Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздравсоцразвития России

Кафедра факультетской терапии

РЕФЕРАТ

Тема: Лабораторная диагностика нарушений гемостаза

Выполнила: Овсянникова К.А.

Проверил: Дегтярев В. А.

Челябинск 2016



Оглавление

Введение

1. Методы исследования системы гемостаза

2. Тесты для оценки сосудисто-тромбоцитарного компонента гемостаза

2.1 Время кровотечения

2.2 Количество тромбоцитов в крови

2.3 Индуцированная агрегация тромбоцитов

3. Скрининговые тесты для оценки плазменного звена гемостаза

3.1 Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ)

3.2 Протромбиновое время

3.3 Тромбиновое время

3.4 Концентрация фибриногена в плазме

4. Методы определения физиологических антикоагулянтов

4.1 Протеин С

4.2 Протеин S

4.3 Антитромбин III

5. Тесты для исследования фибринолитической системы

5.1 Время лизиса эуглобулиновых сгустков / ХIIа зависимый фибринолиз

5.2 Плазминоген и тканевой активатор плазминогена (ТАП)

6. Тесты активации свертывания крови

6.1 D-димеры

6.2 Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК)

Список используемой литературы



Введение

Система гемостаза - совокупность функционально-морфологических и биохимических механизмов, обеспечивающих сохранение жидкого состояния крови, предупреждение и остановку кровотечений, а также целости кровеносных сосудов.

В целостном организме при отсутствии патологических воздействий жидкое состояние крови является следствием равновесия факторов, обусловливающих процессы свертывания и препятствующих их развитию. Нарушение подобного баланса может быть вызвано очень многими факторами, однако вне зависимости от этиологических причин тромбообразование в организме происходит по единым законам с включением в процесс определенных клеточных элементов, энзимов и субстратов.

В свертывании крови различают два звена:

1. клеточный (сосудисто-тромбоцитарный) и

2. плазменный (коагуляционный) гемостаз.

Под клеточным гемостазом понимают адгезию клеток (т.е. взаимодействие клеток с чужеродной поверхностью, в том числе и с клетками иного вида), агрегацию (склеивание одноименных клеток крови между собой), а также высвобождение из форменных элементов веществ, активирующих плазменный гемостаз.

Плазменный (коагуляционный) гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых участвуют факторы свертывания крови, завершающийся процессом фибринообразования.

Образовавшийся фибрин подвергается далее разрушению под влиянием плазмина (фибринолиз).

Важно отметить, что деление гемостатических реакций на клеточные и плазменные является условным, однако оно справедливо в системе invitro и существенно облегчает выбор адекватных методик и интерпретацию результатов лабораторной диагностики патологии гемостаза. В организме эти два звена свертывающей системы крови тесно связаны и не могут функционировать раздельно.



1. Методы исследования системы гемостаза

· Клинико-функциональные пробы при исследовании сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза (в условиях нашей лаборатории не проводятся):

o определение ломкости микрососудов с помощью пробы манжеточной компрессии (проба Кончаловского-Румпель-Лееде); определение времени кровотечения из микрососудов без дополнительной компрессии (проба Дьюка с проколом уха и др.), либо на фоне венозного стаза (сдавление плеча манжетой до 40 мм.рт.ст. с проколами или надрезами кожи предплечья) - пробы Айви и Борхгревинка и др.

· Лабораторные методы:

o измерение числа и функции тромбоцитов (адгезия, агрегация) путем микроскопии или с использованием гематологических анализаторов (при скрининговых исследованиях) и агрегометров;

o функциональные коагуляционные, или так называемые клоттинговые (по оценке времени свертывания мануально или с использованием коагулометров разных конструкций);

o определение параметров фибринолиза;

o амидолитические (тесты с использованием хромогенных субстратов к тромбину, плазмину, фактору Xа, XIIIа и др., и фотометров с фиксированной длиной волны измерений);

o иммунологические методы, позволяющие выявить уровень искомого антигена или антител при АФС и др.

o выявление генетических аномалий методом ПЦР (мутации Лейден-резистентности фактора Vа к активированному протеину С, гена протромбина G 20210, гена метилентетрагидрофолатредуктазы и др.).

Для улучшения качества исследования системы гемостаза важно придерживаться следующих принципов. При обследовании больных необходимо выделять два последовательных этапа диагностики: первичного скрининга с использованием скрининговых тестов и - на втором этапе - проб, позволяющих уточнить диагноз. Для подтверждения диагноза в случае выявления серьезных нарушений в системе гемостаза (снижение уровня фактора Виллебранда, факторов свертывания, тромбоцитопении, дефицита или аномалии действия физиологических антикоагулянтов, наличия волчаночного антикоагулянта, выраженной тромбинемии и др.) необходимо повторное обследование. Интерпретация показателей коагулограммы должна проводиться с учетом возможного влияния принимаемых лекарственных средств и других воздействий. Например, учитывать особенности питания при контроле за лечением антикоагулянтами непрямого действия (АНД). Целесообразно отказаться от дублирующих или малоценных, а также устаревших и неточных методов исследования. Использование производительных и высокоточных (по сравнению с мануальными определениями) коагулометров и агрегометров, а также стандартизированных расходных материалов, является предпочтительным.

В данной работе приведены референсные значения, которые приняты в нашей лаборатории. Референсные величины могут варьировать при смене лота или производителя набора, актуальные референсные значения указываются в бланке результата анализа.



2. Тесты для оценки сосудисто-тромбоцитарного компонента гемостаза

При тромбоцитопениях, тяжелых тромбоцитопатиях и при дефиците фактора Виллебранда (ФВ) значительно удлиняется время кровотечения. Кровоточивость связана с недостаточностью адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов - нарушением образования в поврежденных сосудах тромбоцитарной пробки. Это может быть обусловлено либо значительным снижением количества тромбоцитов в крови, либо их дисфункцией, в основе которой чаще всего лежит отсутствие или блокада на мембране тромбоцитов рецепторов, взаимодействующих со стимуляторами (агонистами) агрегации этих клеток (ФВ, адреналином, АДФ, фибриногеном, арахидоновой кислотой и простагландинами), либо отсутствием в тромбоцитах или нарушением выхода из них компонентов гранул, содержащих эти стимуляторы агрегации.

Качественные дефекты тромбоцитов, лежащие в основе большого числа геморрагических диатезов, подразделяют на следующие группы:

· дезагрегационные тромбоцитопатии, обусловленные отсутствием или блокадой мембранных рецепторов этих клеток (тромбастения Гланцмана и др.);

· болезни отсутствия плотных и ?-гранул;

· нарушения высвобождения гранул;

· нарушения образования циклических простагландинов и тромбоксана А2;

· дефицит, аномалии и нарушения мультимерности ФВ;

· нарушения обмена нуклеотидов и транспорта кальция.

2.1 Время кровотечения

Время кровотечения - это время от момента нанесения стандартной раны кожи до момента прекращения вытекания крови. Оно характеризует функциональную активность тромбоцитов и взаимодействие тромбоцитов с сосудистой стенкой. Время кровотечения не выявляет всех тромбоцитарных нарушений (такого метода вообще не существует), этот скрининговый тест позволяет заподозрить тромбоцитопатии различного генеза, болезнь Виллебранда и нарушения проагрегантных свойств сосудистой стенки. После выявления патологии нет необходимости повторять это исследование, нужно использовать более чувствительные и специфические методы. У этого метода есть серьезные недостатки:

o Метод плохо стандартизируется. Результаты теста позволяют лишь предположить наличие тех или иных нарушений.

o Низкая чувствительность. Отсутствие удлинения времени кровотечения не всегда позволяет исключить нарушения тромбоцитарного или сосудистого звеньев гемостаза.

o Низкая специфичность не позволяет однозначно интерпретировать результаты метода.

o Не соответствует современным санитарно-эпидемиологическим требованиям.

2.2 Количество тромбоцитов в крови

Референсные значения: 170-350x109/л

Снижение числа тромбоцитов (<170?109/л):

· острый ДВС-синдром;

· острый лейкоз и миелодиспластические синдромы;

· гипо- и апластические анемии;

· нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина;

· химиотерапия и лучевая терапия;

· тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитико-уремический синдром;

· спленомегалия и гепатолиенальный синдром;

· гепарин-индуцированная тромбоцитопения;

· эклампсия и преэклампсия;

· экстракорпоральное кровообращение;

· гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью, гемосорбция;

· интенсивная трансфузионная терапия;

· пароксизмальная ночная гемоглобинурия;

· иммунные формы патологии (СКВ и др. коллагенозы, АФС, иммунная тромбоцитопеническая пурпура);

· дефекты при получении крови для исследования - псевдотромбоцитопения в случае использования ЭДТА в качестве стабилизатора крови.

Повышение числа тромбоцитов (>350?109/л):

· мегакариоцитарные и миелолейкозы, эритремия;

· вторичный, реактивный тромбоцитоз в случае спленэктомии (через 1-3 недели), внутриполостные кровоизлияния после оперативных вмешательств, спустя 7-10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома, после перенесенного острого кровотечения, при злокачественных новообразованиях (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы) и других причинах хронического ДВС-синдома.

2.3 Индуцированная агрегация тромбоцитов

При исследовании функций тромбоцитов индуктор агрегации добавляется к плазме, обогащенной тромбоцитами. Для исследования индуцированной агрегации тромбоцитов используют физиологические индукторы, такие как тромбин, адреналин, АДФ, коллаген. Кроме того, существуют специальные индукторы, такие как ристоцетин (ристомицин). Этот индуктор инициирует связывание фактора Виллебранда с мембранным рецептором Ib-IX тромбоцитов и таким образом вызывает их агрегацию. Для диагностики большинства наследственных и приобретенных тромбоцитопатий достаточно исследования функциональных параметров тромбоцитов с использованием четырех агонистов. Ими являются индукторы АДФ, адреналин, коллаген и ристомицин. Исследование агрегации на стекле менее чувствительно, чем с использованием агрегометра, однако быстро выполняется и используется при скрининге для отбора пациентов с грубыми нарушениями тромбоцитарного гемостаза (выраженной тромбоцитопенией или тромбоцитопатией) в группу риска для профилактики, например, интра- и послеоперационных кровотечений.

Методы определения агрегации тромбоцитов:

· с АДФ

· с адреналином

· с коллагеном

· с арахидоновой кислотой

· с тромбином

· с ристомицином (ристоцетином)

Большие преимущества имеет графическая регистрация процесса на агрегометре, однако выполнение исследований требует большого количества плазмы и затрат времени. Агрегометры подразделяются на оптические (турбодиметрические), регистрирующие агрегацию в богатой тромбоцитами плазме по изменению её оптической плотности, и кондуктометрические, определяющие агрегацию в цельной крови по изменению электропроводности. Результаты этих исследований позволяют диагностировать тромбоцитопатии, нозологическая принадлежность которых обусловлена характерным нарушением тех или иных функциональных свойств тромбоцитов или их сочетанием (см. таб. 1).



Таблица 1. Изменение агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитов

Состояние	АДФ	Адреналин	Арахидоновая кислота	Тромбин	Коллаген	Ристомицин
Референсные значения:	8-12 с	15-20 с			15-20 с
Болезнь Виллебранда	Н	Н	Н	Н	Н	v
Синдром Бернара-Сулье	H	H	H	H/v	H	v
Тромбастения Гланцмана	v	v	v	v	v	+/-
Передозировка аспирина	v	v	v	+/-	v	+/-
Синдром серых тромбоцитов	v	v	H/v	+/-	v	+/-

H - нормальная агрегатограмма, v - сниженная реакция на индуктор агрегации

Повышение агрегационной активности тромбоцитов характерно для претромботических состояний, идиопатического тромбоцитоза, тромбозов, инфарктов органов, атеросклероза, васкулитах, при беременности.

Снижение агрегации наблюдается при первичных и симптоматических тромбоцитопатиях, при лечении антиагрегантами. Антиагреганты отличаются по механизму действия. Одни антиагреганты (аспирин, нестероидные противовоспалительные средства) блокируют образование в тромбоцитах простагландиновых стимуляторов агрегации, в частности тромбоксана А2, другие ингибируют АДФ-рецепторы (клопидогрель), третьи нарушают транспорт ионов кальция в тромбоциты либо стимулируют образование циклического аденозинмонофосфата. Классификация современных антиагрегантов приведена в таблице 2



Таблица 2. Ингибиторы сосудисто-тромбоцитарного гемостаза

Группы препаратов в соответствии с механизмом действия	Лекарственные препараты
Ингибиторы циклооксигеназы (СОХ-1). Основной механизм: блокада образования циклических простагландинов	Аспирин (кардиомагнил, тромбоас), другие нестероидные противовоспалительные средства (индометацин и др.)
Ингибиторы тромбоксансинтетазы	Сулотробан и др.
Ингибиторы тромбоксансинтетазы и тромбоксановых рецепторов	Пикотамид, ридогрель и др.
Блокаторы тромбиновых рецепторов тромбоцитов	Ванипрост, дальтробан.
Блокаторы АДФ-рецепторов тромбоцитов	Тиенопиридины: тиклопидин (тиклид), клопидогрель (плавикс).
Антагонисты рецепторов IIb/IIIa тромбоцитов	Антительные: абсиксимаб (Reo Pro). Пептидные: интегрилин и др. Непептидные: тирофибан, ламофибан. Оральные антагонисты рецепторов: имлофибан, фрадафибан.
Стабильные производные простациклина	Инъекционные формы: илопрост, вазопростан. Оральные формы: берапрост.
Препараты комплексного действия и вазопротекторы	Пентоксифиллин (трентал), сульфин-пиразоны, дипиридамол (курантил), эндотелон, миртравен.



3. Скрининговые тесты для оценки плазменного звена гемостаза

Лабораторная диагностика нарушений системы гемостаза является одной из самых дорогостоящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нарушений для всех пациентов - практически нереальная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблюдать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента. На первом этапе для уточнения направленности нарушений необходимо провести тесты, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза. Поскольку в разных лабораториях при анализе гемостаза преследуются разные цели, перечень тестов, входящих в гемостатический скрининг для данной лаборатории, может отличаться от такового в других лабораториях. Однако существует набор рекомендуемых тестов, традиционно называемых скрининговыми для диагностики состояния системы гемостаза.

Скрининговые тесты:

· АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время

· протромбиновое время (по Квику)

· тромбиновое время и/или фибриноген

Скрининговые тесты на состояние внутреннего и внешнего каскада активации протромбиназы позволяют выявлять нарушения со стороны факторов-субстратов, кофакторов, ингибиторов каскада свертывания, а также действие некоторых лекарственных препаратов или аутоантител. Основным тестом на состояние внутреннего каскада свертывания плазмы является АПТВ, на состояние внешнего каскада - протромбиновое время.



3.1 Активированное парциальное (частичное) тромбопластиновое время (АПТВ)

АПТВ используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, скрининговой диагностики волчаночного антикоагулянта и слежения за антикоагулянтным действием гепаринов. АПТВ - более значимый тест для первичного выявления патологии, чем протромбиновое время, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно) и наличие волчаночного антикоагулянта. Референсные значения АПТВ: 28,6-33,6 с

Укорочение АПТВ:

· активация внутреннего механизма свертывания при тромбозах, тромбоэмболиях. Это может быть связано с резистентностью фактора V к активированному протеину С, повышенным уровнем фактора VIII или активированных факторов свертывания;

· при ДВС-синдроме (гиперкаогуляционная фаза);

· возможно при нормально протекающей беременности.

Удлиннение АПТВ:

· дефицит факторов внутреннего пути свертывания (VIII - гемофилия А, IX - гемофилия В, XI, XII) при нормальных результатах протромбинового теста;

· дефицит факторов II, V, X в случае сопутствующей гипокоагуляции в протромбиновом тесте;

· дефицит фактора Виллебранда;

· гепаринотерапия обычным, нефракционированным гепарином (НГ) (тест выявляет сравнительно низкие концентрации антикоагулянта, приблизительно от 0,05 МЕ/мл крови);

· лечение антикоагулянтами непрямого действия (АНД);

· ДВС-синдром (потребление факторов свертывания в фазу гипокоагуляции);

· на фоне переливаний реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам, НЕS);

· наличие волчаночного антикоагулянта;

· мутация фактора IX;

· дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера).

3.2 Протромбиновое время

Протромбиновое время (ПВ) - широко используемый скрининговый тест для оценки внешнего каскада свертывания плазмы. ПВ обычно используется для определения активности ф. VII, контроля за лечением непрямыми антикоагулянтами, при скрининге системы гемостаза, а также для количественного определения фибриногена в автоматических коагулометрах. Результаты определения протромбинового времени могут быть представлены в различной форме (табл.3).

Референсные значения ПВ: 9,2-12,2 с

Укорочение ПВ:

· активация внешнего механизма свертывания при различных видах внутрисосудистого свертывания крови;

· последние недели беременности, прием пероральных контрацептивов;

· лечение концентратами факторов протромбинового комплекса («Фейба», «НовоСевен» и др.).

Удлинение ПВ:

· дефицит или аномалия факторов протромбинового комплекса (VII, X, V,II) в случаях приема антикоагулянтов непрямого действия (варфарин, синкумар, пелентан и др.);

· болезни печени и желчевыводящей системы;

· лечение нефракционированным гепарином (тест реагирует лишь на сравнительно высокие концентрации антикоагулянта, примерно от 0,5 МЕ/мл крови и выше);

· ДВС-синдром (потребление факторов свертывания в переходную фазу и фазу гипокоагуляции);

· на фоне переливаний реополиглюкина, препаратов гидроксиэтилкрахмала (инфукол, валекам, НЕS);

· наличие в крови волчаночного антикоагулянта (возможно);

· дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катете

Таблица 3. Формы выражения протромбинового времени

Показатель	Расчёт	Примечание	Корреляция
Протромбиновое время (ПВ), сек	Время свёртывания плазмы после добавления тромбопластин-кальциевой смеси.	Не позволяет проводить сравнительную оценку результатов в связи с применением тромбопластинов различного МИЧ (cм. МНО)
Протромбиновый индекс (ПТИ), %	ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона)/ПВ плазмы пациента)х100	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Отрицательная - с протромбиновым отношением и МНО
Протромбиновое отношение (ПО), %	ПВ плазмы пациента/ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона)х100	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Положительная - с МНО, отрицательная - с протромбиновым индексом
Протромбин по Квику (%)	Аналогично ПТИ, но расчёт производится в зависимости от концентрации факторов протромбинового комплекса	Результаты теста зависят от чувствительности используемого тромбопластина.	Отрицательная - с ПО и МНО, совпадает с ПТИ в области нормальных значений
Протромбиновое время, выраженное через МНО - международное нормализованное отношение, латинская аббревиатура INR (International Normalized Ratio) (см. дальше по тексту).	(ПВ плазмы пациента/ПВ нормальной контрольной плазмы (или среднее ПВ нормального диапазона)isi	ISI (МИЧ) - (international sensitivity index - международный индекс чувствительности) - показатель чувствительности тромбопластина относительно международного стандарта (указывается в паспорте набора), что позволяет сравнивать между собой результаты, полученные с применением тромбопластина различной чувствительности.

Первые три выражения, хотя и представляются в виде цифр, но из-за отсутствия калибровки являются, по сути, качественными показателями с неопределенным масштабом. Кроме того, существенным недостатком определения протромбинового времени в секундах является низкая воспроизводимость из-за нестандартизированного тромбопластина. Поэтому нельзя сопоставлять результаты у одного пациента, полученные в разных лабораториях, на разных приборах или с тест - наборами разных серий. Выражение ПТИ в процентах не имеет смысловой нагрузки и путает врачей, так как между количеством факторов и измерением ПВ в секундах нет прямой пропорциональной зависимости.

Протромбин по Квику и протромбиновое время, выраженное через МНО для ПВ являются взаимодополняющими.

Протромбин по Квику (%) как и протромбиновый индекс, позволяет определять активность протромбинового комплекса плазмы пациента в сравнении с измеренным протромбиновым временем контрольной плазмы. Но при этом расчет проводится по кривой зависимости протромбинового времени от % содержания факторов протромбинового комплекса, построенной с использованием разных разведений контрольной плазмы. Такой способ представления результатов является более точным, особенно в области низких значений. Протромбиновый индекс и протромбин по Квику могут совпадать друг с другом в области нормальных значений. В зоне низких значений, рекомендованных для ведения больных, принимающих непрямые антикоагулянты, показатели этих тестов расходятся. Протромбиновый индекс 50-60% может соответствовать 30-40% протромбина по Квику. Расчет протромбина по Квику в настоящее время является общепринятым способом.

МНО (Международное нормализованное отношение), латинская аббревиатура INR (International Normalized Ratio) - дополнительный способ представления результатов протромбинового теста, рекомендованный для контроля терапии непрямыми антикоагулянтами комитетом экспертов ВОЗ, Международным комитетом по изучению тромбозов и гемостаза и Международным комитетом по стандартизации в гематологии. МНО рассчитывается по формуле:

где ISI (International Sensitivity Index of thromboplastin), он же МИЧ (международный индекс чувствительности) - показатель чувствительности тромбопластина, стандартизующий его относительно международного стандарта. МНО - математическая коррекция, при помощи которой производится стандартизация протромбинового времени, что позволяет сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях. МНО и протромбин по Квику коррелируют отрицательно - снижение протромбина по Квику соответствует повышению МНО.

Для контроля уровня антикоагулянтов ВОЗ разработаны следующие рекомендации:



Таблица

Клиническое состояние	Рекомендуемое МНО
Профилактика первичного и повторного тромбоза глубоких вен и легочной тромбоэмболии	2,5 (2,0-3,0)
Предоперационная подготовка: хирургические вмешательства в области бедра	2,0 (2,0-3,0)
Все остальные хирургические вмешательства	2,5 (1,5-2,5)
Лечение тромбоза глубоких вен, легочной тромбоэмболии и профилактика повторного венозного тромбоза.	3,0 (2,0-4,0)
Профилактика артериальной тромбоэмболии, включая пациентов с искусственными клапанами	3,5 (3,0-4,5)

Рекомендуемые уровни гипокоагуляции при приеме варфарина:

· высокий МНО от 2,5 до 3,0;

· средний МНО от 2,0 до 3,0;

· низкий МНО от 1,6 до 2,0.

3.3 Тромбиновое время

Тромбиновое время (ТВ) - определение тромбинового времени является третьим по значимости базисным скрининговым тестом. Тест характеризует конечный этап процесса свертывания - превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина, на него влияет концентрация фибриногена в плазме и наличие продуктов деградации фибрина. Референсные значения ТВ: 18-24 с Укорочение ТВ:

· гиперфибриногенемия (фибриноген 6,0 г/л и выше);

· начальная (гиперкоагуляционная) фаза острого и подострого ДВС-синдрома.

Удлинение ТВ:

· гепаринотерапия обычным гепарином (тест реагирует на сравнительно низкие концентрации антикоагулянта, приблизительно от 0,05 МЕ/мл крови)

· гипофибриногенемия (фибриноген ниже 1,0 г/л) в случаях развития острого ДВС-синдрома и при тромболитической терапии (стрептокиназа, актилизе и др.). В последнем случае конечный этап свертывания крови ингибируется продуктами деградации фибриногена и фибрина (фрагментами D и D-димеров)

· влияние других ингибиторов полимеризации фибрин-мономера (парапротеины, миеломные белки и др.)

· дефекты при получении крови для исследования (гемолиз, передозировка цитрата натрия, забор крови из гепаринизированного катетера)

3.4 Концентрация фибриногена в плазме

гемостаз тромбоцит плазма антикоагулянт

Количественное определение фибриногена по методу Клаусса является базисным тестом исследования гемостаза. Образование фибрина и его стабилизация представляют собой финальный этап формирования тромба, при котором растворимый фибриноген превращается в нерастворимый фибрин под действием тромбина и фактора XIII.

Фибриноген - острофазный белок. Печень синтезирует 2-5 г фибриногена в день, время полувыведения фибриногена из крови составляет около 4 дней. Концентрация его может превышать 10 г/л при тяжелых бактериальных инфекциях, при травме и тромбозе. Повышение уровня фибриногена в острой фазе воспаления, как правило, имеет транзиторный характер. У курящих людей уровень фибриногена в плазме крови несколько выше, чем у некурящих. К значительному росту фибриногена приводят заболевания почек (пиелонефрит, гломерулонефрит, гемолитико-уремический синдром), коллагенозы (ревматоидный артрит, узелковый периартериит), пароксизмальная ночная гемоглобинурия, новообразования (рак легкого). При атеросклерозе наблюдается устойчивое увеличение уровня фибриногена, трудно корригируемое лекарственными препаратами. В результате риск сердечно-сосудистых заболеваний повышается с возрастанием исходного содержания фибриногена в интервале 3,0-4,5 г/л. Обнаружено, что повышение уровня фибриногена в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями предшествует развитию инфаркта миокарда и инсульта. Корреляция между уровнем фибриногена и развитием этих осложнений особенно четко прослеживается у пациентов молодого и среднего возраста. Определение уровня фибриногена - наиболее чувствительный тест для выявления бессимптомных стадий заболевания периферических артериальных сосудов.

Референсные значения фибриногена: 2,75- 3,65 г/л

Снижение концентрации фибриногена:

· острый ДВС-синдром;

· дисфибриногенемии.

Повышение концентрации фибриногена:

o инфекционные, воспалительные и аутоиммунные процессы;

o подострый и хронический ДВС-синдром;

o нормально протекающая беременность.



4. Методы определения физиологических антикоагулянтов

4.1 Протеин С

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляционный. Протеин С только в комплексе с протеином S инактивирует Vа и VIII, поэтому желательно параллельно исследовать и протеин С и протеин S.

Определение протеина С с использованием хромогенного субстрата.

Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении непрямыми антикоагулянтами (антагонистами витамина К) появляются формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной активностью, но определяются методами с хромогенными субстратами (так называемые PIVKA-формы). Поэтому у больных, принимающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

Определение протеина С коагуляционным методом.

Метод легко автоматизируется. Коагуляционный метод оценивает активность протеина С, фиксирующегося карбоксилированной частью на фосфолипидах. РIVKA -формы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие факторы, как наличие мутации фактора V Лейден, присутствие в плазме волчаночного антикоагулянта, терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих непрямые антикоагулянты, выявляются чрезвычайно низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с истинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Vа к активированному протеину С (АПС).

Определение протеина С иммунохимическим методом.

Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявляет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность.

В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулянтами у них могут возникнуть некрозы кожи в результате рикошетных тромбозов. Если антикоагулянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (в норме время его полужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же время витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16-20 ч). Эта ситуация может усугубляться тем, что непрямые антикоагулянты начинают назначать в случае развития тромбозов или угрожающей ситуации по тромбообразованию, когда система прокоагулянтов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбообразование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Активность протеина С следует определять до начала лечения антикоагулянтами непрямого действия и контролировать во время лечения.

Референсные значения протеина С: 94-124%

Повышение протеина С отмечается во время беременности.

Снижение протеина С:

· врожденный (наследственный) дефицит или аномалии протеина С;

· геморрагическая болезнь новорожденных;

· заболевания печени с нарушением ее функции;

· ДВС-синдром;

· нефротический синдром;

· синдром острой дыхательной недостаточности;

· менингококковый сепсис;

· гемодиализ;

· лечении L-аспарагиназой;

· лечении пероральными (непрямыми) антикоагулянтами (дефицит витамина К);

· послеродовый и послеоперационный период.

4.2 Протеин S

Протеин S - витамин-К-зависимый белок, который является кофактором активированного протеина С. Это функция положена в основу всех известных коммерческих тест-систем определения протеина S. Описаны случаи как функционального, так и количественного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутствует в плазме частично в свободном состоянии, частично в комплексе с С4-связывающим протеином (С4-СП), но активна только свободная форма протеина S.

Определение протеина S коагуляционным методом.

Для определения протеина S необходимо использовать тест-систему, содержащую очищенный активный протеин С, его субстрат - фактор Vа и дефицитную по протеину S плазму. Специфичность метода относительная, так как фактор V Лейден, высокий уровень ф.VIII и волчаночный антикоагулянт могут существенно влиять на результаты теста, а именно: с этими факторами часто проводят дифференциальную диагностику, определяя протеин S.

Так как коагуляционный метод подвержен действию многих интерферирующих факторов и не стандартизирован, то предпочитают использовать иммунохимический метод.

Определение протеина S иммунохимическим методом.

Иммунохимический метод достаточно широко распространен. Наборы последних разработок позволяют определять «свободный протеин S» прямо без предварительной обработки. Недостатком иммунохимического метода является то, что он выявляет протеолитически неактивные формы протеина S, которые иногда появляются в плазме.

Референсные значения протеина S: 81-111%

Уменьшение содержания (активности) протеина S:

· врожденный (наследственный) дефицит;

· врожденное (наслед.) уменьшение свободной фракции протеина S;

· заболевания печени с нарушением ее функции;

· ДВС-синдром;

· нефротический синдром;

· системная красная волчанка;

· лечение L-аспарагиназой;

· лечение пероральными (непрямыми) антикоагулянтами;

· прием эстрогенов (пероральных контрацептивов);

· беременность, послеродовый период;

· наличие аутоантител к протеину S.

4.3 Антитромбин III

Для определения активности антитромбина III (АТ) чаще всего используют метод с хромогенным субстратом. Антитромбин расщепляет субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт, количество которого зависит от исходной активности антитромбина III. Существуют также иммунохимические (турбидиметрия, нефелометрия) и коагуляционные методы.

Тест может применяться для мониторинга лечения гепарином. Длительная гепаринотерапия может приводить к снижению активности АТ в плазме. Лечение высокими дозами гепарина, особенно нефракционированным гепарином, приводит к транзиторному снижению АТ по механизму потребления, особенно у больных с тяжелой патологией, при критических состояниях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачественных опухолях.

У новорожденных уровень АТ составляет около 50 % и достигает уровня взрослых к 6 мес. Небольшое снижение АТ наблюдается в середине менструального цикла, в пред- и послеродовом периоде, при токсикозах второй половины беременности, в послеоперационном периоде. Эти сдвиги более выражены у пациентов с группой крови А (II), а также у пожилых.

Референсные значения АТ: 86 - 116%

Снижение содержания (активности) АТ:

· врожденный (наследственный) дефицит или аномалии АТ (снижение активности или чувствительности к гепарину);

· заболевания печени (опухоли, цирроз, алкогольный гепатит);

· нефротический синдром (протеинурия свыше 5 г/л);

· карцинома легких;

· ДВС-синдром;

· множественные травмы, тяжелые роды, поздние гестозы;

· прием эстрогенов (пероральных контрацептивов), кортикостероидов;

· лечение L-аспарагиназой.

Увеличение содержания (активности) АТ:

· во время менструации;

· острый вирусный гепатит, холестаз;

· прием анаболических стероидов;

· лечение пероральными (непрямыми) антикоагулянтами.



5. Тесты для исследования фибринолитической системы

Наиболее распространенные в клинической практике методы оценки состояния фибринолитической системы основаны на:

1) исследовании времени и степени лизиса (растворения) сгустков крови или эуглобулиновой фракции плазмы (общеоценочные пробы);

2) определении концентрации плазминогена, его активаторов и ингибиторов (ТАП; ПАИ-1; 2-антиплазмин).

5.1 Время лизиса эуглобулиновых сгустков / ХIIа зависимый фибринолиз

Определение фибринолитической активности эуглобулиновой фракции плазмы крови является важнейшим базисным методом исследования системы фибринолиза, позволяющим оценить состояние внутреннего и внешнего механизмов образования плазминогена. Метод заключается в определении времени спонтанного лизиса сгустка, образующегося из эуглобулиновой фракции бестромбоцитной плазмы при добавлении к ней раствора хлорида кальция.

Существуют и другие модификации метода эуглобулинового лизиса сгустка. Например, растворение сгустка может быть значительно ускорено предварительным введением в плазму каолина -- мощного контактного активатора внутреннего механизма фибринолиза, связанного с активированием комплекса факторов: фактор XII-калликреин-кининоген (“ХIIа зависимый фибринолиз”).

Метод оценки эуглобулинового лизиса требует исходного содержания в плазме фибриногена, так как при снижении фибриногена время лизиса укорачивается, что трактуется ошибочно как гиперфибринолиз. При гиперфибриногенемии время лизиса удлиняется. Поэтому при отклонениях содержания фибриногена в плазме, а также неполноценной полимеризации фибрина возможно получение ошибочных результатов. В связи с ориентировочным характером и недостаточной специфичностью в последнее время вместо теста спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка начали использовать определение отдельных факторов фибринолиза, в первую очередь плазминогена.

Референсные значения: XIIа зависимый фибринолиз 4-10 мин

Укорочение времени лизиса (активация фибринолиза):

· уменьшение концентрации фибриногена - гипо- и дисфибриногенемия.

Увеличение времени лизиса (угнетение фибринолиза):

· гиперфибриногенемия.

5.2 Плазминоген и тканевой активатор плазминогена (ТАП)

Определение количества плазминогена основано на гидролизе хромогенного субстрата. Определение плазминогена используют для диагностики ДВС-синдрома и тромбофилий; выявления нарушений фибринолиза; контроля лечения фибринолитическими препаратами при тромбозах, тромбоэмболиях, инфарктах.

Дефицит плазминогена крайне редкое событие, чаще встречается дефицит тканевого активатора плазминогена (ТАП). Дефицит ТАП является одним из потенциальных факторов риска тромбоза, хотя клинически это подтверждается не всегда.

Тканевой активатор плазминогена (ТАП) освобождается в кровоток из эндотелиальных клеток сосудистой стенки при стрессовых воздействиях, в частности при манжеточной пробе (дозированном пережатии вен). Сначала определяют базовый уровень ТАП, потом на 10-15 минут на предплечье накладывают жгут или раздувают манжетку, вызывающую венозный стаз, затем берут вторую порцию крови, в которой повторно определяют ТАП. Сравнивают результаты обеих проб. ТАП обладает высокой амидазной активностью, позволяющей эффективно использовать для его определения метод хромогенных субстратов.

Определение ТАП проводится у больных с тромбофилией как часть панели тестов на выявление причины тромбофилии, особенно при нагрузочных манжеточных пробах. Повышение ТАП после инфаркта миокарда рассматривается как неблагоприятный фактор. Нарушение освобождения ТАП после венозного стаза описано у больных с тромбозами и патологией почек.

Референсные значения плазминогена: 71-101%

Увеличение содержания плазминогена и его активаторов:

· панкреатит;

· панкреонекроз;

· метастазирующий рак предстательной железы, яичников;

· метастазы меланомы;

· операции на легких, предстательной, поджелудочной железе;

· гиперкатехоламинемия (стресс, тиреотоксикоз, гипертонический криз, введение адреналина);

· патология беременности;

· терминальные и другие состояния, сопровождающиеся развитием ДВС-синдрома;

· цирроз печени;

· метастатическое поражение печени (снижение антиплазминовой и антиактиваторной функции).

Дефицит плазминогена, чаще дефицит тканевого активатора плазминогена:

· рецидивирующие венозные тромбозы;

· системные васкулиты;

· нефротический синдром.



6. Тесты активации свертывания крови

6.1 D-димеры

D-димеры - специфические продукты деградации фибрина, входящие в состав тромба. Они образуются в процессе лизиса сгустка крови под влиянием плазмина и некоторых неспецифических фибринолитиков. Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Этот тест позволяет судить об интенсивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков.

Определение D-димеров проводится иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител, иммунодиффузии, методом турбидиметрии, латекс-агглютинации.

Во всех методах исследования используются моноклональные антитела к эпитопам на D-димере, которые образуются при расщеплении нерастворимого фибрина плазмином. Этих эпитопов нет на фибриногене и растворимых фибрин-мономерных комплексах (РФМК), поэтому D-димеры - показатель того, что в процессе фибринолиза расщепляется именно фибрин, а не фибриноген или фибрин-мономеры. Поскольку эти антитела не взаимодействуют с фибриногеном, исследования могут проводиться как в плазме, так и сыворотке.

На определение D-димеров практически не оказывает влияние техника взятия крови, примесь тромбоцитов, не требуется использования ингибиторов для подавления других факторов.

Референсные значения D-димера: 33,5-727,5 нг/мл

Повышение уровня D-димеров в крови определяется при возникновении венозных тромбозов, атеротромбозе, тромбоэмболии легочной артерии, ДВС-синдроме, после операций, особенно при большом операционном поле и других состояниях с повышенным образованием фибрина. D-димеры достаточно долго циркулируют в крови, время их полувыведения составляет более 24 ч, повышение D-димеров может персистировать в течении нескольких недель после острого тромбоза.

Уровень D-димеров повышен у больных с тромбозом глубоких вен бедра, с тромбоэмболией легочной артерии, он может повышаться после обширных хирургических вмешательств, травм, при онкологических заболеваниях. На содержание D-димеров влияют такие факторы, как величина тромба, время от начала клинических проявлений до назначения антикоагулянтной терапии, прием антикоагулянтов, на фоне которых уровень D-димеров постоянно снижается. Поэтому более важной для исключения диагноза тромбоза является отрицательная диагностическая значимость теста. Причем для разных методов определения Д-димеров отрицательная диагностическая значимость колеблется от 78 до 100%, она выше у более чувствительных методов, что характерно для ИФА-диагностики.

6.2 Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК)

При ряде форм патологии, характеризующихся активацией свертывания крови (ДВС, тромбозы, тромбофилии), происходит расширение пула фибриногена, в результате чего увеличевается количество растворимых фибрин-мономерных комплеков (РФМК). В последнее время стал активно использоваться ортофенантролиновый тест. С помощью ортофенантролинового теста возможно не только качественное, но и количественное определение РФМК. Гепаринотерапия с содержанием гепарина в плазме крови до концентрации 10 ед/мл не влияет на результаты теста.

Референсные значения:

(РФМК по орто-фенантролиновому тесту) - до 4,0 мг%

Повышение:

o активация внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром, тромбоз глубоких вен, эмболии легочной артерии);

o возможно при лечении антикоагулянтами;

o физический и психологический стрессы;

o нормально протекающая беременность;

o в период новорожденности.



Список используемой литературы

1) Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М., 2001.

2) Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. М., 2005.

3) Момот А.П. Патология гемостаза принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики. СПб., 2006.

4) Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М., 2006.

5) Папаян Л.П. Новое в представлении процесса свертывания крови // Трансфузиология. 2004. Т. 5, № 3. С. 7-22.

6) Сидельникова В.М., Кирющенков П.А. Гемостаз и беременность. -- М.: Триада-Х, 2004.

7) Шитикова А.С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб.: ГМУ, 2000.

8) www.coagulometers.ru

9) www.trombozu.net

Размещено на Allbest.ru

...