цитоплазматическая мембрана распадается на мелкие фрагменты.

Известный естествоиспытатель Бекинг в 1928 г. назвал галофильные бактерии организмами, “живущими на грани физиологических возможностей”. У них практически нет конкурентов, способных жить в таких же условиях, и поэтому галофилы свободно эволюционировали на протяжении всей истории развития жизни на Земле. Некоторые современные бактерии в экстремальных условиях приобретают черты галофилов и других древних археобактерий и утрачивают верхний более жесткий слой клеточной мембраны. Предполагается, что археобактерии утратили этот слой под воздействием высоких концентраций соли. Изменения в структуре их клеточных мембран обусловлены необходимостью обеспечить необходимую защиту клетки от агрессивного воздействия внешней среды. Процесс формирования защитных систем у галобактерий потребовал синтеза специфических соединений, практически не встречающихся в организмах других живых существ.

Возможно именно археобактерии были первыми формами жизни на Земле в первый период ее эволюции. Одним из важных аргументов в пользу этой гипотезы может быть тот факт, что представители многих видов археобактерий используют в качестве единственного источника углерода для биосинтеза компонентов клеточной биомассы различные аминокислоты. Как известно, именно обнаружение аминокислот в Космосе и в модельных первичных бульонах - коацерватных каплях - считается важным доводом в пользу возможного зарождения биологической жизни на нашей планете.

Используемый галобактериями механизм преобразования солнечной энергии в энергию химических связей АТФ, пригодную для использования в биохимических процессах, отличается от механизма классического фотосинтеза в растениях и зеленых водорослях, содержащих хлорофилл. Для этой цели галобактерии используют специальный хромофорный белок с молекулярным весом 26 кДа, называемым бактериородопсином по аналогии с белком зрительного аппарата млекопитающих - родопсином, обеспечивающим зрительное восприятие у человека и животных. Бактериородопсин был впервые выделен в из клеточной мембраны экстремальной фотоорганогетеротрофной галобактерии Halobacterium halobium в 1971 году В. Стохениусом (США) и Д. Остерхельтом (ФРГ) [1]. Этот фотопреобразующий белок с молекулярным весом 26 кДа представляет собой хромопротеид (рис. 1), связанный с остатком лизина-216, который содержит в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 13-цис- и полностью 13-транс-ретинольного С₂₀-каротиноида - аналога витамина А, определяющего пурпурно-красный цвет галофильных бактерий.

Несмотря на схожесть механизма действия, аминокислотная последовательность бактериородопсина сильно отличается от родопсина животных, что позволяет сделать вывод о их независимом эволюционном происхождении. Это подтверждается и тем, что ретиналь бактерий в молекуле бактериородопсина образует 13-цис-конфигурацию, а не 11-цис-конфигурацию, как в родопсине животных. Тем не менее, конформация бактериородопсина свидетельствует, что он наряду с родопсином принадлежит к семейству транспортных белков, которые вовлечены в большое число биохимических процессов. По своей структуре и расположению в мембране клетки бактериородопсин относится к трансмембранным белкам, пронизывающим всю толщу клеточной мембраны (рис. 1), которая может быть разделена на три фракции: желтую, красную и пурпурную. Содержащая бактериородопсин пурпурная фракция образует естественные двумерные кристалл, которые можно исследовать с помощью электронного микроскопа. Наряду с бактериородопсином в клеточной мембране галофилов содержится много других сопутствующих каротиноидных пигментов, основной из которых бактериоруберин, обусловливающих окраску галобактерий от розового до красного и красно-оранжевого цветов, что имеет для галофилов важное значение как средство защиты против избыточной радиации и солнечного излучения, так как для мест их обитания характерна высокая освещенность.

Рис. 1. Расположение молекулы бактериородопсина в клеточной мембране галофильной бактерии H. halobium.

биотехнология бактериородопсин мембрана нанопленка

Полипептидная цепь бактериородопсина состоит из 248 аминокислотных остатков, 67% которых являются гидрофобными [2], образованные с участием ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана (рис. 2, А). Молекулы бактериородопсина организованы в пурпурной мембране в виде тримеров; каждый тример окружён шестью другими так, что образуется правильная гексагональная решётка (рис. 2, B). Молекула бактериородопсина состоит из семи находящихся в конформации б--спирали сегментов, пронизывающих всю толщу мембраны клетки в направлении, перпендикулярном её плоскости (рис. 2, С). Этот факт позволил применить прямые физические методы для изучения пространственной структуры бактериородопсина в пурпурных мембранах галофильных бактерий. Комбинацией электронно-микроскопических и дифракционных методов анализа была определена молекулярная структура белка в виде конформации б-спирали [3]. Гидрофобные домены представляют собой трансмембранные сегменты, а гидрофильные домены выступают из мембраны и соединяют отдельные внутримембранные б-спиральные тяжи белковой молекулы.

Благодаря своей уникальной структуре молекула бактериородопсина выполняет функции светозависимого протонного насоса, перекачивающего протоны через мембрану клетки и создающего электрохимический градиент протонов Н+ на поверхности клеточной мембраны, энергия которого используется клеткой для синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в анаэробном фотосинтетическом фосфорилировании. Этот механизм синтеза АТФ получил название “бесхлорофильный фотосинтез” (рис. 3) в отличие от реализуемого растениями фотосинтеза с участием хлорофилла. В этом механизме при каждом поглощении молекулой бактериородопсина фотона света наружу через мембрану переносятся два протона.

Рис. 2. Расположение молекул бактериородопсина в пурпурной мембране (А), карта электронной плотности пурпурных мембран (Б) и пространственная структура молекулы бактериородопсина (С).

При поглощении кванта света бактериородопсин ВR₅₄₈ обесцвечивается, вступая в цикл фотохимических превращений, в результате которого между внутренней и наружной сторонами мембраны устанавливается градиент концентрации протонов Н⁺ [4]. Образование градиента концентрации Н⁺ приводит к тому, что освещённые клетки галобактерий начинаю синтезировать АТФ, т.е. преобразуют энергию света в химическую энергию связей.

Рис. 3. Бесхлорофильный синтез АТФ в клетках Halobacterium halobium.

При наличии кислорода и органических соединений, которые могут использоваться в качестве источников ростовых субстратов и энергии, галофилы способны развиваться и в темноте, переключая свой фотосинтетический метаболизм на гетеротрофный. Однако при недостатке или даже в полном отсутствии кислорода и ярком освещении в клеточной мембране галобактерий синтезируется бактериородопсин, позволяющий им использовать солнечную энергию для синтеза АТФ.

Механизм последовательного переноса Н⁺ посредством молекулы БР через мембрану клетки включает цепь водородных связей, образованных боковыми радикалами гидрофильных аминокислот и простирающуюся через всю толщу белка. Перенос Н⁺ через цепь осуществляется в том случае, если она состоит из двух участков и содержит функциональную фотохромную группу, способную под воздействием фотона света изменять свое микроокружение и тем самым последовательно “замыкать” и “размыкать” эти участки связывания и переноса протона Н⁺ через клеточную мембрану. Роль такого “челночного” механизма между двумя белковыми проводниками Н⁺, один из которых сообщается с внешней, а другой - с цитоплазматической поверхностью мембраны клетки, играет альдимин ретиналя, связанный шиффовым основанием (как в зрительных пигментах животных) с остатком лизина-216 белкового фрагмента молекулы БР. Ретиналь имеет 13-транс-конформацию и располагается в мембранном туннеле между белковыми б-спиралями, блокируя поток протонов. При поглощении фотона света происходит обратимая изомеризация 13-Z-БР (l _макс 548 нм) (квантовый выход 0.03 при 20 ⁰С) в all-E-БР (l _макс 568 нм) [5], инициирующая каскад фотохимических реакций с образованием промежуточных интермедиантов J₆₂₅, К₅₉₀, L₅₅₀, М_412, N₅₆₀, и O₆₄₀ с последующим отрывом Н⁺ из ретинального остатка БР и его присоединением со стороны цитоплазмы (рис. 4). В этом процессе молекула ретиналя изгибается в мембранном туннеле и переносит протон Н⁺ с внутренней цетоплазматической мембраны на внешнюю мембрану клетки. В результате между внутренней и внешней поверхностью мембраны образуется градиент концентрации Н⁺, приводящий к тому, что при освещении светом клетки галобактерий начинают синтезировать АТФ. Этот процесс обратим и в темноте протекает в обратном направлении [6].

Рис. 4. Фотохимические реакции превращения молекулы БР (водная суспензия, рН 7,2, 20 ⁰С).

Латинские цифры обозначают спектральные интермедианты бактериородопсина. Верхние индексы “c” и “t” относятся к циклам 13-цис- и 13-транс-производных БР, “L” и “D” обозначают световую и темновую формы пигментов. Нижние индексы соответствуют положению максимума поглощения интермедиаторов фотоцикла (в нм).

Несмотря на структурно-функциональную изученность, бактериородопсин остается в центре внимания био- и нанотехнологии прежде всего, благодаря своей высокой светочувствительности и разрешающей способности, и используется в молекулярной биоэлектронике как природный фотохромный материал в качестве управляемых светом или электрическими импульсами модулей компьютерных и оптических систем [7]. Кроме этого, бактериородопсин очень привлекателен, как модельный объект для исследований, связанных с изучением функциональной активности и структурных свойств фотопреобразующих мембранных белков в составе искусственных нативных энерго- и фото-преобразующих мембран [8].

Природные фотопреобразующие наноматериалы также представляют большую ценность для коммерческой нано- и биотехнологии, а также фармакологических и биомедицинских исследований на их основе [9]. Например, бактериородопсинсодержащие наноплёнки, полученные с использованием пурпурных мембран галобактерий, содержащих бактериородопсин, используются в качестве компонента в биомолекулярной электроники - раздела электроники и нанотехнологий, в которых используются биоматериалы и принципы переработки информации биологическими объектами в вычислительной технике для создания электронных устройств (рис. 6). Впервые в мире такие пленки на основе молекул бактериородопсина были получены и исследованы в нашей стране в рамках проекта "Родопсин" [10]. В 90-х годах была продемонстрирована эффективность и перспективы использования наноматериалов "Биохром" в качестве фотохромных материалов для голографической записи. Основной задачей при изготовлении бактериородопсинсодержащих нанопленок является ориентация пурпурных мембран, содержащих бактериородопсин между гидрофобными и гидрофильными средами, например, между водой и воздухом, как это распространено в природе. Как правило, для улучшения характеристик бактериородопсинсодержащих пленок, используется несколько слоев, которые наносятся на поверхность полимерного носителя и высушиваются в определенных условиях с сохранением своей природной структуры. Наилучшие показатели достигаются при изготовлении пленок на основе желатина. Это позволяет добиться высокой концентрации бактериородопсина (до 50%) в нанопленках, избежать агрегации фрагментов пурпурных мембран а также разрушения бактериородопсина в процессе изготовления. Встроенные в желатиновую матрицу фрагменты пурпурных мембран долговечны (около 10⁴ часов) и устойчивы к воздействию многих факторов как при изготовлении, так и в процессе эксплуатации (колебания температуры, интенсивное воздействие светом с помощью лазера и др.). На основе бактериородопсина был сконструирован фоторецептор с микроэлектродом из SnO₂, состоящий из 64 ячеек (пикселей), размером 2,5x2,5 мм и напряжением от 0 до 0,7 В. Чтобы отобразить образы, возникающие на таком фоторецепторе, слабый ток элементов (3- 10 нА) усиливается в напряжение от 1 до 10 V и затем подается на светоизлучающие диоды.

Целью настоящей работы являлась разработка биотехнологии получение препаратов бактериородопсина в микропрепаративных количествах для дальнейшей реконструкции искусственных энерго- и фото-преобразующих мембран и нанопленок.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве продуцента бактериородопсина использовали каротиноидсодержащий штамм аэробных фотоорганогетеротрофных галобактерий H. halobium ЕТ 1001, полученный из коллекции культур МГУ. Штамм модифицирован селекцией отдельных колоний на твердой (2% агар) пептоновой среде с 4,3 М NaCl.

Бактериальный рост изучали по ОП бактериальной суспензии, измеренной при л 620 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (США). УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Beckman DU-6 (США) в диапазоне длин волн 200-750 нм. Центрифугирование осуществляли на центрифуге Т-24 (Германия) с охлаждением при 4 ⁰С. ТСХ производных аминокислот проводили на хроматографических пластинках с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufol UV-254 (Kavalier, Чехословакия) в системе растворителей: н-бутанол : уксусная кислота : вода = 12 : 3 : 5, об.%. Электрофорез проводили в 12,5% ПААГ с 0,1% SDS-Na в соответствии с протоколом фирмы LKB (Швеция). Для количественного определения содержания синтезированного в клетке белка проводили сканирование прокрашенного в растворе кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре Beckman CDS-200 (США). Процедура выделения БР проводилась с использованием светозащитной лампы с оранжевым светофильтром ОРЖ-1X.

Биосинтетический бактериородопсин (выход 8-10 мг с 1 грамма бактериальной биомассы) получен в синтетической среде (количества компонентов приведены в г/л): D,L-аланин - 0,43; L-аргинин - 0,4; D,L-аспарагиновая кислота - 0.45, L-цистеин - 0.05, L-глутаминовая кислота - 1.3, L-глицин - 0,06; D,L-гистидин - 0,3; DL-изолейцин - 0,44; L-лейцин - 0,8; L-лизин - 0,85; D,L-метионин - 0,37; D,L-фенилаланин - 0,26; L-пролин - 0,05; D,L-серин - 0,61; D,L-треонин - 0,5; L-тирозин - 0,2; D,L-триптофан - 0,5; D,L-валин - 1,0; АМФ - 0,1; УМФ - 0,1; NaCl - 250; MgSO₄ ^. 7H₂O - 20; KСl - 2; NH₄Cl - 0,5; KNO₃ - 0,1; KH₂PO₄ - 0,05; K₂HPO₄ - 0,05; Na⁺-цитрат - 0,5; MnSO₄ ^. 2H₂O - 3 x 10^-4; CaCl₂ ^. 6H₂O - 0,065; ZnSO₄ ^. 7H₂O - 4 x 10^-5; FeSO₄ ^. 7H₂O - 5 x 10^-4; CuSO₄ ^. 5H₂O - 5 x 10^-5; глицерин - 1,0; биотин - 1 x 10^-4; фолиевая кислота - 1,5 x 10^-4; витамин В₁₂ - 2 x 10^-5. Ростовую среду автоклавировали 30 мин при 0,5 атм, рН доводили 0,5 М КОН до 6,5-6,7. Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера, вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси 100 мл) 4- 5 сут при 35 ⁰С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad 380-S (Венгрия) и освещении монохромными лампами ЛДС-40 (3 лампы x 1.5 лк).

Выделение фракции пурпурных мембран (ПМ). Биомассу (1 г) промывали дистиллированной водой и осаждали центрифугированием (1500 g, 20 мин). Осадок суспендировали в 100 мл дистиллированной воды и выдерживали 3 ч при 4 ⁰С. Реакционную смесь центрифугировали (1500 g, 15 мин), осадок ресуспендировали в 20 мл дистиллированной воды и дезинтегрировали ультразвуком (22 кГц, 3 x 5 мин) в водяной бане со льдом (0 ⁰С). Клеточный гомогенат после промывки дистиллированной водой суспендировали в 10 мл буфера 125 мМ NaCl, 20 мМ MgCl₂, 4 мМ Трис-HCl, (рН 8,0), добавляли 5 мкг РНК-азы I (2- 3 ед. акт.) и инкубировали 2 ч при 37 ⁰С. Затем добавляли 10 мл того же буфера, выдерживали 10- 12 ч при 4⁰С. Водную фракцию отделяли центрифугированием (1500 g, 20 мин), осадок ПМ обрабатывали 50% этанолом (5 x 7 мл) при 4 ⁰С с последующим отделением растворителя. Процедуру повторяли трижды до получения бесцветных промывных вод. Содержание белка определяли спектрофотометрически по соотношению D₂₈₀/D₅₆₈(e ₂₈₀ 1,1 x 10⁵ и e ₅₆₈ 6,3 x 10⁴ M^-1 см^-1. Выход фракции ПМ 120 мг (х. ч. 80-85%).

Получение апомембран (АП). Суспензию ПМ (50 мг) в 50 мл 1 М NH₂OH (pН 6,0) выдерживали 10 ч при перемешивании на ледяной бпне (4 ⁰С) при освещении реакционной смеси ксеноновой лампой. Осадок отделяли центрифугированием (1000 g, 10 мин), дважды промывали дист. Н₂О и центрифугировали. Фракцию АП суспендировали в 2 мл 5 мМ 2-(N-морфолино)-этансульфониламида в 100 мМ NaCl. Регенерация ПМ. К 2 мл суспензии АП (2 10^-5 М) в кварцевой кювете добавляли при перемешивании 0,1 мл 2 мМ раствора полностью 13-транс-ретиналя в метаноле и выдерживали 6-8 ч в темноте при 40 ⁰С. Степень регенерации ПМ определяли по соотношению D_нат.280 D_нат.568/ D_рег.280 D_рег.568, где D₂₈₀ и D₅₆₈ - поглощение суспензии нативных и регенерированных ПМ при л = 280 и л = 568 нм.

Выделение БР проводили по методу Остерхельта и Гесса, модифицированного авторами, солюбилизируя фракцию ПМ (в Н₂О) (1 мг/мл) в 1 мл 0,5% SDS-Na, смесь инкубировали 5- 7 ч при 37 ⁰С с последующим центрифугированием (1200 g, 15 мин). Осадок отделяли, к супернатанту добавляли дробными порциями метанол (3 x 100 мкл) при 0 ⁰С, выдерживали 14- 15 ч при 4 ⁰С и центрифугировали при охлаждении (1200 g, 15 мин). Фракционирование проводили трижды, уменьшая концентрацию 0,5% SDS-Na до 0,2 и 0,1%. Выделенный кристаллический белок (8- 10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 x 1 мл) и центрифугировали (1200 g, 15 мин).

Очистка БР. Пробу белка (5 мг) растворяли в 100 мкл буферного раствора и помещали на колонку, размерами 150 x 10 мм; неподвижная фаза - Сефадекс G-200 (Pharmaсia, США) (удельный объем упакованных гранул - 30- 40 ед на 1 г сух. сефадекса), уравновешенную буферным раствором, содержащим 0,1% SDS-Na и 2,5 мМ ЭТДА. Элюирование проводили 0,09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0,5 М NaCl с pH 8,35 (I = 0.075) со скоростью 10 мл/см² x ч. Объединенные белковые фракции подвергали лиофильной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 x 50 мм) и хранили в темноте при -4 ⁰С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Технология получения бактериородопсина заключается в выращивании галобактерий на жидких синтетических средах, содержащие аминокислоты или на природных средах с пептонами или белково-витаминными концентратами (БВК) дрожжей, с последующим выделением бактериородопсина из мембран клеток. Для биосинтеза бактериородопсина использовался пигментированный штамм фотоорганогетеротрофных галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001, модифицированный селекцией. Для биосинтеза бактериородопсина применяли жидкую синтетическую среду, содержащую 18 аминокислот (количества компонентов приведены в г/л): (D,L-аланин - 0,43; L-аргинин - 0,4; D,L-аспарагиновая кислота - 0,45; L-цистеин - 0,05; L-глутаминовая кислота - 1,3; L-глицин - 0,06; D,L-гистидин - 0,3; DL-изолейцин - 0,44; L-лейцин - 0,8; L-лизин - 0,85; D,L-метионин - 0,37; D,L-фенилаланин - 0,26; L-пролин - 0,05; D,L-серин - 0,61; D,L-треонин - 0,5; L-тирозин - 0,2; D,L-триптофан - 0,5; D,L-валин - 1,0); нуклеотиды (аденозин-5-монофосфат - 0,1; уридин-5 монофосфат - 0,1); соли (NaCl - 250; MgSO₄ 7H₂O - 20; KСl - 2; NH₄Cl - 0.5; KNO₃ - 0,1; KH₂PO₄ - 0,05; K₂HPO₄ - 0,05; Na⁺-цитрат натрия - 0,5; MnSO₄ 2H₂O - 3 x 10^-4; CaCl₂ 6H₂O - 0,065; ZnSO₄ 7H₂O - 4 x10^-5; FeSO₄ 7H₂O - 5 x 10^-4; CuSO₄ 5H₂O - 5 x 10^-5); глицерин - 1,0; витамины (биотин - 1 x 10^-4; фолиевая кислота - 1,5 x 10^-4; витамин В₁₂ - 2 x 10^-5). Выращивание бактерий проводили в колбах Эрленмейера, вместимостью 500 мл (объем реакционной смеси 100 мл) 3- 4 сут при 35-37 ⁰С в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad 380-S (Венгрия) и освещении монохромными лампами ЛДС-40 (3 x 1,5 лк). Бактериальный рост изучали по оптической плотности бактериальной суспензии, измеренной при л 540 нм на спектрофотометре Beckman DU-6 (США). Процедура выделение бактериородопсина из пурпурных мембран галобактерий производилось с использованием светозащитной лампы, снабженной оранжевым светофильтром ОРЖ -1X.

В оптимальных условиях выращивания галобактерий, указанных на рис. 5, а- б, в клетке синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D₂₈₀/D₅₆₈ = 1,5 : 1 полностью идентичный природному БР. Как показали результаты исследования, рост галобактерий H. halobium на синтетической среде (рис. 5, б) ингибировался незначительно по сравнению с контролем (рис. 5, а) на пептоновой среде, что существенно упрощает оптимизацию условий биосинтеза БР, заключающемся в культивировании галобактерий в синтетической среде при освещении монохромным светом с л 560 нм в течение 4-5 сут при 35 ⁰С.

Рис. 5. Динамика роста галобактерии Halobacterium halobium в различных экспериментальных условиях: пептоновая среда (а), синтетическая среда (б). Условия культивирования: период инкубации 4-5 сут, 35 ⁰С, освещение монохромным светом при л 560 нм.

Выбор последующего способа выделения бактериородопсина определялся целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения препаратов бактериородопсина мембран галофильных бактерий H. halobium в микропрепаративных количествах. Основными этапами получения бактериородопсина являлись выращивание галобактерий H. halobium на синтетической среде, выделение фракции пурпурных мембран (ПМ), очистка от низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов, растворение белка в 0,5% растворе ДДС-Na и осаждение метанолом, гель-проникающая хроматография на сефадексе G-200, электрофорез в 12,5% ПААГ с 0,1% ДДС-Na. Поскольку белок локализуется в ПМ, освобождение от низкомолекулярных примесей и внутриклеточного содержимого достигали осмотическим шоком клеток дистиллированной водой на холоду после удаления 4,3 М NaCl и последующим разрушением клеточной оболочки ультразвуком при 22 кГц. Последующую обработку клеточного гомогената РНК-азой I (2-3 ед. акт.) проводили для разрушения клеточной РНК. Так как фракция ПМ наряду с искомым белком в комплексе с липидами и полисахаридами содержала примесь связанных каротиноидов и посторонних белков, применялись специальные методы фракционирования белка без повреждения его нативной структуры и диссоциации, что существенно усложняло задачу выделения индивидуального бактериородопсина с применением методов декаротинизации и делипидизации, а также очистки и колоночной хроматографии. Декаротинизация, заключающаяся в многократной обработке ПМ 50% этанолом при 4 ⁰С, являлась рутинным, но обязательным этапом, несмотря на значительные потери хромопротеина. Использовалось не менее пяти обработок 50% этанолом, чтобы получить спектр поглощения суспензии очищенных от каротиноидов (4) и (5) ПМ (степень хроматографической чистоты 80-85%), показанного на рис. 6 на различных стадиях обработки (б) и (в) относительно природного бактериородопсина (а). Образование ретинальпротеинового комплекса в молекуле бактериородопсина приводит к батохромному сдвигу в спектре поглощения ПМ (рис. 6, в) - основная полоса (1) при максимуме поглощения l 568 нм, вызванная световой изомеризацией хромофора по С13=С14-кратной связи определяется наличием 13-транс-ретинального остатка ретиналя БР₅₆₈, дополнительная малоинтенсивная полоса (2) при l 412 нм характеризует незначительную примесь образующейся на свету спектральной формы M₄₁₂ c депротонированной альдиминной связью между остатком 13-транс-ретиналя и белком, а полоса (3) при l 280 нм определяется поглощением ароматических аминокислот в полипептидной цепи белка (для чистого бактериородопсина соотношение D₂₈₀/D₅₆₈ равно 1,5 : 1).

Рис. 6. Спектры поглощения ПМ (в 50%-ном этаноле) на различных стадиях обработки: нативный БР (а); ПМ после промежуточной обработки (б); очищенные от посторонних каротиноидов ПМ (в). Полоса (1) соответствует спектральной форме БР₅₆₈, (2) - примесь спектральной формы М₄₁₂, (3) - полоса поглощения ароматических аминокислот, (4) и (5) - посторонние каротиноиды.

В качестве контроля использовали природный бактериородопсин.

Фракционирование и тщательная хроматографическая очистка белка являлись следующим необходимым этапом. Поскольку бактериородопсин, будучи трансмембранным белком (М_r 26,7 кД), пронизывает билипидный слой в виде семи a -спиралей, применение сульфата аммония и других традиционных высаливающих агентов не дает положительного результата. Решение проблемы заключалось в переводе белка в растворимую форму солюбилизацией в 0,5% ДДС-Na с последующим осаждением метанолом. Использование ионного детергента ДДС-Na диктовалось необходимостью максимальной солюбилизации белка с комбинированием стадии делипидизации и осаждения в нативном виде, поскольку солюбилизированный в слабоконцентрированном растворе 0,5% ДДС-Na бактериородопсин сохраняет спиральную a -конфигурацию [10]. Поэтому отпала необходимость использования органических растворителей ацетона, метанола и хлороформа для очистки от липидов, а делипидизация и осаждение белка совмещались в одну единственную стадию, существенно упрощающую фракционирование. Значительным преимуществом метода является, что целевой белок в комплексе с молекулами липидов и детергента распределяется в надосадочной жидкости, а другие высокомолекулярные примеси - в непрореагировавшем осадке, легко отделяемом центрифугированием. Фракционирование солюбилизованного в 0,5% ДДС-Na белка с его последующим выделением в кристаллическом виде проводилось в три стадии дробным низкотемпературным (4 ⁰С) осаждением метанолом, уменьшая концентрацию детергента 0,5% ДДС-Na до 0,2 и 0,1% соответственно. Кристаллический белок (8-10 мг) промывали холодной дистиллированной водой (2 x 1 мл) и центрифугировали (1200 g, 15 мин).

Окончательная стадия очистки бактериородопсина заключалась в отделении белка от низкомолекулярных примесей методом гель-проникающей хроматографии, для чего бактериродопсин-содержащие фракции дважды пропускали через колонку (150 x 10 мм) с декстрановым сефадексом G-200 (Pharmaсia, США) (удельный объем гранул - 30-40 ед на 1 г сух. сефадекса). Колонку уравновешивали буферным раствором, содержащим 0,1% ДДС-Na и 2,5 мМ ЭТДА. Пробу белка растворяли в 100 мкл буферного раствора и элюировали 0,09 М Трис-боратным буфером, содержащим 0,5 М NaCl с pH 8,35 (I = 0.075) со скоростью 10 мл/см² x ч. Объединенные белковые фракции подвергали лиофильной сушке, запаивали в стеклянные ампулы (10 x 50 мм) и хранили в темноте при -4 ⁰С.

Электрофорез бактериородопсина проводили в 12,5% ПААГ с 0.1% ДДС-Na в соответствие с протоколом фирмы LKB (Швеция). Количественное определение содержания белка выполняли сканированием прокрашенного в растворе кумасси-голубой R-250 электрофоретического геля на лазерном денситометре Beckman CDS-200 (США).

Согласно разработанному методу получено 8-10 мг чистого бактериородопсина из 1 г бактериальной биомассы, гомогенность которого подтверждалась электрофорезом в 12,5% ПААГ с 0,1% ДДС-Na cпоследующей регенерацией апомембран с 13-транс-ретиналем. Для обеспечения более высоких выходов белка необходимо наработать большее количество сырьевой биомассы.

Настоящая работа осуществлялась при поддержке Научно-исследовательского центра медицинской биофизики (Болгария). Грант № 012.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод биосинтеза бактериородопсина свидетельствует о достаточно высоких выходах синтезируемого продукта, который сможет найти применение в нано-биотехнологии. Главным достоинством метода является то, что выделенный бактериородопсин сохраняет природную конфигурацию и способность к фотохимическим превращениям in vitro. Метод также применим к получению других аналогичных бактериородопсину трансмембранных белков галофильных бактерий - сенсородопсина и галородопсина. Уникальные свойства этих природных бактериородопсинов обеспечивают широкий диапазон технических приложений, в которых они могут найти применение, однако коммерчески осуществимыми пока являются оптические, поскольку интеграция этих белков в современные технические системы наиболее проста. В дальнейшем планируется получать полностью дейтерированные препараты бактериородопсина для реконструкции функционально активных систем трансмембранных белков в тяжелой воде с очищенными дейтерированными жирными кислотами и другими природными соединениями. Эти исследования позволят дать ответ на вопрос как функционирует молекула бактериородопсина в составе нативных мембран в условиях, близким к адаптации клетки к тяжёлой воде.

ЛИТЕРАТУРА

1. Oesterhelt D., Stoeckenius W. “Rhodopsin - like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium”, Nature, 233(89), 149-160 (1971).

2. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. “Получение бактериородопсина H. halobium, меченного дейтерием по остаткам ароматическим аминокислот фенилаланина, тирозина и триптофана”, Биотехнология, 10, 24-40 (1996).

3. Grigorieff N. “Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin”, Journal of Molecular Biology, 259, 393-421 (1996).

4. Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin as an Example of a Light-Driven Proton Pump, Angew. Chemie, Intern. / Ed. Engl. (1976), p. 16-24.

5. Haupts U., Tittor J., Bamberg E., Oesterhelt D. “General Concept for Ion Translocation by Halobacterial Retinal Proteins: The Isomerization/Switch/Transfer Model”, Biochemistry, 36(2-7), 78-85 (1997).

6. Lanyi J. K. “Understanding structure and function in the light-driven proton pump bacteriorhodopsin”, Journal of Structural Biology, 124, 164-178 (1998).

7. Hampp N., Oesterhelt D. Bacteriorhodopsin and its Potential in Technical Applications. In: Nanobiotechnology (Ch. Niemeyer and C. Mirkin, eds.), Wiley-VCH-Verlag, Weinheim (2004), p. 146-167.

8. Мосин O.В., Складнев Д.А., Швец В.И. “Включение дейтерированных ароматических аминокислот в молекулу бактериородопсина Halobacterium halobium“, Прикладная биохимия и микробиология, 35(1), 34-42 (1999).

9. Vought B.W., Birge R.R. (eds.) Molecular electronics and hybrid computers / in: Wiley Encyclopedia of Electrical and Electronics Engineering, Wiley-Interscience: New York (1999), p. 477-490.

10. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin / in: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. Leiden, the Netherlands (1994), p. 115.

Размещено на Allbest.ru