Жизнедеятельность микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Систематика и номенклатура микроорганизмов. Принципы современной квалификации по Берге

микроб метаболизм берге культивирование

1.1 Систематика микроорганизмов

Систематика - распределение микроорганизмов в соответствии с их происхождением и биологическим сходством. Систематика занимается всесторонним описанием видов организмов, выяснением степени родственных отношений между ними и объединением их в различные по уровню родства классификационные единицы - таксоны. Основные вопросы, решаемые при систематике (три аспекта, три кита систематики) - классификация, идентификация и номенклатура.

Классификация - распределение (объединение) организмов в соответствии с их общими свойствами (сходными генотипическими и фентипическими признаками) по различным таксонам.

Таксономия - наука о методах и принципах распределения (классификации) организмов в соответствии с их иерархией. Наиболее часто используют следующие таксономические единицы (таксоны) - штамм, вид, род. Последующие более крупные таксоны - семейство, порядок, класс.

В современном представлении вид в микробиологии - совокупность микроорганизмов, имеющих общее эволюционное происхождение, близкий генотип (высокую степень генетической гомологии, как правило более 60%) и максимально близкие фенотипические характеристики.

Нумерическая (численная) таксономия основывается на использовании максимального количества сопоставляемых признаков и математическом учете степени соответствия. Больщое число сравниваемых фенотипических признаков и принцип их равной значимости затрудняло классификацию.

При изучении, идентификации и классификации микроорганизмов чаще всего изучают следующие (гено- и фенотипические) характеристики:

1. Морфологические - форма, величина, особенности взаиморасположения, структура.

2. Тинкториальные - отношение к различным красителям (характер окрашивания), прежде всего к окраске по Граму. По этому признаку все микроорганизмы делят на грамположительные и грамотрицательные.

Морфологические свойства и отношение к окраску по Граму позволяют как правило отнести изучаемый микроорганизм к крупным таксонам - семейству, роду.

3. Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах.

4. Биохимические - способность ферментировать различные субстраты (углеводы, белки и аминокислоты и др.), образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты за счет активности различных ферментных систем и особенностей обмена веществ.

5. Антигенные - зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, распознаются по способности макроорганизма (хозяина) вырабатывать антитела и другие формы иммунного ответа, выявляются в иммунологических реакциях.

6. Физиологические - способы углеводного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) и других видов питания, тип дыхания (аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы).

7. Подвижность и типы движения.

8. Способность к спорообразованию, характер спор.

9. Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование.

10. Химический состав клеточных стенок - основные сахара и аминокислоты, липидный и жинокислотный состав.

11. Белковый спектр (полипептидный профиль).

12. Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам.

13. Генотипические (использование методов геносистематики).

В последние десятилетия для классификации микроорганизмов, помимо их фенотипических характеристик (см. пп. 1 - 12), все более широко и эффективно используются различные генетические методы (изучение генотипа - генотипических свойств). Используются все более совершенные методы - рестрикционный анализ, ДНК - ДНК гибридизация, ПЦР, сиквенс и др. В основе большинства методов лежит принцип определения степени гомологии генетического материала (ДНК, РНК). При этом чаще исходят из условного допущения, что степень гомологии более 60% (для некоторых групп микроорганизмов - 80%) свидетельствует о принадлежности микроорганизмов к одному виду (различные генотипы - один геновид), 40 - 60%- к одному роду.

1.2 Идентификация

Основные фено- и генотипические характеристики, используемые для классификации микроорганизмов, используются и для идентификации, т.е. установления их таксономического положения и прежде всего видовой принадлежности - наиболее важного аспекта микробиологической диагностики инфекционных заболеваний. Идентификация осуществляется на основе изучения фено- и генотипических характеристик изучаемого инфекционного агента и сравнения их с характеристиками известных видов. При этой работе часто применяют эталонные штаммы микроорганизмов, стандартные антигены и иммунные сыворотки к известным прототипным микроорганизмам. У патогенных микроорганизмов чаще изучают морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства.

Номенклатура - название микроорганизмов в соответствии с международными правилами. Для обозначения видов бактерий используют бинарную латинскую номенклатуру род/вид, состоящую из названия рода (пишется с заглавной буквы) и вида (со строчной буквы). Примеры - Shigella flexneri, Rickettsia sibirica.

В микробиологии часто используется и ряд других терминов для характеристики микроорганизмов.

Штамм - любой конкретный образец (изолят) данного вида. Штаммы одного вида, различающиеся по антигенным характеристикам, называют серотипами (серовариантами - сокращенно сероварами), по чувствительности к специфическим фагам - фаготипами, биохимическим свойствам - хемоварами, по биологическим свойствам - биоварами и т.д.

Колония - видимая изолированная структура при размножении бактерий на плотных питательных средах, может развиваться из одной или нескольких родительских клеток. Если колония развилась из одной родительской клетки, то потомство называется клон.

Культура - вся совокупность микроорганизмов одного вида, выросших на плотной или жидкой питательной среде.

Основной принцип бактериологической работы - выделение и изучение свойств только чистых (однородных, без примеси посторонней микрофлоры) культур.



2. Метаболизм. Типы питания микробов

2.1 Метаболизм микроорганизмов

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т.е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих - анаболизм и катаболизм. Анаболизм - синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм - энергетический обмен, связан с окислительно - восстановительными реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) - осмотрофы, или в виде отдельных частиц - фаготрофы.

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: - пассивная диффузия - по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

- облегченная диффузия - по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;

- активный транспорт - против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;

- транслокация (перенос групп) - против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в форфорилированном виде.

Основные химические элементы - органогены, необходимые для синтеза органичеких соединений - углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза - например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, окислительно-восстановительных реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические - органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

2.2 Дыхание микроорганизмов

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание - биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости от того, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О₂), при анаэробном - связанный кислород (-NO₃, =SO₄, =SO₃).

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

1. Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.

2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO₂, например до 10 - процентной концентрации.

3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода - т.е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.

4. Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях т.е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H₂O₂ - перекись водорода, - О₂ - свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно - восстановительного потенциала (rH₂).

2.3 Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов

1. Физический - откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще - N₂ - 85%, CO₂ - 10%, H₂ - 5%).

2. Химический - применяют химические поглотители кислорода.

3. Биологический - совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).

4. Смешанный - используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов - очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно-восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов - предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий - анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система «Газпак» со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

2.4 Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах

1. Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2. Оптимальные температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1. Психрофилы - растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2. Мезофилы - растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум - при 37 градусах С).

3. Термофилы - растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5 - 3% агара) и полужидкие (0,3 - 0,7% агара) среды.

Агар - полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны - продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты - мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо - пептонный бульон - МПБ, мясо - пептонный агар - МПА);

- специальные - среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак - Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

- дифференциально - диагностические - для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

- селективные (элективные) - для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих - пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

2.5 Рост и размножение микроорганизмов

Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

- лаг - фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прирости биомассы бактерий);

- экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степеии n);

- стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);

- стадия гибели - уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH₂, концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе - это хемостатные (непрерывные) культуры.

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура - популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн. др).



3. Санитарная оценка качества почвы по микробиологическим показателям

Санитарное состояние почвы - это совокупность ее физических, физико-химических и биологических свойств, определяющих безопасность почвы в эпидемическом и химическом отношении. Оценка санитарного состояния почвы, уровня ее загрязнения и степени опасности для здоровья людей основывается на результатах лабораторных исследований: санитарно-физических, санитарно-химических, физико-химических, санитарно-микробиологических, санитарно-гельминтологических, санитарно-энтомологических и радиометрических. Комплекс критериев, дающий возможность оценить качество почвы, называют показателями санитарного состояния почвы. Классификация показателей санитарного состояния почвы приведена в табл. 49.

Все показатели санитарного состояния почвы можно разделить на прямые и косвенные (непрямые). Прямые показатели дают возможность непосредственно по результатам лабораторного исследования почвы оценить уровень ее загрязнения и степень опасности для здоровья населения. По косвенным показателям можно сделать выводы о факте существования загрязнения, его давности и продолжительности путем сравнения результатов лабораторного анализа исследуемой почвы с чистой контрольной почвой того же типа (имеющей одинаковый природный состав с опытной), отобранной с незагрязненных территорий.

Большинство санитарно-химических показателей эпидемической безопасности почвы являются косвенными. Непосредственно оценить степень загрязнения и опасности почвы можно лишь по величине санитарного числа Хлебникова. Это отношение содержания азота гумуса к общему органическому азоту, который состоит из азота гумуса и азота чужеродных для почвы органических веществ, загрязняющих почву. Если почва чистая, то санитарное число Хлебникова равно 0,98-1. Другие санитарно-химические показатели исследуемой почвы оценивают путем сравнения с аналогичными показателями контрольной незагрязненной почвы.

О свежем загрязнении свидетельствуют высокое содержание общего органического азота, органического углерода, хлоридов, окисляемость в исследуемой почвы по сравнению с контрольной почвой. Повышенное содержание аммиака, нитритов и нитратов свидетельствует о процессах самоочищения почвы от азотсодержащих органических веществ. Значительное содержание общего органического азота, органического углерода и повышенная окисляемость исследуемой почвы при условии одинакового количества в исследуемой и контрольной почве аммиака, нитритов и нитратов свидетельствует о свежем загрязнении почвы и торможении процессов минерализации.

Если количество общего органического азота и органического углерода в почве опытного участка не превышает их содержания в почве контрольного участка, то исследуемую почву оценивают как чистую. Наличие в такой почве нитратов и хлоридов в повышенных количествах указывает на давнее загрязнение и на завершение процессов минерализации органического вещества.

Санитарно-микробиологические, санитарно-гельминтологические и санитарно-энтомологические показатели эпидемической безопасности, в отличие от санитарно-химических, являются прямыми, т.е. дают возможность непосредственно оценить степень загрязнения и опасности почвы. Кроме того, по ним можно оценить давность загрязнения. Так, для свежего загрязнения характерны увеличение микробного числа и количества жизнеспособных недеформированных яиц геогельминтов, уменьшение коли-титра и перфрингенс-титра почвы с обязательным превалированием неспорообразующих форм микроорганизмов. Превалирование клостридиальных форм и наличие деформированных яиц аскарид свидетельствуют о давнем загрязнении почвы.

Показатели химической безопасности почвы в большинстве случаев являются прямыми и дают возможность не только оценить степень загрязнения почвы ЭХВ, но и решить проблему адекватной оценки состояния здоровья населения под влиянием загрязняющих почву ЭХВ. Решение этой проблемы приобретает сегодня особую актуальность из-за ухудшения состояния окружающей среды и снижения уровня здоровья населения Украины в последние годы.

Изучение влияния загрязнения почвы ЭХВ на состояние здоровья населения проводится путем специальных эпидемиологических исследований и математико-статистического многофакторного моделирования в системе окружающая среда - здоровье. По санитарному состоянию почвы, еще до изучения показателей, характеризующих здоровье населения, можно с достаточной вероятностью прогнозировать влияние загрязнения почвы на здоровье людей.

Оценка санитарного состояния почвы по уровню загрязнения ЭХВ основывается на определении фактического содержания ЭХВ в почве и его сравнен и и с ПДК. Причем особое внимание уделяют ЭХВ 1 - го и 2 - го классов опасности (чрезвычайно и высокоопасным веществам). Согласно оценочной шкале, к чистым почвам относятся такие, в которых содержание ЭХВ не превышает ПДК, к слабозагрязненным - при содержании ЭХВ в пределах от 1 до 10 ПДК; к загрязненным - при превышении ПДК ЭХВ в 11-100 раз и к очень загрязненным - при превышении ПДК больше чем в 100 раз. По степени загрязнения почвы определяют степень ее опасности для здоровья населения.

Для количественной оценки степени загрязнения почвы ЭХВ можно использовать вместо ПДК показатель БОК для данного климатоландшафтного региона. Обычно БОК для наиболее распространенных в Украине дерново-подзолистых почв составляет 1/2 ПДК.

В зависимости от содержания в почве ЭХВ 1 - го и 2-го классов опасности можно сделать ориентировочный прогноз относительно ее вероятного влияния на состояние здоровья населения. Зависимость состояния здоровья населения от уровня загрязнения почвы вытекает из двух положений. Во-первых, количество ЭХВ мигрирующих из почвы в атмосферный воздух, даже в экстремальных условиях составляет лишь 20-25% от содержащихся в почве. Во-вторых, минимальные физиологические нарушения в организме человека наблюдаются при содержании ЭХВ в атмосферном воздухе в пределах 2-3 ПДК; существенные - при 4-7 ПДК, а уровни в 8-10 ПДК приводят к повышению заболеваемости соответствующей популяции. При содержании ЭХВ в воздухе до 100 ПДК наблюдаются острые отравления, а при превышении их в 500 раз - летальные исходы. С учетом этого разработана ориентировочная шкала оценки состояния здоровья населения в зависимости от уровней загрязнения почвы ЭХВ.

Необходимо отметить, что на практике загрязнение почвы ЭХВ в концентрациях, вызывающих смертельные отравления, в основном не встречается. Если, например, ПДК гексахлорциклогексана (ГХЦГ) в почве составляет 0,1 мг/кг, то в реальных почвенно-климатических условиях смертельно опасная концентрация этого препарата будет равняться 1000 ПДК, т.е. 100 мг/кг, или 300 кг/га, а норма применения ГХЦГ в аграрной практике составляет всего 3 кг/га.

Иногда при определенных метеорологических условиях (антициклон, приземная температурная инверсия, скорость движения воздуха, приближающаяся к штилю, температура воздуха 20°С, влажность воздуха 100%, ясная солнечная погода, дожди накануне, интенсивность УФ-радиации 2700 мкВт/мин на 1 см²) в весенне-летний период наблюдались случаи острого и хронического отравления сельскохозяйственных работников на полях при незначительном содержании ЭХВ в почве (не более 4 ПДК, или 8 БОК). Это связывали с действием токсических высоколетучих метаболитов пестицидов - фосгена, дифосгена, хлорциана, хлорида, фторида, цианида водорода и др. Было доказано, что они могут образовываться как в почве при определенных почвенно-климатических условиях вследствие биотрансформации и взаимодействия с компонентами азотных минеральных удобрений, так и в приземном слое атмосферного воздуха вследствие фотохимических превращений. Кроме того, выяснилось, что указанные выше метеорологические условия способствуют образованию токсического тумана на сельскохозяйственных полях, который также является причиной острых отравлений даже при сравнительно невысоком содержании ЭХВ в почве.

Приведенная методика оценки возможного влияния почвы на состояние здоровья населения дает возможность ориентировочно оценивать здоровье жителей определенной зоны наблюдения лишь на основании результатов лабора¬орного анализа почвы, без специальных исследований состояния здоровья.

Уровни радиоактивного загрязнения почвы в условиях последствия чернобыльской катастрофы оценивают по гигиеническим регламентам, разработанным Национальной комиссией радиационной защиты населения.

Пригодными для проживания населения и сельскохозяйственного производства без ограничений считают: во-первых, территории, почвы которых не содержат искусственных радионуклидов, а естественная радиоактивность почвы находится в пределах 0,5-2 Ku/км²; во-вторых, территории, загрязненные искусственными радионуклидами при условии, что активность почвы не превышает 1 Ku/км². Почвы, загрязненные искусственными радионуклидами, активность которых составляет от 1 до 5 Ku/км², признают условно чистыми, пригодными для проживания лишь ограниченной части населения (категория Б согласно классификации норм радиационной безопасности НРБ-97). При таком уровне загрязнения радионуклидами количество пищевых продуктов местного производства не должно превышать границы годового поступления для этой категории населения. Умеренно загрязненные почвы (активность 5-15 Ku/км²) пригодны для проживания населения и сельскохозяйственно¬го производства лишь при условии проведения специальных агрохимических и агромелиоративных работ при контроле за радиоактивностью объектов окружающей среды. При этом доза облучения населения не должна превышать пожизненно допустимой - 35 бэр. Загрязненные почвы (активность 15-40 Ки/км²) можно использовать для проживания населения лишь при условии обеспечения чистыми пищевыми продуктами. Если почвы очень загрязнены (активность 40-100 Ки/км²), проживать населению не рекомендуется.



4. Формы иммунного реагирования: синтез антител и клеточных факторов, иммунологическая память, толерантность, аллергия

Первоначально иммунология возникла как наука о невосприимчивости (иммунитете) к инфекционным болезням. Наиболее существенный вклад в ее создание внесли И.И. Мечников (фагоцитарная или клеточная теория иммунитета) и П. Эрлих (гуморальная теория), в творческой дискуссии между которыми совершенствовались представления об иммунитете.

В настоящее время считается, что наследственный (врожденный, видовой) и приобретенный иммунитет зависит от согласованной деятельности пяти основных систем: макрофагов, комплемента, интерферонов, Т- и В-лимфоцитов, главной системы гистосовместимости (МНС- в английском варианте), обеспечивающих различные формы иммунного ответа.

В современном понимании иммунология - это не только наука, изучающая защиту от инфекционных заболеваний. Иммунология - наука, изучающая механизмы самозащиты организма от всего генетически чужеродного, поддержания структурной и функциональной целостности организма (гомеостаза организма). Подробнее - см. лекцию 1.

Центральным биологическим механизмом иммунитета является механизм распознавания «своего» и «чужого». Пример - необходимость защиты от собственных мутантных и раковых клеток (одномоментно в организме находится около 10 млн. измененных клеток).

4.1 Иммунитет

Целостная система биологических механизмов самозащиты организма, с помощью которых он распознает и уничтожает все чужеродное (генетически отличающееся).

Выделяют две основные формы иммунитета - видовой (врожденный) и приобретенный. Приобретенный иммунитет может быть естественный (результат встречи с возбудителем) и искусственный (иммунизация), активный (вырабатываемый) и пассивный (получаемый), стерильный (без наличия возбудителя) и нестерильный (существующий в присутствии возбудителя в организме), гуморальный и клеточный, системный и местный, по направленности - антибактериальный, антивирусный, антитоксический, противоопухолевый, антитрансплантационный.

В основе видового иммунитета лежат различные механизмы естественной неспецифической резистентности. Среди них - кожные покровы и слизистые оболочки, нормальная микрофлора организма, фагоцитоз, воспаление, лихорадка, система комплемента, барьерные механизмы лимфоузлов, противомикробные вещества, выделительные системы организма, главная система гистосовместимости.

Кожа и слизистые - первая линия защиты против возбудителей. Кроме функции механического (анатомического) барьера кожа обладает бактерицидной активностью. Слизь, лизоцим, желудочный сок, слезная жидкость, слюна, деятельность мерцательного эпителия способствует защите слизистых оболочек.

Нормальная микрофлора организма препятствует колонизации организма посторонней микрофлорой (конкуренция за субстраты, различные формы антагонизма, в т.ч. выделение антибиотических веществ, изменение рН и др.).

4.2 Фагоцитоз и система комплемента

Вторая линия защиты организма против микроорганизмов, преодолевших поверхностные барьеры. Клеточные факторы системы видовой резистентности - фагоциты, поглощающие и разрушающие патогенные микроорганизмы и другой генетически чужеродный материал. Представлены полиморфоядерными лейкоцитами или гранулоцитами - нейтрофилами, эозинофилами и базофилами (клетками миелопоэтического ряда), а также моноцитами и тканевыми макрофагами (клетками макрофагально - моноцитарной системы). Значение фагоцитирующих клеток для защиты организма впервые доказал И.И. Мечников, разработавший фагоцитарную теорию иммунитета.

Стадии фагоцитоза.

Процесс фагоцитоза (поглощения твердофазного объекта) состоит из пяти стадий.

1. Активация (усиление энергетического метаболизма). Факторами активации и хемотаксиса являются бактериальные продукды (ЛПС, пептиды), компоненты комплемента (С3 и С5), цитокины и антитела.

2. Хемотаксис.

3. Адгезия.

4. Поглощение.

5. Исход фагоцитоза.

Адгезия связана с наличием ряда рецепторов на поверхности фагоцитов (к Fc - фрагментам антител, компонентам комплемента, фибронектину), обеспечивающих прочность рецептор - опосредованных взаимодействий опсонинов, обволакивающих микроорганизмы и ограничивающих их подвижность (антитела, С3в, фибронектин).

Фагоциты обладают амебоподобными псевдоподиями. При поглощении образуется фагосома с поглощенным объектом (бактерией), к ней присоединяется и сливается содержащая литические ферменты лизосома, образуется фаголизосома.

Возможно три исхода фагоцитоза:

- завершенный фагоцитоз;

- незавершенный фагоцитоз;

- процессинг антигенов.

Завершенный фагоцитоз - полное переваривание микроорганизмов в клетке - фагоците.

Незавершенный фагоцитоз - выживание и даже размножение микроорганизмов в фагоците. Это характерно для факультативных и особенно - облигатных внутриклеточных паразитов. Механизмы персистирования в фагоцитах связаны с блокадой фагосомо - лизосомального слияния (вирус гриппа, микобактерии, токсоплазмы), резистентностью к действию лизосомальных ферментов (гонококки, стафилококки), способностью микробов быстро покидать фагосомы после поглощения и длительно пребывать в цитоплазме (риккетсии).

В процессе фагоцитоза происходит «окислительный взрыв» с образованием активных форм кислорода, что обеспечивает бактерицидный эффект.

К одной из важнейших функций макрофагов (наряду с хемотаксисом, фагоцитозом, секрецией биологически активных веществ) является переработка (процессинг) антигена и представление его иммунокомпетентным клеткам с участием белков главной системы гистосовместимости (МНС) класса 2.

Фагоцитоз - не только уничтожение чужеродного, но и представление антигена для запуска иммунных реакций и секреции медиаторов иммунных и воспалительных реакций. Система макрофагов - центральное звено не только естественной резистентности (видового иммунитета), но и играет важную роль в приобретенном иммунитете, кооперации клеток в иммунном ответе.

Воспаление как защитная реакция организма на различные повреждения тканей возникло на более высокой ступени эволюции, чем фагоцитоз и характерно для высокоорганизованных организмов, обладающих кровеносной и нервной системами.

Инфекционное воспаление сопровождается различными сосудистыми и клеточными (включая фагоцитоз) реакциями, а также запуском целого ряда медиаторов воспалительных реакций (гистамина, серотонина, кининов, белков острой фазы воспаления, лейкотриенов и простагландинов, цитокинов, системы комплемента).

Многие бактериальные продукты активируют клетки макрофагально - моноцитарной системы и лимфоциты, отвечающие на них выделением биологически активных продуктов - цитокинов, в частности интерлейкинов. Их можно характеризовать как медиаторы клеточных иммунных реакций. В воспалительных реакциях основную роль имеет интерлейкин-1 (ИЛ-1), стимулирующий лихорадку, повышающий проницаемость сосудов и адгезивные свойства эндотелия, активирующий фагоциты.

Лихорадка. Повышение температуры тела - защитная реакция организма, ухудшающая условия для размножения многих микроорганизмов, активирует макрофаги, ускоряет кровоток и усиливает обменные процессы в организме.

Барьерные функции лимфоузлов. По выражению П.Ф. Здродовского (1969) лимфоузлы - своеобразный биологический фильтр для возбудителей, переносимых с лимфой. Здесь проникшие через кожу или слизистые и занесенные током лимфы микроорганизмы задерживаются и подвергаются действию макрофагов и активированных лимфоцитов.

Система комплемента - комплекс белков и гликопротеидов сыворотки крови человека и позвоночных животных (их более 20). Отдельные компоненты опосредуют процессы воспаления, опсонизацию чужеродных фрагментов для последующего фагоцитоза, участвуют наряду с макрофагами в непосредственном уничтожении микроорганизмов и других чужеродных клеток (лизис бактерий и вирусов). В условиях физиологической нормы компоненты системы комплемента находятся в неактивной форме. Известны три пути активации системы комплемента - классический, альтернативный и с использованием С1 - шунта.

Классический путь - каскад протеазных реакций с компонента С1q до С9, реализуется при наличии антител к соответствующему антигену. С комплексом «антиген - антитела» взаимодействует компонент С1q, затем С4, следом - С2. Образуется комплекс «антиген - антитела-С1С4С2», с ним соединяется С3 (центральный компонент системы) и запускается цепь активации с эффекторными функциями (опсонизация и лизис бактерий, активация системы макрофагов, воспаление).

Альтернативный путь реализуется при первичном контакте с возбудителем (когда еще нет антител). Он индуцируется ЛПС и другими микробными антигенами. С1, С4, С2 не участвуют, альтернативный и классический пути смыкаются на уровне С3.

4.3 Система интерферонов

Интерфероны - синтезируемые различными клетками организма гликопротеиды широкого спектра биологической активности (прежде всего антивирусной), быстрый ответ организма на получение клетками неспецифического сигнала чужеродности. Существует целая система интерферонов, которые разделены на альфа, бета и гамма подтипы с выраженной гетерогенностью свойств. Противовирусное действие проявляется в способности подавлять внутриклеточное размножение ДНК- и РНК - вирусов (прежде всего в результате блокировки синтеза вирусных макромолекул). Индукцию синтеза интерферонов вызывают вирусы, бактерии, риккетсии, простейшие, синтетические соединения.

Киллерные клетки.

В обеспечении видового иммунитета существенную роль принадлежит Т - цитотоксическим лимфоцитам (Т - киллерам), а также главной системе гистосовместимости (подробнее- в следующих лекциях).

Т - киллеры по представлению антигенов главной системы гистосовместимости класса 1 распознают любые чужеродные антигены (включая мутантные, например - раковые клетки), атакуют и уничтожают их.

Клетки NK (natural killer - натуральные киллеры) имеют важное значение в поддержании генетического гомеостаза и противоопухолевой защите, их функции распознавания не зависят от представления антигенов МНС (major histocompatibility complex) класса 1.

Системы неспецифической резистентности и видового иммунитета способствуют поддержанию структурной и функциональной целостности организма и являются основой для формирования приобретенного (специфического) иммунитета. Стыкуясь на этом, более высоком уровне, системы видового и приобретенного иммунитета образуют единую и наиболее эффективную систему самозащиты организма от всего чужеродного.

4.4 Иммунная система

Иммунная система - совокупность органов, тканей и клеток, обеспечивающих клеточно-генетическое постоянство организма. Принципы антигенной (генетической) чистоты основываются на распознавании «своего - чужого» и в значительной степени обусловлены системой генов и гликопротеидов (продуктов их экспрессии) - главным комплексом гистосовместимости (MHC), у человека часто называемой системой HLA (human leucocyte antigens). На лейкоцитах человека четко экспрессированы белки МНС, с помощью исследования лейкоцитов типируют антигены МНС.

Органы иммунной системы.

Выделяют центральные (костный мозг - кроветворный орган, вилочковая железа или тимус, лимфоидная ткань кишечника) и периферические (селезенка, лимфатические узлы, скопления лимфоидной ткани в собственном слое слизистых оболочек кишечного типа) органы иммунитета.

Клетки - предшественники иммунокомпетентных клеток продуцируются костным мозгом. Некоторые потомки стволовых клеток становятся лимфоцитами. Лимфоциты подразделяют на два класса- Т и В. Предшественники Т - лимфоцитов мигрируют в тимус, где созревают в клетки, способные участвовать в иммунном ответе. У человека В-лимфоциты созревают в костном мозге. У птиц незрелые В-клетки мигрируют в сумку (бурсу) Фабрициуса, где достигают зрелости. Зрелые В- и Т - лимфоциты заселяют периферические лимфоузлы. Таким образом, центральные органы иммунной системы осуществляют образование и созревание иммунокомпетентных клеток, периферические органы обеспечивают адекватный иммунный ответ на антигенную стимуляцию - «обработку» антигена, его распознавание и клональную пролиферацию лимфоцитов - антигензависимую дифференцировку.

Основными формами иммунного ответа на попадание антигена в организм являются: биосинтез антител, образование клеток иммунной памяти, реакция гиперчувствительности немедленного типа, реакция гиперчувствительности замедленного типа, иммунологическая толерантность, идиотип - антиидиотипические отношения.

Для гуморального иммунитета характерна выработка специфических антител (иммуноглобулинов).

Антитела - специфические белки гамма - глобулиновой природы, образующиеся в организме в ответ на антигенную стимуляцию и способные специфически взаимодействовать с антигеном (in vivo, in vitro). В соответствии с международной классификацией совокупность сывороточных белков, обладающих свойствами антител, называют иммуноглобулинами.

Уникальность антител заключается в том, что они способны специфически взаимодействовать только с тем антигеном, который вызвал их образование.

Иммуноглобулины (Ig) разделены в зависимости от локализации на три группы:

- сывороточные (в крови);

- секреторные (в секретах - содержимом желудочно - кишечного тракта, слезном секрете, слюне, особенно- в грудном молоке) обеспечивают местный иммунитет (иммунитет слизистых);

- поверхностные (на поверхности иммунокомпетентных клеток, особенно В-лимфоцитов).

Любая молекула антител имеет сходное строение (Y - образную форму) и состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, связанных дисульфидными мостиками. Каждая молекула антител имеет два одинаковых антигенсвязывающих фрагмента Fab (fragment antigen binding), определяющих антительную специфичность, и один Fc (fragment constant) фрагмент, который не связывает антиген, но обладает эффекторными биологическими функциями. Он взаимодействует со «своим» рецептором в мембране различных типов клеток (макрофаг, тучная клетка, нейтрофил).

Концевые участки легких и тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина вариабельны по составу (аминокислотным последовательностям) и обозначаются как VL и VH области. В их составе выделяют гипервариабельные участки, которые определяют структуру активного центра антител (антигенсвязывающий центр или паратоп). Именно с ним взаимодействует антигенная детерминанта (эпитоп) антигена. Антигенсвязывающий центр антител комплементарен эпитопу антигена по принципу «ключ - замок» и образован гипервариабельными областями L- и Н - цепей. Антитело свяжется антигеном (ключ попадет в замок) только в том случае, если детерминантная группа антигена полностью вместится в щель активного центра антител.

Легкие и тяжелые цепи состоят из отдельных блоков - доменов. В легких (L) цепях - два домена - один вариабельный (V) и один константный (C), в тяжелых (H) цепях - один V и 3 или 4 (в зависимости от класса иммуноглобулина) C домена.

Существуют легкие цепи двух типов - каппа и лямбда, они встречаются в различных пропорциях в составе различных (всех) классов иммуноглобулинов.

Выявлено пять классов тяжелых цепей - альфа (с двумя подклассами), гамма (с четырьмя подклассами), эксилон, мю и дельта. Соответственно обозначению тяжелой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов - А, G, E, M и D.

Именно константные области тяжелых цепей, различаясь по аминокислотному составу у различных классов иммуноглобулинов, в конечном результате и определяют специфические свойства иммуноглобулинов каждого класса.

Известно пять классов иммуноглобулинов, отличающихся по строению тяжелых цепей, молекулярной массе, физико - химическим и биологическим характеристикам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. В составе IgG выделяют 4 подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), в составе IgA - два подкласса (IgA1, IgA2).

Структурной единицей антител является мономер, состоящий из двух легких и двух тяжелых цепей. Мономерами являются IgG, IgA (сывороточный), IgD и IgE. IgM - пентамер (полимерный Ig). У полимерных иммуноглобулинов имеется дополнительная j (joint) полипептидная цепь, которая объединяет (полимеризует) отдельные субъединицы (в составе пентамера IgM, ди- и тримера секреторного IgA).

Основные биологические характеристики антител.

1. Специфичность - способность взаимодействия с определенным (своим) антигеном (соответствие эпитопа антигена и активного центра антител).

2. Валентность - количество способных реагировать с антигеном активных центров (это связано с молекулярной организацией - моно- или полимер). Иммуноглобулины могут быть двухвалентными (IgG) или поливалентными (пентамер IgM имеет 10 активных центров). Двух- и более валентные антитела навывают полными антителами. Неполные антитела имеют только один участвующий во взаимодействии с антигеном активный центр (блокирующий эффект на иммунологические реакции, например, на агглютинационные тесты). Их выявляют в антиглобулиновой пробе Кумбса, реакции угнетения связывания комплемента.

3. Афинность - прочность связи между эпитопом антигена и активным центром антител, зависит от их пространственного соответствия.

4. Авидность - интегральная характеристика силы связи между антигеном и антителами, с учетом взаимодействия всех активных центров антител с эпитопами. Поскольку антигены часто поливалентны, связь между отдельными молекулами антигена осуществляется с помощью нескольких антител.

5. Гетерогенность - обусловлена антигенными свойствами антител, наличием у них трех видов антигенных детерминант:

- изотипические - принадлежность антител к определенному классу иммуноглобулинов;

- аллотипические - обусловлены аллельными различиями иммуноглобулинов, кодируемых соответствующими аллелями Ig гена;

- идиотипические - отражают индивидуальные особенности иммуноглобулина, определяемые характеристиками активных центров молекул антител. Даже тогда, когда антитела к конкретному антигену относятся к одному классу, субклассу и даже аллотипу, они характеризуются специфическими отличиями друг от друга (идиотипом). Это зависит от особенностей строения V - участков H- и L - цепей, множества различных вариантов их аминокислотных последовательностей.

Понятие о поликлональных и моноклональных антителах будет дано в следующих разделах.

Характеристика основных классов иммуноглобулинов.

Ig G. Мономеры, включают четыре субкласса. Концентрация в крови - от 8 до 17 г./л, период полураспада - около 3- 4 недель. Это основной класс иммуноглобулинов, защищающих организм от бактерий, токсинов и вирусов. В наибольшем количестве IgG - антитела вырабатываются на стадии выздоровления после инфекционного заболевания (поздние или 7S антитела), при вторичном иммунном ответе. IgG1 и IgG4 специфически (через Fab - фрагменты) связывают возбудителей (опсонизация), благодаря Fc - фрагментам IgG взаимодействуют с Fc - рецепторам фагоцитов, способствуя фагоцитозу и лизису микроорганизмов. IgG способны нейтрализовать бактериальные экзотоксины, связывать комплемент. Только IgG способны транспортироваться через плаценту от матери к плоду (проходить через плацентарный барьер) и обеспечивать защиту материнскими антителами плода и новорожденного. В отличие от IgM - антител, IgG - антитела относятся к категории поздних - появляются позже и более длительно выявляются в крови.

IgM. Молекула этого иммуноглобулина представляет собой полимерный Ig из пяти субъединиц, соединенных дисульфидными связями и дополнительной J - цепью, имеет 10 антиген - связывающих центров. Филогенетически это наиболее древний иммуноглобулин. IgM - наиболее ранний класс антител, образующихся при первичном попадании антигена в организм. Наличие IgM - антител к соответствующему возбудителю свидетельствует о свежем инфицировании (текущем инфекционном процессе). Антитела к антигенам грамотрицательных бактерий, жгутиковым антигенам - преимущественно IgM - антитела. IgM - основной класс иммуноглобулинов, синтезируемых у новорожденных и младенцев. IgM у новорожденных - это показатель внутриутробного заражения (краснуха, ЦМВ, токсоплазмоз и другие внутриутробные инфекции), поскольку материнские IgM через плаценту не проходят. Концентрация IgM в крови ниже, чем IgG - 0,5 - 2,0 г/л, период полураспада - около недели. IgM способны агглютинировать бактерии, нейтрализовать вирусы, активировать комплемент, активизировать фагоцитоз, связывать эндотоксины грамотрицательных бактерий. IgM обладают большей, чем IgG авидностью (10 активных центров), аффинность (сродство к антигену) меньше, чем у IgG.

IgA. Выделяют сывороточные IgA (мономер) и секреторные IgA (IgAs). Сывороточные IgA составляют 1,4 - 4,2 г/л. Секреторные IgAs находятся в слюне, пищеварительных соках, секрете слизистой носа, в молозиве. Они являются первой линией защиты слизистых, обеспечивая их местный иммунитет. IgAs состоят из Ig мономера, J-цепи и гликопротеина (секреторного компонента). Выделяют два изотипа - IgA1 преобладает в сыворотке, субкласс IgA2 - в экстраваскулярных секретах.

Секреторный компонент вырабатывается эпителиальными клетками слизистых оболочек и присоединяется к молекуле IgA в момент прохождения последней через эпителиальные клетки. Секреторный компонент повышает устойчивость молекул IgAs к действию протеолитических ферментов. Основная роль IgA - обеспечение местного иммунитета слизистых. Они препятствуют прикреплению бактерий к слизистым, обеспечивают транспорт полимерных иммунных комплексов с IgA, нейтрализуют энтеротоксин, активируют фагоцитоз и систему комплемента.

IgE. Представляет мономер, в сыворотке крови находится в низких концентрациях. Основная роль - своими Fc - фрагментами прикрепляется к тучным клеткам (мастоцитам) и базофилам и опосредует реакции гиперчувствительности немедленного типа. К IgE относятся «антитела аллергии» - реагины. Уровень IgE повышается при аллергических состояниях, гельминтозах. Антигенсвязывающие Fab - фрагменты молекулы IgE специфически взаимодействует с антигеном (аллергеном), сформировавшийся иммунный комплекс взаимодействует с рецепторами Fc - фрагментов IgE, встроенных в клеточную мембрану базофила или тучной клетки. Это является сигналом для выделения гистамина, других биологически активных веществ и развертывания острой аллергической реакции.

IgD. Мономеры IgD обнаруживают на поверхности развивающихся В-лимфоцитов, в сыворотке находятся в крайне низких концентрациях. Их биологическая роль точно не установлена. Полагают, что IgD участвуют в дифференциации В-клеток, способствуют развитию антиидиотипического ответа, участвуют в аутоиммунных процессах.

...