Культивирование Pseudomonos aeruginosa

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОДЕССКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.И. МЕЧНИКОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ, ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

РЕФЕРАТ

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ PSEUDOMONOS AERUGINOSA

ОДЕССА 2016

Синегнойная палочка - Pseudomonas aeruginosa относится к семейству Pseudomonadoceae, роду Pseudomonas.

Эти бактерии типичные условно-патогенные микроорганизмы. Они широко распространены во внешней среде, постоянно обитают в организме человека и животных.

Морфология

Род Pseudomonas, кроме синегнойной палочки, включает в себя еще более 20 видов, многие из которых также могут вызывать заболевание у человека.

Мелкие грамотрицательные палочки. Средний размер 1,5-3,0 Ч 0,5-0,8 мкм. Подвижны, лофотрихи. Это прямые или слегка изогнутые палочки средних размеров, подвижные (лофотрихи или монотрихи), грамотрицательные, облигатные аэробы. Спор не образуют, имеют тонкую слизистую капсулу.

Синегнойная палочка нетребовательна к питательным средам, хорошо растет на искусственных питательных средах. На мясопептонном бульоне дает рост в виде помутнения с сероватой пленкой на поверхности. На плотных питательных средах формируются крупные полупрозрачные колонии флюоресцирующего зеленоватого цвета. При этом в толщу среды диффундируют синевато-зеленые водорастворимые пигменты - пиоцианин или флюоресцеин. Способность псевдомонад образовывать пигменты - наиболее характерный дифференциально-диагностический признак. Культура синегнойной палочки при культивировании на питательных средах имеет кисловато-сладкий ароматный запах (специфический запах жасмина). Устойчива во внешней среде. Обладает естественной устойчивостью к антибиотикам.

Биохимические свойства:

1) низкая сахаролитическая активность, расщепляет глюкозу до кислоты;

синегнойный культивирование патогенность

2) высокая протеолитическая активность, разлагает некоторые аминокислоты;

3) редуцирует нитриты до газообразного азота;

4) разжижает желатин.

Метаболизм только окислительный.

Антигенная структура:

1) соматический О-антиген, группоспецифический, по его строению делится на серогруппы;

2) жгутиковый Н-антиген;

3) М-антиген внеклеточной слизи.

Факторы патогенности:

1) в организме может образовывать капсулоподобное вещество, имеющее защитные свойства;

2) выделяет термолабильный экзотоксин А, обладающий цитотоксическим и дермонекротическим действием;

3) выделяет эндотоксин;

4) некоторые штаммы продуцируют гемолизины и лейкоцидин;

5) имеет ферменты агрессии, такие как плазмокоагулаза, протеазы, антиэластазы. Синегнойная палочка может обитать в кишечнике человека, обнаруживается на коже и слизистых оболочках. Чаще всего синегнойная инфекция является внутрибольничной. Источник - больной (или бактерионоситель). Может вызывать различные заболевания. Особенно часто выделяется при гнойно-воспалительных осложнениях ожоговых ран. Иммунитет после перенесенной инфекции обусловлен гуморальными и клеточными механизмами. Диагностика: бактериологическое исследование; материал определяется клиническими проявлениями заболевания.

Этиотропная терапия:

1) антибиотики (цефалоспорины, аминогликозиды);

2) синегнойный бактериофаг;

3) синегнойная иммунная плазма;

4) убитая лечебная стафило-протейно-синегнойная вакцина.

Культивирование. Строгие аэробы. Хорошо растут на простых питательных средах. Оптимальная температура роста 37° С, но могут расти и при 5-42° С. На МПА образуют колонии размером 2-5 мм, круглые, полупрозрачные, голубовато-серые с перламутровым оттенком; на МПБ дают помутнение и образуют пленку.

Псевдомонады не прихотливы и отлично растут на многих питательных средах, особенно на таких богатых питательными веществами, как кровяной агар. Поскольку в патологическом материале синегнойная палочка часто находится в ассоциации с другими микроорганизмами, для ее изоляции целесообразно пользоваться селективными средами с иргазаном или цетримидом (цетилтриметиламмонием бромидом).

Синегнойная палочка окрашивает многие питательные среды (например, Мюллера-Хинтона, агар с цетримидом) в зеленый цвет. Такую окраску обеспечивает одновременное образование бактерией желто-зеленого или желто-коричневого пигмента пиовердина и синего пигмента пиоцианина.

Формирует колонии 2 типов: мелкие и большие (диаметром 2-5 мм), полупрозрачные, сероватого цвета, гладкие, с плоскими краями и выпуклым центром. Штаммы, выделенные из органов дыхания и мочеполовой системы, могут образовывать слизистые колонии.

Проявляет феномен «радужного лизиса», который характеризуется появлением в посевах нежного блестящего металлического налета и зон лизиса. Однако, это свойство различные штаммы проявляют в различной степени и нестабильно. К числу сред, на которых псевдомонады наиболее интенсивно проявляют феномен радужного лизиса относится трехсахарный агар.

На МПА, средах Эндо и Плоскирева формируют 5 типов колоний: плоские неправильной формы, подобные колониям кишечной палочки, складчатые, слизистые и карликовые. На поверхности бульонных сред и пептонной воды псевдомонады образуют серовато-серебристую пленку. Посевы издают специфический запах (земляники, жасмина и т. п.).

Среда для выращивания синегнойной палочки содержит лимонную кислоту, хлористый натрий, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин и глицерин при соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; хлористый натрий 0,9-1,0; сернокислый магний 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0; сернокислое железо 0,04-0,05; аспарагин 0,9-1,0; глюкоза 0,9-1,0; глицерин 2,9-3,0 мл. Среда дешевле и при ее использовании получают вакцинный препарат, не отягощенной балластными белковыми веществами.

Изобретение относится к микробиологии, в частности, к разработке питательной среды для выращивания синегнойной палочки, пригодной для использования в биологической промышленности при получении антигенных и вакцинных препаратов.

В микробиологической практике для культивирования синегнойной палочки используют питательные среды, основой которых являются животные белковые продукты - мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА).Вследствие наличия в данных средах большого количества белков мяса, пептона конечный вакцинный продукт, получаемый после выращивания микробов, содержит в своем составе балластные белковые вещества среды, что снижает его специфичность, увеличивает реактогенность и требует применения метода очистки. В этой связи разработка синтетической питательной среды для выращивания синегнойной палочки позволила бы получать вакцинные и антигенные препараты, не отягощенные баластными белковыми веществами и пептоном. Кроме того, в отличие от питательных сред, основой которых являются белковые продукты, синтетические легко стандартизируются по составу и наиболее пригодны для использования в биологической промышленности.

За прототип взята среда для выращивания стафилококков (Евглевский А.А. Патент 2132382, МПК С 12 N 1/20).

Состав вышеуказанной среды содержит ингредиенты в граммах на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; хлористый натрий 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0; сернокислый магний 4,9-5,0; сернокислое железо 0,04-0,05; сернокислый цинк 0,08-0,09; аспарагин 0,9-1,0; гликокол 0,9-1,0; глицерин 2,0-3,0 мл.

Однако попытки использовать для выращивания синегнойной палочки данную питательную среду не имели нужного эффективного результата, так как в отдельных пробирках, флаконах, колбах рост биомассы составлял от 7 до 10 млрд. микробных тел в 1 мл. Это требовало проведения поисковых исследований по подбору оптимального соотношения ингредиентов с учетом отличительных особенностей выращивания синегнойной палочки.

Были приготовлены и испытаны многочисленные варианты синтетической среды с разным содержанием хлористого натрия, с включением в состав среды глюкозы и, наоборот, исключением из ее состава гликокола, сернокислого цинка.

Опыты показали, что при добавлении в питательную среду 0,5-0,7-0,9-1,0-1,1 г/литр глюкозы обеспечивалось накопление биомассы синегнойной палочки соответственно до 7-8; 8-9; 9-10; 10-11: 10-11 млрд. микробных тел в 1 мл. Дальнейшее увеличение глюкозы в питательной среде не сопровождалось увеличением накопления биомассы.

Последовательное уменьшение содержания в среде хлористого натрия с 5 г/литр до 4-3-2-1 способствовало еще более обильному и равномерному росту биомассы микробов соответственно до концентрации 11-12; 12-13; 13-14; 14-15 млрд. микробных тел в 1 мл культуральной жидкости. Однако дальнейшее уменьшение содержания в питательной среде хлористого натрия до 0,8 и 0,5 г/л снизило накопление биомасс до 13-14 и 12 млрд. микробных тел/мл. Следовательно, оптимальное содержание хлористого натрия в среде должно составлять 0,9-1,0 г/литр.

Следует отметить, что в ходе поисковых опытов авторами не отмечено влияние на рост синегнойной палочки сернокислого цинка и гликокола, в связи с чем они были исключены из компонентов разработанной среды.

Таким образом, путем устранения вышеперечисленных недостатков предлагается среда для выращивания синегнойной палочки, содержащая в своем составе лимонную кислоту, хлористый натрий, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин, глюкозу и глицерин. Новым является то, что среда содержит глюкозу и новое соотношение компонентов в г на 1 литр дистиллированной воды: лимонная кислота 4,9-5,0; хлористый натрий 0,9-1,0; сернокислый магний 4,9-5,0; фосфорнокислый калий двухзамещенный 4,9-5,0; сернокислое железо 0,04-0,05; аспарагин 0,9-1,0; глюкоза 0,9-1,0; глицерин 2,9-3,0 мл.

Способ приготовления среды включает одномоментное или последовательное растворение в дистиллированной воде перечисленных компонентов с последующей нейтрализацией повышенной кислотности аммиаком до рН 7,0-7,1. Расфасовывают питательную среду в пробирки, во флаконы, в биобутыли, в которых объем количества среды должно составлять 1/2 часть объема, после чего подвергают стерилизации автоклавированием. При плотности посева 90-100 млн. микробных тел на 1 мл среды конечное накопление биомассы в культуральной жидкости находится на уровне 14-15 млрд. микробных тел в 1 мл.

Преимущество данной среды перед МПА и МПБ состоит в том, что для выращивания синегнойной палочки не требуются дефицитные и дорогостоящие продукты животного происхождения и пептон. Получаемый конечный продукт не отягощен балластными белковыми веществами среды и пептоном.

Среда для выращивания синегнойной палочки, содержащая лимонную кислоту, хлористый натрий, фосфорнокислый калий двухзамещенный, сернокислый магний, сернокислое железо, аспарагин и глицерин, отличающаяся тем, что дополнительно содержит глюкозу при следующем соотношении компонентов, г/л дистиллированной воды: Лимонная кислота - 4,9-5,0 Хлористый натрий - 0,9-1,0 Сернокислый магний - 4,9-5,0 Фосфорнокислый калий двухзамещенный - 4,9-5,0 Сернокислое железо - 0,04-0,05 Аспарагин - 0,9-1,0 Глюкоза - 0,9-1,0 Глицерин, мл - 2,9-3,0

Характерным признаком P. aeruginosa является пигменто- и ароматообразование. Большинство штаммов образует сине-зеленый пигмент - пиоцианин, окрашивающий питательную среду. Пиоцианин растворим в воде. Он обладает антагонистическими свойствами в отношении многих бактерий, но токсичен и поэтому не используется с лечебной целью. Почти все штаммы P. aeruginosa имеют характерный запах жасмина.

Ферментативные свойства. Ферментирует только один углевод - глюкозу. Протеолитическая активность хорошо выражена: разжижает желатин и свернутую сыворотку, свертывает молоко. Дает положительную реакцию на цитохромоксидазу.

Токсинообразование. Образует токсины, обладающие гемолитическим и цитотоксическим действием и лейкоцидин, лизирующий лейкоциты человека. Имеет эндотоксин.

Устойчивость к факторам окружающей среды. При 60° С погибает в течение 15 мин. Выдерживает УФ-облучение. 2% раствор фенола губит синегнойную палочку. Длительно сохраняется в ожоговых корочках и пыли помещений (до 2 нед). Устойчив к большинству антибиотиков.

Восприимчивость животных. Кролики, белые мыши и морские свинки чувствительны к P. aeruginosa.

Источники инфекции. Человек (больной и носитель).

Пути передачи. В основном непрямой контакт. Имеет значение и воздушно-пылевой путь.

Патогенез. Синегнойная палочка вызывает гнойно-воспалительные процессы, локализация которых зависит от входных ворот инфекции: ожог, рана, дыхательные пути и т. д.

Список литературы

1. Зудилин В. А. Иммуногенные свойства вакцины против псевдомоноза крупного рогатого скота. - М., 1983. Труды ВИЭВ, т.57, с. 133-135).

2. Кисленко В. Н., Колычев Н.М., Госманов Р.Г., Ветеринарная микробиология и иммунология: учебник под редакцией проф. В.Н. Кисленко - 4-е изд. перераб и доп. - М.: ГЕОТАР МЕДИА, 2012. - 752с.

3. Межидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. -М. Медицина. -- 2003. -306 с.

4. Ніколаєнко В.М., Осолодченко Т. П., Чупрінова С.І., та ін. // Вісник Харківського національного університету ім. В.Н. Каразіна. Серія «Медицина». -- Харків. -- 2006. -- №?738. -- вип., 13. -С. 40?43.

5. Дрегваль О. А., Черватюк И.В., Черевач Н. В. //Мікробіологічний журнал. -- 2003. -- Т. 65. -- №?3. -- С. 14?20.

Размещено на Allbest.ru