Размещено на http://allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Реферат

Окраска по Граму

Овчаровой Анны Игоревны

студентки 3 курса,

специальность «Биология»

Минск, 2016

Содержание

Введение

1. Техника проведения окраски

1.1 Подготовка материала для окраски

1.2 Фиксация

1.2.1 Физический способ фиксации

1.2.2 Химический способ фиксации

1.3 Процесс окрашивания мазков

2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

2.1 Модификация Hucker

2.2 Модификация Burke

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

2.4 Модификация Preston-Morrell

3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет



ВВЕДЕНИЕ

В зависимости от строения клеточной стенки прокариоты, относящиеся к эубактериям, делятся на две большие группы. Было обнаружено, что если фиксированные клетки эубактерий обработать сначала кристаллическим фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс.

При последующей обработке спиртом в зависимости от строения клеточной стенки судьба комплекса различна: у так называемых грамположительных видов этот комплекс удерживается клеткой, и последние остаются окрашенными, у грамотрицательных видов, наоборот, окрашенный комплекс вымывается из клеток, и они обесцвечиваются. (Этот способ был впервые предложен в 1884 г. датским ученым Х. Грамом (Ch. Gram), занимавшимся окрашиванием тканей. Позднее он был использован для бактерий).

У некоторых эубактерий положительная реакция при окрашивании описанным выше способом свойственна только клеткам, находящимся в стадии активного роста. Выяснено, что окрашенный комплекс образуется на протопласте, но его удерживание клеткой или вымывание из нее при последующей обработке спиртом определяются особенностями строения клеточной стенки. Окрашивание препаратов увеличивает чувствительность микроскопии, так как неокрашенные бактерии плохо различимы даже при увеличении в 400-1000.

Наиболее распространена дифференциальная окраска по Граму, хотя применяют и монохромные окраски. Окраска по Граму позволяет отличить бактерии, чья толстая клеточная стенка практически полностью состоит из пептидогликана ( грамположительные ), от бактерий, чья клеточная стенка помимо тонкого слоя пептидогликана имеет наружную мембрану, состоящую из липопротеидов и липополисахаридов (грамотрицательных ). Основный краситель (например, кристаллический фиолетовый) прочно фиксируется в стенке грамположительных бактерий, придавая им иссиня-черный цвет, и легко вымывается спиртом (или ацетоном) из стенки грамотрицательных бактерий, после чего они докрашиваются контрастным красителем (например, сафранином) в красный цвет.

Окраска по Граму незаменима при исследовании мазков мокроты. Если мокрота получена правильно, в ней обнаруживают не менее 25 нейтрофилов и менее 10 эпителиальных клеток в поле зрения при малом увеличении. Большее количество эпителиальных клеток и разнообразие типов бактерий свидетельствуют о том, что мокрота загрязнена содержимым ротоглотки. Хотя отличить нормальную микрофлору от патогенных бактерий нередко бывает трудно, окраска мазка по Граму дает ценную информацию, если патогенная бактерия имеет какой-либо доступный определению признак (биологический сигнал ). Например, при бактериальном вагинозе в мазке из влагалища видны эпителиальные клетки, усеянные грамположительными бактериями.

Микроскопию мазков кала, окрашенных по Граму, используют как отборочное исследование. При обнаружении нейтрофилов приступают к бактериологическому исследованию и определению токсинов, вырабатываемых Clostridium difficile .

Окраску по Граму используют также для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ, синовиальной, плевральной и перитонеальной жидкости. Нижний предел чувствительности метода составляет 10000 бактерий на 1 мл.

Чтобы увеличить чувствительность, исследуемую жидкость центрифугируют и готовят окрашенный мазок осадка. Эта процедура называется обогащением материала. Она проста и особенно ценна для выявления бактерий и лейкоцитов в СМЖ и кислотоустойчивых бактерий в мокроте.



1. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ ОКРАСКИ

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основным, а другой -- дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (?) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легкоразрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, и затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

1.1 Подготовка материала для окраски

Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. Гистологические срезы готовят по рутинной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.



1.2 Фиксация

При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваютсялучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

1.2.1 Физический способ фиксации

Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксациидолжен занимать не более 2 с.

Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметногостекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стеклодолжно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70--80 °С).

1.2.2 Химический способ фиксации

Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 %и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % -- 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10--15 минут и затем высушивают на воздухе.



1.3 Процесс окрашивания мазков

1 На фиксированный мазок наливают один из осномвных красителей на 2 или 3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.

1. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1--2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1--2 минуты до почернения препарата.

2. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20--40--60 секунд).

3. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1--2 мин.

4. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2--5 мин).

5. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.



2. Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-Вейгерту

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.

2. Окрашивают 20 мин в 1% растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).

3. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.

4. Окрашивают 5 мин в 1% кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.

5. Быстро ополаскивают в 1% растворе хлорида натрия.

6. Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть йода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.

7. Промокают фильтровальной бумагой.

8. Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объемов анилина и ксилола (1 -- 2 мл); растворы сливаютдо тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.

9. Проводят через 3 смены ксилола

10. Заключают в бальзам или любую смолу, растворенную в ксилоле.

Результат: грамположительные бактерии сине-черные, фибрин фиолетовый, ядра красные.

2.1 Модификация Hucker

гистологический окрашивание бактерия

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин).

2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).

3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).

4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить.

5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить.

6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек).

7. Промыть и подсушить препарат.

2.2 Модификация Burke

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют.

2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b (2-3 мин).

3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).

4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить).

5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).

6. Препарат высушить на воздухе.

7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек).

8. Промыть и подсушить препарат.

2.3 Модификация Kopeloff-Beerman

1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют.

2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более).

3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более).

4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать.

5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек).

6. Препарат высушить на воздухе.

7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин).

8. Промыть и подсушить препарат.

2.4 Модификация Preston-Morrell

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин).

2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек).

3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин).

4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить.

5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить.

6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек).

7. Промыть и подсушить препарат.



3. Ошибки

3.1 Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

Причина	Решение
Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)	· Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором · Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке. Иногда удается найти подходящие · Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культура	· Окраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий - через двое-трое суток). При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя. Используйте культуру подходящего возраста
Культура выращена в неблагоприятных условиях	· При выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой · Культивируйте микроорганизм на полноценной среде
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)	нет

3.2 Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

Причина	Решение
Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)	· Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении · Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной "густотой" мазка · Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади · При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
Мазок плохо обесцвечен	· Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием · Повторить приготовление препарата и его окраску · Дообесцветить имеющийся мазок · Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки - заменить раствор.
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)	нет

Размещено на Allbest.ru

...