Dизначення показників росту Candida lipolytica

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Національний університет харчових технологій

Курсова робота

по предмету: Загальна мікробіологія і вірусологія

Виконала:

Голімбйовська А.Л.

Київ 2015



Реферат

У загальній частині курсової роботи представлена характеристика мікроорганізму Candida lipolytica - продуцента лимонної кислоти на н-парафінах.

Основні положення розрахунково-графічної частини:

· визначення показників росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів (параметри кривої росту періодичної культури, ріст популяції, константа швидкості поділу, тривалість генерації);

· аналіз складу поживного середовища і його придатність для вирощування мікроорганізмів;

· складання енергетичного балансу окиснення глюкози за відповідних умов.

Ключові слова: C. lipolytica, лимонна кислота, н-парафіни, алкани, етанол, мікроорганізми, таксон, біотехнологія.



Зміст

Вступ

Загальна частина

1. Обґрунтування вибору біологічного агента

2. Характеристика біологічного агента

2.1.Таксономічний статус біологічного агента

2.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

2.3. Морфолого-культуральні ознаки

2.4 Особливості метаболізму біологічного агенту

3. Характеристика кінцевого продукту біосинтезу розрахунково-графічна частина

4. Визначення показників росту під час періодичного культивування

5. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

6. Енергетичний баланс окиснення субстрату

Висновки

Список використаної літератури

Додатки



Вступ

Біотехнологія є вагомим і перспективним фактором розвитку світового виробництва, застосовується практично у всіх секторах світової економіки та демонструє значні потенційні переваги. Біотехнологія забезпечує виробництво лікарських засобів, харчових продуктів, створення трансгенних мікроорганізмів, рослин і тварин. Досягнення біотехнології використовуються майже в усіх областях науки і техніки, адже саме вона допомагає створювати якісні і недорогі продукти. В даний час вагомий внесок біотехнології спостерігається в галузі охорони здоров'я. Можливість необмеженого отримання природних білкових біорегуляторів і біологічно активних речовин, в тому числі рідкісних і дорогих, відкриває нові перспективи в лікуванні різних захворювань.

Однією з важливих областей застосування біотехнології є медицина, фармакологія, зокрема виробництво антибіотиків, ферментів, амінокислот, кровозамінників, алкалоїдів, нуклеотидів, імунорегуляторів, протиракових та противірусних препаратів [1].

Важливим осередком дослідження розвитку біотехнології в Україні є Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України. На сьогоднішній день, особлива увага приділялася випуску багатотомних фундаментальних праць. Проте соціально-економічна криза в суспільстві, на жаль, триває. Але в цих важких умовах колектив Інституту підтримує належний рівень досліджень світу рослин і грибів. Водночас науковці прагнуть, щоб їхні інтелектуальні потреби були задоволені достатньою мірою, а результати досліджень якнайповніше слугували суспільству.

Загалом, біотехнологія - це типове породження нашого бурхливого, динамічного XXI ст. Вона відкриває нові перспективи перед людським розумом, дозволяє і те, що не під силу природі - переміщення генів між рослинами, тваринами і мікроорганізмами. Проблеми біотехнології надзвичайно різноманітні, починаючи з суто технічних і закінчуючи тонкими інтелектуальними проблемами, пов'язані із зубожінням фундаментальної науки у зв'язку з домінуванням суто проблемно-прикладних розробок. Разом з тим, все ж таки відкриваються широкі перспективи та можливості для використання нових наукових розробок для суспільства [2].

Розвиток біотехнології на Україні є одним із перспективних напрямів, поряд з інформаційними технологіями. Біотехнологічний сектор принадливий для фінансових вкладень. Біотехнологія та її біоіндустрія вважаються однією з сучасних найперспективніших конкурентоспроможних галузей. Біотехнологічні виробництва та біотехнологічні аспекти в різних галузях народного господарства та медицини скеровані на охорону громадського здоров'я та наповнення споживчого ринку.

Інтерес до біотехнології та темпи її розвитку останніми роками зростали дуже швидко, що привело до появи великої кількості біотехнологічних компаній і створення на урядовому рівні відповідних комісій та комітетів, які повинні оцінювати можливості різноманітних біотехнологічних напрямів, а також відкриття у деяких вищих навчальних закладах України напряму підготовки фахівців “Біотехнологія” та створення спеціальностей для підготовки професіоналів-біотехнологів.

Сучасний стан біотехнології в Україні характеризується наявністю достатнього науково-технічного потенціалу, але слабко розвиненою інфраструктурою розроблення та впровадження біотехнологій різного призначення і нестачею кадрів міжнародного рівня GLP/GMP. В Україні створено Національний науковий центр України з медичних та біотехнологічних досліджень та в 1997 р. - Міжвідомчий центр біотехнології, які потребують оновлення в сучасних умовах [3].

Завдання Міжвідомчого центру біотехнології в Україні:

- подолати застарілість біоінженерного вирішення біотехнології;

- створити виробництва за системою стандартів належних практик GMP та випускати продукцію за стандартами ISO, системою сертифікації НАССР;

- створити систему маркетингових досліджень біотехнології;

- підвищити інформативність бази даних біооб'єктів та біотехнологій;

- поповнити біотехнологію фахівцями міжнародного рівня GLP/GMP;

забезпечити:

- розроблення комерційноздатних технологій мікробіологічних синтезів;

- застосування біотехнологічних методів у традиційних виробництвах;

- контроль перебігу біотехнологічних процесів та якості біотехологічної продукції;

- скерування біотехнологічних виробництв на охорону громадського здоров'я, насамперед харчування, лікування, побуту та стану довкілля, враховуючи можливі забруднення мутагенними, канцерогенними, токсичними речовинами, зокрема мікотоксинами.

Інвестиції в біотехнологію України, розпочаті з 2000 року, дадуть змогу:

- вирішити науково-господарські проблеми на технічному рівні;

- вийти на світовий ринок продукції та науково-технічних розробок;

- підвищити рівень національної технологічної безпеки;

- збільшити ефективність військово-політичної стратегії;

- доповнити науково-технічні розробки дослідженнями для вирішення основного завдання наукової бази [3].

З розвитком біотехнології пов'язують вирішення глобальних проблем людства - ліквідацію недостачі енергії, мінеральних ресурсів, поліпшення стану охорони здоров'я і якості навколишнього середовища, виробництво антибіотиків, вітамінів, амінокислот та ферментних речовин.

Сучасна біотехнологія характеризується використанням біологічних методів для боротьби з забрудненням довкілля, для захисту рослин від шкідників, хвороб, виробництво цінних біологічно-активних речовин (антибіотики, ферменти, гормональні препарати). Останнім часом все частіше з'являються дані про мутагенну та канцерогенну дію хімічних пестицидів, які погано руйнуються і накопичуються в навколишньому середовищі [4].

Актуальність теми. Вивчення продуцента лимонної кислоти - Candida lipolytica є доцільним і актуальним на сьогоднішній день. Адже ці дріжджі є одними із найефективніших та непатогенних мікроорганізмів, невибагливі до поживного середовища. Лимонна кислота широко використовується у фармацевтичній і харчовій промисловості для отримання детергентів і для багатьох інших цілей [5].



1. Обґрунтування вибору біологічного агента

Забруднення нафтою становить небезпеку для навколишнього середовища. У результаті розливів нафти порушується аерація, гідрологічний режим і мікрорельєф верхніх горизонтів ґрунту. Наявність нафтового забруднення веде до пригнічення рослинного покриву на великих територіях, збільшенню техногенних площ, зміни біологічного різноманіття природних ландшафтів. У разі забруднення нафтопродуктами водних об'єктів, зменшується кількість розчиненого кисню у воді і відбувається збіднення видового різноманіття флори і фауни.

Нафта являє собою складну суміш вуглеводнів, кисневих, сірчистих і азотистих сполук. У її складі виявляється понад 1000 індивідуальних органічних речовин. Легкі фракції володіють найбільшою токсичністю по відношенню до живих організмів, але вплив їх досить короткочасний внаслідок швидкого випаровування, біодеградації, розсіювання. Важкі фракції менш токсичні, але вони значно погіршують властивості грунтів, утруднюючи водо- і газообмін. Ці компоненти дуже стійкі і можуть зберігатися в землі тривалий час.

Для очищення нафтозабруднених об'єктів використання біотехнологічних методів є найбільш перспективним напрямком. Деструкція нафти асоціацією штаму Yarrowia lipolytica Y 1 064 виявилася найбільш ефективною в порівнянні з іншими штамами [6].

В останні роки дріжджі розглядалися в якості перспективних продуцентів різних речовин, включаючи органічні кислоти. Зазвичай використовують дріжджі роду Candida, а саме C. lipolytica, C. fibrae, C. subtropicalis, C. guilliermondii, C. oleaophila і C. zeylanoides. Виробництво лимонної кислоти засноване на культивуванні дріжджів C. lipolytica та грибів Aspergillus niger [6].

У різних патентах повідомляється про використання спеціально селекціонованих мутантних штамів дріжджів Yarrowia lipolytica для одержання лимонної кислоти. Раніше ці дріжджі позначалися як вид Candida lipolytica або Saccharomycopsis lipolytica. Фактично, найменування Candida lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica і Yarrowia lipolytika є синонімами.

Штами Y. lipolytica продукують лимонну кислоту при їх культивуванні на середовищі, що містить різні сполуки: глюкозу, н-алкани, ацетат, гліцерин, етанол в якості джерел вуглецю.

При культивуванні диких штамів на середовищі з різними джерелами вуглецю накопичується лимонна кислота зі значним домішком ізолимонної кислоти. Так на середовищі з н-алканами синтезуються приблизно рівні кількості лимонної і ізолимонної кислоти.

Мутантний штам C. lipolytica N1, відомий як продуцент лимонної кислоти з парафіну, при зростанні на середовищі, що містить етанол як єдине джерело вуглецю, продукує лимонну і ізолимонну кислоти в концентрації 4,7 і 0,5 г/л [5].

Відомий також спосіб виділення лимонної кислоти, отриманої при культивуванні дріжджів C. lipolytica на н-парафінах за допомогою електродіалізу. При цьому вихід на стадії електродіалізі становить не більше 85%. Такі підходи складні та енергоємні (табл. 1.1).

Таблиця 1.1 - Порівняння виходу лимонної кислоти за різних умов культивування

Штам	Умови культивування	Субстрат, джерело вуглецю	Концентрація лимонної кислоти
A. niger	23 - 26 °С, pH 5.5.	меляса	30-40%
C. lipolytica	Електродіаліз	н-парафіни	85%
C. lipolytica	7 діб культивування в рідкому середовищі з нафтою при температурi 23 - 25 °С.	нафта	69%
C. lipolytica	При pH 7.0, 6 діб культивування, при 5% NaCl.	н-парафіни	92 %



Лимонну кислоту можна отримати з н-парафінів за допомогою дріжджових організмів роду Candida - C. lipolytica, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. oleophila, C. guilliermondii, C. zeylanoides. Найбільш активними з них є дріжджі C. lipolytica. До того ж інші види відносять до розряду умовно патогенних [5].

Штам Y. lipolytica характеризується:

· високою стабільністю синтезу лимонної кислоти;

· добре росте і синтезує лимонну кислоту не тільки на чистому етанолі, але також на технічному етанолі і відходах спиртового виробництва, в тому числі ефіро-альдегідної фракції;

· здійснює синтез лимонної кислоти при відносно низькій концентрації кисню в середовищі, що забезпечує зниження енергетичних витрат за рахунок зменшення подачі повітря;

· є психотолерантними і солестійкими (до 5% NaCl). Це передбачає можливість їх використання в засолених природних субстратах при знижених температурах (наприклад, на території нафторозливів, де крім нафти присутні мінералізовані пластові води) [6].

Отже, можна зробити висновки, що найкращим продуцентом лимонної кислоти є C. lipolytica, адже метод виробництва даної кислоти з використанням дріжджів C. lipolytica має багато різних переваг, здатність до культивування на н-алканах, газойлі та інших фракціях нафти, тобто вони здатні до росту на сировині запаси якого досить значні. Дані дріжджі не є патогенними, що є досить актуальним в сучасній біотехнології.



2. Характеристика біологічного агента

Дріжджі - одноклітинні гриби, що не утворюють справжнього міцелію; грампозитивні нерухомі організми. За будовою клітини дріжджі відносяться до еукаріот. Дріжджова клітина має клітинну стінку. За типом живлення - хемогетеротрофи, за типом дихання - факультативні анаероби. Але є невелика група дріжджів, які розвиваються на поверхні субстратів і за типом дихання є аеробами .

2.1 Таксономічний статус біологічного агента

Дріжджі класифікують за способами їх вегетативного розмноження (брунькування, ділення), здатністю до спороутворення, а також за фізіологічними ознаками. Перша класифікація базувалася лише на морфолого-фізіологічних властивостях дріжджів, наступна класифікація враховувала й належність видів до певних місць існування та їх адаптацію до цих умов [1].

У 1984 р. опубліковано класифікацію Н.Дж.В. Крегер-ван Рій, яка впродовж майже 16 років вважалася найповнішою.

У 1998 р. опубліковано четверте видання Визначника дріжджів за редакцією американських учених К.П. Куртцмана та Дж.В. Фела. Згідно з цим виданням аспорогенні дейтероміцетні дріжджі не існують як самостійний окремий таксон, а належать до аско- та базидіоміцетних дріжджів. У 2000 р. опубліковано філогенетичну класифікацію дріжджів К.П. Куртцмана (табл.2.1)

У 2006 р. опубліковано філогенетичну класифікацію аскоміцетних дріжджів, за якою Candida lipolytica займає таке положення (табл. 2.1):



Таблиця 2.1 - Класифікації Candida lipolytica

Таксономічна група	Класифікація Н.Дж.В. Крегер-ван Рій (1984 р.)	Класифікація К.П. Куртцмана	Філогенетична класифікація аскоміцетних дріжджів
Відділ	Eumycota	-	-
Підвідділ	Deuteromycotina	-	Saccharomycotina
Клас	Blastomycetes	Hemiascomycetes	Saccharomycetes
Порядок	-	Saccharomycetales (синонім Endomycetales)	Saccharomycetales insertae sedis
Родина	Cryptococcaceae	Candidaceae	Saccharomycopsidaceae
Рід	Candida	Candida	Yarrowia
Вид	Lipolytica	Lipolytica	Lipolytica

2.2 Морфолого-культуральні ознаки

Культура Candida lipolytica представлена овальними, видовжено-овальними, округлими клітинами розміром 4,6-6,0x4,5-12,5 мкм. Також зустрічаються невеликі округлі клітини 2,0-2,5x3,0-3,5 мкм. Клітини поодинокі або в ланцюжках з 3-4 клітин (рис. 2.1). Брунькування полярне або латеральне. До третьої доби більшість клітин брунькуєтся і утворюється псевдоміцелій [5,10]. Дріжджова клітина має клітинну стінку, до складу якої входять: манани та глюкани (полімери занози та глюкози) (50-90 %); білки, багаті незамінними амінокислотами (7-10 %); мінеральні речовини (3-9 %). Клітинна стінка еластична, але дуже міцна. Товщина дорівнює 70-350 нм [11].

Рис. 2.1 Дріжджові клітини Yarrowia lipolytica при рості на гліцерині



Штрих на глюкозо-пептонному агарі безперервний, плоский, блискучий, кремово-білого кольору, пастоподібний, краї рівні.

Колонії кремового кольору, пастоподібні, злегка підняті в центрі, злегка шорсткі, тьмяні, з хвилястими краями (рис. 2.2).

Рис. 2.2 Колонії Yarrowia lipolytica

На 2 добу росту на рідкому глюкозо-пептонному середовищі утворюється тонка плівка, кільце на стінці, важкий осад на дні пробірки. Культура спори не утворює [5].

2.3 Фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

Yarrowia lipolytica по відношенню до кисню - строгий аероб. За типом живлення - хемогетеротроф. Цукри не зброжує.

Асимілює: глюкозу, D-галактозу (повільно), L-сорбозу, D-рибозу, етанол, гліцерин, еритрит, адоніт, D-маніт, сорбіт і молочну, бурштинову, лимонну, глюконовую кислоти.

Не асимілює: сахарозу, мальтозу, лактозу, целобіозу, трегалозу, мелібіозу, рафінозу, меліцитозу, інулін, крохмаль, D-ксилозу, L- і D-арабінозу, рамозу, дульцит, інозит, D-глюкозамін і глюкуронову, 2-кетоглюконову, 5-кетоглюконову кислоти. Не асимілює нітрати [5].

Не здатний до росту в безвітамінному середовищі, потребує тіамін, не потребує біотин. Не здатний до росту на середовищі з 50% вмістом глюкози.

Оптимальне pH: 5,5 - 6,0. Не здатний до росту при температурі 37^oС. Максимальна температура росту 35 ^oС.

Розріджує желатин. Здатний до росту на алканах. Гідролізує сечовину.

Продукує лимонну кислоту на глюкозі, гліцерині, етанолі, ацетаті, алканах, жирах [5,10].

2.4 Особливості метаболізму біологічного агенту

Штами Candida lipolytica добре ростуть на агаризованому середовищі до складу якого входить дріжджовий екстракт, пептон, глюкоза, агар та вода. Y. lipolytica продукує лимонну кислоту при культивуванні на середовищі, що містить глюкозу, н-алкани, ацетат, гліцерин, етанол в якості джерел вуглецю [10].

Найефективніше поживне середовище для культивування Y. Lipolytica має такий склад, г/л:

· (NH₄)₂SO₂ - 2,0;

· MgSO₄x7H₂O - 0,7;

· Ca(NO₃)₂ - 0,4;

· NaCl - 0,5;

· K₂HPO₄ - 0,1;

· KH₂PO₄ - 1,0;

· дріжджовий кстракт - 0,3;

· етанол - 5,0;

· мікроелементи, мг/л: KI - 0,1, B - 0,01, Mn²⁺ - 0,01, Cu²⁺ - 0,01, Mo⁶⁺ - 0,01, Fe²⁺ - 0,05, Zn²⁺-0,3 [5].

Станом на 03.12.2015 р. шлях метаболізму етанолу за гліколітичним шляхом для Y. lipolytica має вигляд:



Етанол

1

Ацетальдегід

2,3

Ацетат

4

Ацетил-КоА

5

Піруват

Рис. 2.3 Катаболізм етанолу шляхом гліколізу для Y. lipolytica:

Ферменти: 1 - алкогольдегідрогеназа (КФ.1.1.1.1); 2 - алкогольдегідрогеназа НАД+ (КФ.1.2.1.3); 3 - алкогольдегідрогеназа НАДФ+ (КФ.1.2.1.5); 4 - ацетил-КоА синтетаза (КФ.6.2.1.1); 5 - піруват ферредоксин оксидоредуктаза бета субоніт (КФ.1.2.7.1) [12].



3. Характеристика кінцевого продукту

Лимонна кислота (C₆H₈O₇) - слабка триосновна кислота. Лимонна кислота, або 2-оксо-1,2,3-пропантрікарбонова кислота є безбарвною; кристали ромбічні (розчинник перекристалізації - вода). Молекулярна масса 192,13 а.е.м. Температура плавлення: 153 °C. Щільність: 1,542 г / см³ (18 °C). Розчинність, у г / 100 г:

· вода - 133 (20 °C );

· діетиловий ефір - 2,26 (20 °C);

· етанол - 116 (25 °C) [13].

Лимонна кислота та її солі широко використовуються в харчовій промисловості, в якості компонентів рідких миючих засобів, буферних розчинів для зберігання жирів від псування, у фармацевтичній промисловості як компоненти багатьох лікарських засобів (лимоннокислий Na- антикоагулянт проти згортання крові). Лимонна кислота використовується для зняття іржі і окалини з металевих поверхонь, при електротравлені міді, в ситцедрукуванні, при виробництві діазобумаги, пластифікаторів, мономерів, як сповільнювачі схоплювання гіпсу [14].

В даний час обсяг світового виробництва лимонної кислоти та її солей складає більше 800 тис. тон на рік. Поряд з традиційними сферами використання у виробництвах напоїв та кондитерських виробів, лимонна кислота та її солі знайшли широке застосування в дитячому харчуванні, як консервант крові, а також в хіміко-фармацевтичній, електронній, оборонній та інших галузях [6].

У живих організмах лимонна кислота - важливий продукт обміну речовин; рослини здатні накопичувати лимонну кислоту: зокрема, цитрусові містять 6-8 %, листя махорки - 8-14 %, культуральні рідини деяких грибів - до 10 %. lipolytica лимонний кислота культивування

У технології лимонної кислоти взаємодіють органічні речовини з неорганічними, застосовуються методи, характерні для мікробіологічного зброджування сировини (цукру, патоки, меляси), які завершує частозастосовувана в органічній та неорганічній технології обробка вапном утвореної суміші розчинів лимонної, щавлевої, глюконової з домішкою інших органічних кислот з осадженням і фільтруванням цитрату і оксалату кальцію. Далі відбуваються обробка цитратів кальцію (екстракція лимонної кислоти в розчин) із застосуванням сірчаної кислоти, внесення інших неорганічних сполук для глибокого очищення кінцевого продукту - високоякісної харчової або реактивної кислоти - від заліза, важких металів та інших домішок. Очищений розчин лимонної кислоти концентрують і охолоджують для випуску продукту, що відповідає вимогам ГОСТ [14].



4. Визначення показників росту під час періодичного культивування мікроорганізмів

Завдання 1: Визначити (рис 4.1):

- швидкість росту (м) між 8 та 12 год. культивування;

- рівень біомаси;

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація етанолу в середовищі становить 1,5 % (за об'ємом);

- тривалість лаг-фази.

Рис. 4.1 Крива росту бактеріальних популяцій

Швидкість експоненційного росту - це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою (4.1) виходячи з початкової та кінцевої біомаси Х_о та Х_t у моменти часу t_o та t [9]:

де lg e = 0,43429.

Згідно з умовою t = 12 год., t₀ = 8 год. Визначаємо (за графіком) концентрацію біомаси у момент часу t та t₀: Х_t = 2,5 г/л; Х_о = 1 г/л.



Рис.4.2 Визначення швидкості експоненційного росту

Отже, швидкість росту дорівнює

Рівень біомаси (концентрація біомаси) - це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

Цю величину виражають у грамах (міліграмах) сухої речовини, яка міститься у літрі (мілілітрі) культуральної рідини або клітинної суспензії. Згідно наведеного графіку вихідний рівень біомаси становить 0,5 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту - 4 г/л. Отже, згідно з рівнянням (4.2) концентрація біомаси становить [4]:



Рис.4.3 Визначення рівня біомаси

Економічний коефіцієнт. Важливим показником періодичного процесу є відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату - Х/S. Якщо ці дві величини виражені в вагових одиницях, то відношення Х/S називають економічним коефіцієнтом (Y). Економічний коефіцієнт також може бути розрахований також як відношення біомаси до заданого субстрату. Якщо врожай в грамах відноситься до кількості молей спожитого субстрату, то одержану величину називають молярним економічним коефіцієнтом [91].

Згідно з умовою початкова концентрація етанолу у середовищі становить 1,5 %, або 15х0,79=11,85 г/л. Рівень біомаси становить 3,5 г/л, отже економічний коефіцієнт:

Оскільки економічний коефіцієнт набуває малого значення, то можна зробити висновок, що вирощувати мікроорганізми на поживному середовищі з такою концентрацією не ефективно, оскільки це вказує на велику кількість не використаного джерела живлення.

Тривалість лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси X_r, і моментом t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст.

На реальній кривій росту (Рис.4.4) проводять теоретичну криву.

Рис. 4.4. Розрахунок тривалості лаг-фази

Тривалість лаг-фази визначають за формулою (4.3):

(4.3)

(4.4)

За умовою X₀ = 0,5 г/л; приймаємо X_r таким, що дорівнює 2 г/л. На реальній і теоретичній кривих визначають час t_r та t_t, потрібний для досягнення 2 г/л біомаси: t_r = 10,7 год, а t_t = 5 год. Швидкість росту м розраховують за формулою (4.4) для реальної кривої в інтервалі часу t_r = 10,7 год, а t_t = 5 год. За реальною кривою визначають X_r = 2 г/л; X_t = 0,7 г/л.



Отже, швидкість росту:

Знаючи швидкість росту, можна визначити тривалість лаг-фази:

год.

Отже, тривалість лаг-фази становить 8,17 год. З отриманого значення можна зробити висновок, що пристосування до нових умов культивування після інокуляції відбувається довго, що є недопустимим для виробничого процесу. Існують наступні шляхи скорочення тривалості лаг-фази:

- середовище для отримання посівного матеріалу і для виробничого процесу має бути однаковим за складом;

- як посівний матеріал потрібно використовувати клітини культури із середини експоненційної фази;

- при внесенні субстрату з інокулятора, не вносити його повністю, а розділити на дві частини: одну внести у ферментер відразу, іншу поступово додавати у реактор (тобто підживлювати середовище).

Завдання 2: Назвіть тип живлення, якщо джерелом енергії є лактат, джерелом вуглецю - СО₂, а донором електронів - Н_2.

У класифікації типів живлення у мікроорганізмів використовують термінологію, запропоновану у 1946 р. на симпозіумі у Колд Спринг Харбор. Розглядають типи живлення (трофії) щодо:

1) джерела енергії (хемо - хімічне, фото - світлове);

2) донора електронів (органо - органічна речовина, літо - неорганічна; неорганічними донорами електронів є Н₂, NH₃, H₂S, S, CO, Fe²⁺ та ін.);

3) джерело вуглецю (авто - вуглекислота, гетеро - органічна сполука).

Отже, згідно з умовою завдання, щодо джерела енергії (лактат, хімічна сполука) тип живлення визначають як хемотрофію, щодо донора електронів (водень, неорганічна сполука) - як літотрофію, а щодо джерела вуглецю (СО₂, неорганічна сполука) - як автотрофію [9].

Висновок: даний тип живлення є хемолітоавтотрофним.

Хемолітоавтотрофи -- порівняно невелика група прокаріот, які отримують енергію та електрони шляхом окиснення відновлених неорганічні речовини, фіксують вуглекислий газ. Як енергетичні субстрати може використовуватись сірководень (Beggiatoa), сірка (Thiobacillus thiooxidans), аміак (Nitrosomonas), водень (Hydrogenomonas), залізо (Thiobacillus ferrooxidans), чадний газ (Pseudomonas carboxydohydrogena). Як правило, до хемолітоавтотрофів належать водневі метаноутворювальні, нітрифікуючі і ацетогенні бактері, а також залізобактерії.

Ця група бактерій важлива для забезпечення колообігу елементів в екосистемах, зокрема перетворення аміаку в нітрати, сірки і сульфідів у сульфати. Деякі хемолітотрофи можуть бути і гетеротрофними [15].

Завдання 3: Визначити константу швидкості поділу (н) та тривалість генерації (g), якщо початкова концентрація клітин становить 10², а через 8 год. - 10⁹.

Бактерії розмножуються бінарним поділом, тому їх кількість збільшується в геометричній прогресії: 2⁰ > 2¹ > 2² > 2³ >…2ⁿ. Якщо на одиницю об'єму періодичної культури, що росте, припадає N₀ клітин, то після n поділів кількість клітин стане N₀*2ⁿ. Логарифмуючи, отримаємо:

(4.5)

звідки кількість клітинних поділів:

(4.6)



Кількість клітинних поділів за 1 год (константа швидкості поділу н) визначають за формулою (4.7):

(4.7)

Час, потрібний для одного циклу поділу (тривалість генерації g), визначають за формулою (4.8):

(4.8)

Якщо за 8 год кількість клітин у суспензії збільшується з 10² до 10⁹, то константа швидкості поділу:

,

де lg 2 = 0,301

Тривалість генерації становить: g = 1/н = 1/ 2,9 = 0,34 год.

Клітинні популяції, яким властива дана тривалість генерації, надзвичайно швидко ділиться, що вказує на те, що клітини вже адаптувалася до даних умов культивування. Це свідчить про високу придатність даного середовища для росту, а також, про наявність достатньої кількості потрібних ферментів для їх засвоєння.



5. Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів

Завдання 1. Чи правильно вказаний склад поживного середовища (г/л)? Якщо так, для вирощування яких мікроорганізмів це середовище може бути використане?

Дано (г/л):

· Етанол - 0,1 % (за об'ємом)

· NH4N0₃- 2,8;

· KH₂PO₄ - 2,0;

· CaCl2x2H₂O - 0,05;

· MgSO₄x7H₂O - 1,0;

· FeCl3x6H₂O - 0,001;

· Дріжджовий автолізат - 0,5 % (за об'ємом).

Поживні середовища, на яких вирощують мікроорганізми, мають відповідати таким мінімальним вимогам: у них мають бути присутні всі елементи, з яких будується клітина, при чому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні їх засвоювати.

До складу бактеріальної клітини входять такі елементи, % до маси сухої речовини:

· вуглець - 50;

· кисень - 20;

· азот - 10-14;

· водень - 8;

· фосфор - 3;

· сірка, калій, натрій - 1;

· кальцій, магній, хлор - 0,5;

· залізо - 0,2;

· решта елементів - близько 0,3.

Тільки невелика кількість елементів періодичної системи потрібна мікроорганізмам у відносно високих концентраціях (?10^-4 M). Це десять головних біологічних елементів: вуглець, кисень, водень, азот, сірка, фосфор, калій, магній, кальцій та залізо (табл.5.1) [4].

Таблиця 5.1 - Десять головних біоелементів, їх джерела і деякі функції

Елемент	Джерело	Функції в метаболізмі
C	Органічні сполуки, CO2	Основні компоненти клітинного матеріалу
O	O2,H2O, органічні сполуки, CO2	Те саме
H	H2, H2O, органічні сполуки	Те саме
N	NH4+, NO3-, N2, органічні сполуки	Те саме
S	SO42-, HS- , S0, S2O32- , органічні сполукисірки	Компонент цистеїну, метіоніну, тіамінпірофосфату, коферментуА, біотину та б-ліпоєвої кислоти
P	HPO42-	Компонент нуклеїнових кислот, фосфоліпідів та нуклеотидів
K	K+	Основний неорганічний катіон у клітині, кофактор деяких ферментів.
Mg	Mg2+	Кофактор ферментів, присутній у клітинних стінках, мембранах та ефірах фосфорної кислоти
Ca	Ca2+	Кофактор ферментів, входить до складу екзоферментів, Са2+ -дипіколінат є важливим компонентом ендоспор
Fe	Fe2+, Fe3+	Міститься в цитохромах, фередоксинах, кофактор ферментів.

Крім десяти головних біоелементів, мікроорганізмам необхідні мінорні біоелементи (табл. 5.2), джерелом яких, як правило, є водопровідна вода.

Таблиця 5.2 - Мінорні біоелементи, їх джерела та функції в клітині

Елемент	Джерело	Функції в обміні речовин
Zn	Zn2+	Міститься у ферментах (алкогольдегідрогеназа, лужна фосфатаза, альдолаза, PHK- та ДНК-полімераза)
Mn	Mn2+	Міститься у бактеріальній пероксиддисмутазі, кофактор ферментів
NaCl	Na+Cl-	Необхідні галофільним бактеріям
Mo	MoO42-	Міститься у ферментах (нітратредуктаза, нітрогеназа, форміатдегідрогеназа)
Se	SeO32-	Міститься у ферментах (гліцинредуктаза, форміатдегідрогеназа)
Co	Co2+	Міститься у коферменті вітамін-В12-ферментів (глутаматмутаза, метилмалоніл-КоА-мутаза)
Cu	Cu2+	Міститься в цитохромоксидазах та оксигеназах
W	WO42-	Міститься в деяких форміатдегідрогеназах
Ni	Ni2+	Міститься в уреазі, необхідний для автотрофного росту водневих бактерій

В середовищі наведеного складу:

§ етанол (С₂Н₅ОН) є джерелом енергії, електронів, вуглецю, кисню та водню, які є основними компонентами клітини;

§ нітрат амонію (NH₄NO₃) - азоту, гідрогену, оксисену;

§ дигідрофосфат калію (KH₂PO₄) - калію, фосфору, гідрогену, оксисену;

§ хлорид кальцію (CaCl₂x2H₂O) - кальцію, хлору;

§ сульфат магнію (Mg SO₄x7H₂O) - магнію та сульфуру;

§ хлорид феруму (III) (FeCI₃x6H₂O) - феруму;

§ дріжджовий автолізат - амінокислот, вітамінів.

З необхідних 10 головних біоелементів у даному середовищі присутні всі. Отже, поживне середовище наведеного складу повністю придатне для вирощування мікроорганізмів. Наявність дріжджового автолізату свідчить про можливість росту на даному поживному середовищі не лише прототрофів, яким не потрібні додаткові фактори росту, а й ауксотрофам, які самі не синтезують факторів росту, таких як вітаміни та амінокислоти з органічних і мінеральних сполук.

Як приклад, можна привести мікроорганізми, що ростуть на етанолі: Rhodococcus erythropolis, Saccharomyces cerevisiae, бактерії роду Acinetobacter, вони добре ростуть на середовищі з етанолом без додавання вітамінів. Етанол є хорошим джерелом вуглецю для виробництва лізину і глутамінової кислоти з використанням Brevibacterium і Corynebacterium. Дріжджовий екстракт - багате середовище, яке дозволяє рости широкому спектру бактерій, дріжджів і цвілевих грибів, наприклад: Pseudomonas fluorescens, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes [4,16].

Завдання 2. Концентрація хлориду амонію в середовищі для вирощування бактерій становить 0,9 г/л, а сахарози - 0,2 М. Розрахуйте теоретично можливий рівень біомаси.

Вміст азоту в біомасі бактерій становить 10-14 % від маси сухої речовини. Під час культивування на середовищі з 0,9 г/л хлориду амонію (NH₄Cl) для визначення рівня біомаси бактерій, потрібно спочатку розрахувати вміст в даній солі елементарного азоту. Молекулярна маса солі NH₄Cl дорівнює:

M (NH₄Cl) =14+4+35,5=53,5 г/моль.

Отже, у 53,5 г хлориду амонію міститься 14 г азоту (N). А в 0,9 г цієї солі вміст азоту дорівнює:

53,5 г (NH₄Cl) - 14 г (N)

0, 9 г (NH₄Cl) -Х г (N)

Лише 10% азоту міститься в клітині, а інші 90% окислюються. Тому з 0,23г азоту можна одержати 2,3 г/л біомаси.

Сахароза в поживному середовищі є джерелом вуглецю. Вміст вуглецю у біомасі складає 50 % від маси сухої речовини. Для визначення рівня біомаси, якого можна досягнути при культивуванні бактерій на середовищі з 0,2 М глюкози, потрібно спочатку розрахувати вміст вуглецю в даній сполуці. Молекулярна маса сахарози C₁₂H₂₂O₁₁ дорівнює:

M (C₁₂H₂₂O₁₁) =12·12+22+11·16=342 г/моль.

Вміст елементарного карбону у сахарозі становить:

де 12 - кількість молекул вуглецю у сахарозі, 68,4 - концентрація сахарози (0,2 М), 12 - молекулярна маса однієї молекули вуглецю. Оскільки 50 % вуглецю окислюється, то залишається лише половина, тобто 14, 4 г.

Отже, з 68,4 г/л сахарози може утворитися 28,8 г/л біомаси.

Якщо у біомасі міститься 50 % вуглецю, половина якого йде на побудову клітини, а інша половина витрачається в процесі дихання, то з 28,8 г сахарози можна одержати 28,8 г/л біомаси.

Порівнюючи рівень біомаси, розрахований за вуглецем та азотом, визначила, що лімітуючим фактором є кількість азоту в середовищі. Оскільки неможливо з такої кількості вуглецю отримати таку ж кількість біомаси , що й з азоту.

Метою біотехнологічного виробництва є отримання максимальних результатів при мінімальних затратах, то можливо розрахувати кількість сахарози, яку необхідно внести в середовище без зміни виходу біомаси.

Рівень біомаси - 28,8 г/л. Звідси маса сахарози, яку треба вносити - 2,3 г/л.

68,4 г (C₁₂H₂₂O₁₁) - 28,8 г/л (С)

Y г (C₁₂H₂₂O₁₁) - 2,3 г/л (С)

Отже, в середовище можна внести не 0,2 М сахарози, а 0,02 М. Це буде економічно вигіднішим і не приведе до втрат біомаси.



6. Енергетичний баланс окиснення субстрату

Завдання 1. Скласти енергетичний баланс окиснення глюкози за наступних умов:

а) катаболізм глюкози здійснюється через глюконат;

б) Р/О = 1;

в) глюконокіназа відсутня.

Аналіз окисно-відновних потенціалів (табл. 6.1) показує, що у дихальному ланцюгові є тільки три етапи окиснення, на яких вивільнюється стільки енергії, скільки міститься в одному макроергічному зв'язку. При перенесенні двох протонів від НАДН на кисень тільки три електронні переходи можуть бути спряжені з фосфорилюванням АДФ у АТФ. Такий зв'язок окиснення та фосфорилювання виражають у вигляді коефіцієнта Р/О [4]. Р/О - це кількість молекул АТФ, утворюваних у розрахунку на один атом кисню. У мітохондріальному дихальному ланцюгові цей коефіцієнт дорівнює трьом, якщо донором електронів є НАДН, і двом, якщо - ФАДН. Відомі навіть пункти утворення АТФ (табл. 6.1): дегідрування НАДН, окиснення цитохрому b та окиснення цитохрому а. Знаючи співвідношення Р/О, можна скласти енергетичний баланс окиснення субстрату.

Таблиця 6.1 - Окисно-відновні потенціали компонентів дихального ланцюга, різниця потенціалів та еквівалентні зміни вільної енергії

Компоненти дихального ланцюга	Окисно-відновний потенціал(Е0), В	Різниця потенціалів, В	Зміна вільної енергії (-ДG01), кДж/моль
Водень	-0,42	0,10 0,24 0,04 0,31 0,02 0,52	19,3 46,4 7,7 59,8 3,8 100,4
НАД+	-0,32
Флавопротеїн	-0,08
Цитохром b	-0,04
Цитохром с	+0,27
Цитохром а	+0,29
Кисень	+0,81



З цієї таблиці ми бачимо, що необхідна для синтезу АТФ енергія в достатній кількості виділяється на трьох етапах, а саме:

- дегідрування НАДН;

- окиснення цитохрому b;

- окиснення цитохрому a.

Якщо ми знаємо скільки дорівнює Р/О, то ми можемо скласти енергетичний баланс окиснення субстрату.

За умовою Р/О = 1, це означає, що при проходженні електрона дихальним ланцюгом утворюється 1 молекула АТФ. Також ми можемо визначити скільки АТФ утворюється з НАД і ФАД (табл.6.2.)

Таблиця 6.2 - Відповідність кількості АТФ, що приходиться на ФАД і НАД

Р/О	НАД, (мол.АТФ)	ФАД, (мол.АТФ)
1	1	1
2	2	1
3	3	2

За умовою завдання катаболізм глюкози здійснюється через глюконат, Р/О = 1, глюконокіназа відсутня. Схема розщеплення глюкози складається з трьох етапів:

- розщеплення через глюконат (рис. 6.1)

- КДФГ - шлях ( Ентнера-Дудорова) (рис. 6.2)

- цикл трикарбонових кислот (рис. 6.3)



Шлях Ентнера-Дудорова

Рис.6.1.Катаболізм глюкози. Розщеплення через глюконат:

ферменти: 1 - НАД(Ф)-залежна глюкозодегідрогеназа; 2 - НАД(Ф)-залежна глюконатдегідрогеназа; 3 - 2-кетоглюконокіназа; 4 - 2-кето-6-фосфоглюконатредуктаза.

Глюкоза 2НАД(Ф)Н+НАД(Ф)

Оскільки в умовах завдання вказано, що глюконокіназа відсутня, то ми можемо побачити яким шляхом йде катаболізм (рис.6.1.).

Далі катаболізм йде шляхом Ентнера-Дудорова (рис.6.2.)



Рис.6.2. Катаболізм глюкози. Шлях Ентнера-Дудорова: ферменти: 1 - фосфоглюконатдегідратаза; 2 - альдолаза; 3 - гліцералдегідфосфатдегідрогеназа; 4 - фосфогліцераткіназа; 5 - гліцератфосфомутаза, фосфогліцератфосфомутаза та енолаза; 6 - піруваткіназа.

Сумарна реакція розчеплення глюкози за КДФГ-шляхом (починаючи з 6-Фосфоглюконату) має вигляд:

6-Фосфоглюконату 2 Піруват +НАДН+2АТФ



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.6.3.Цикл трикарбонових кислот

Далі ми можемо побачити, що на виході у нас є дві молекули пірувату, які надалі включаються у ЦТК (рис.6.3.)

Ферменти: 1 - піруватдегідрогеназа; 2 - цитратсинтаза; 3 - аконітаза; 4 - ізоцитратдегідрогеназа; 5 - 2-оксоглутаратдегідрогеназа; 6 - сукцинат-тіокіназа; 7 - сукцинатдегідрогеназа; 8 - фумараза; 9 - малатдегідрогеназа [5].

Стехіометрія ЦТК:

2 Піруват 6НАДН + 2ФАДН + 2АТФ

Складаємо енергетичний баланс окиснення глюкози:

Згідно з умовою Р/О=1, тобто кількість моль АТФ, утворюваних з 1 моль НАДН буде дорівнювати 1, а з одного моль ФАДН буде утворюватися 1 моль АТФ.

На 1 моль використаної глюкози кількість утворених відновлюваних еквівалентів (НАДН та НАДФН) становить:

1) при окисненні глюкози до глюконату - 1 моль НАДФ;

2) за шляхом Ентнера-Дудорова - 1 НАДН;

3) при окисненні Піруват до Ацетил-КоА - 2 НАДН;

4) у ЦТК - 6 НАДН, 2 ФАДН.

За умовою завдання Р/О дорівнює 1, тоді з 1 моль НАДН утворюється 1 моль АТФ, а з 1 моль ФАДН - 1 моль АТФ. Отже, кількість АТФ становить:

1+1+2+6+2 = 12 моль АТФ.

Якщо сюди ж добавити 1моль АТФ, який утворився при перетворенні глюкози через глюканат (глюконокіназа відсутня), та 2 моль АТФ синтезованих при перетворенні сукциніл-КоА на сукцинат у циклі трикарбонових кислот, одержимо 12 + 3 = 15 моль АТФ.

Отже, при катаболізмі глюкози через глюконат при Р/О = 1, за відсутності глюконокінази утворюється 15 молекул АТФ.



Висновки

1. В ході виконання курсової роботи було охарактеризовано фізіологію росту мікроорганізмів, зокрема, визначено показники, за якими оцінюється ріст популяції бактерій у періодичній культурі. В даному варіанті завдання швидкість експоненційного росту дорівнює 0,229 год^-1. Рівень біомаси становить 3,5 г/л. Для цих результатів економічний коефіцієнт складає 29 %. Тривалість лаг-фази становить 8,17 год.

2. Встановлено тип живлення: згідно з умовою завдання, щодо джерела енергії (лактат, хімічна сполука) тип живлення визначають як хемотрофію, щодо донора електронів (водень, неорганічна сполука) - як літотрофію, а щодо джерела вуглецю (вуглекислота, СО₂, неорганічна сполука) - як автотрофію. Тип живлення є хемолітоавтотрофним.

3. Константа швидкості поділу () та тривалість генерації (g) відповідно становлять 2,9 = 0,34 год.

4. Досліджено склад даного поживного середовища і виявлено, що в ньому присутні всі 10 головних біоелементів, що свідчить про придатність вирощування більшості мікроорганізмів на даному середовищі. Наявність дріжджового автолізату свідчить про можливість росту не лише прототрофів, а й ауксотрофів.

5. Теоретично можливий рівень біомаси становить 28,8 г/л.

6. При катаболізмі глюкози через глюконат при Р/О = 1, за відсутності глюконокінази утворюється 15 молекул АТФ.

7. Найкращим продуцентом лимонної кислоти є C.lipolytica, адже дані дріжджі характеризується високою стабільністю синтезу лимонної кислоти, здатні до культивування на н-алканах, газойлі та інших фракціях нафти, є психотолерантними і солестійкими.



Список літератури

1. Герасименко В.Г., Цвіліховський М.І. Біотехнологія: Підруч. - К.: Фірма «Інкос», 2006. - 647 с.

2. Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України (1921-19211). Віки історії та сучасність. - К.: Альтерпрес, 2011. - 442 с.

3. О. В. Швед, О. Б. Миколів, О. З. Комаровська-Порохнявець, В. П. Новіков. Екологічна біотехнологія: Навчальний посібник. - 2-е вид. - Львів: Львівська політехніка, 2010. - 368 с.

4. Пирог Т.П., Ігнатова О.А. Загальна біотехнологія // Підручник. - К.: НУХТ. - 2009. - 336 с.

5. Пат. № 2096461 РФ, C12P7/48, C12N1/16, C12P7/48, C12R1:73. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты и способ получения лимонной кислоты / Т.В. Финогенова. - Опубл. 20.11.1997.

6. Емельянова. Е.К. Микроорганизмы природных биоценозов для биоремедиации почв и водных объектов Сибири, загрязненных нефтепродуктами: Дис....канд. биол. наук. - Кольцово, 2009. - 143 с.

7. Кухар Е.В. Микробиологические основы пищевых и биотехнологических производств. - Астана.: Микроб. основы пищевых и биотехнологических производств, 2014. - 115 с.

8. Пат. № 2090611 РФ, C12N1/16, C12P7/48, C07C59/265, C12N1/16, C12R1:73. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент лимонной кислоты, способ получения лимонной кислоты и способ выделения цитрата натрия / Е.Н. Арзуманов. - Опубл. 20.09.1997.

9. Пирог Т.П. Загальна мікробіологія: Підручник. - К.: НУХТ, 2004. - 471 с.

10. Пат. № 2504579 РФ, C12N1/19, C12N1/19. Рекомбинантный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент фитазы / Т.В. Выборная, Т.В.Юзбашев. - Опубл. 20.01.2014.

11. Біологія клітин. Конспект лекцій / Красінько В.О. - К.: НУХТ, 2007.-45-54 с.

12. Glycolysis- Yarrowia lipolytica [Електронний ресурс] // KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. - 2015.

13. Никольского Б.П. Справочник химика. - М.-Л.: Химия, 1964. - 759 с.

14. Павлов К.А. Регулирование фазовых превращений кристаллогидратов сульфата кальция в технологии лимонной кислоты: Дис....канд. техн. наук. - Санкт-Петербург, 2014. - 142 с.

15. Курілов О.В. Гідробіологія / Конспект лекцій. - Одеса: Одеський державний екологічний університет, 2009. - 202 с.

16. Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В. Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - 39. №2. - С. 180-188

Размещено на Allbest.ru

...