Тенденции и перспективы развития современной биотехнологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства и продовольствия России.

Забайкальский аграрный институт-филиал ФГБОУ ВО

‹‹Иркутский государственный аграрный университет им. А.А. Ежевского›.

Технологический факультет

Кафедра: Технология производства и переработка сельскохозяйственной продукции.

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

По дисциплине Сельскохозяйственная биотехнология

Выполнил: Бутина Э.В.

Проверил: Циренова В.В.

Чита-2017



Содержание

1. Определение термина биотехнология. История возникновения, становления и развития биотехнологии как самостоятельной науки

2. Задачи современной биотехнологии, тенденции и перспективы ее развития

3. Культуры соматических клеток растений. Этапы каллусогенеза. Методы культивирования клеток и тканей растений

4. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном

5. Создание безопасных вакцин против вируса гепатита В

6. Ферменты, используемые при создании рекомбинантных ДНК. Способы конструирования рекомбинантных ДНК



1. Определение термина биотехнология. История возникновения, становления и развития биотехнологии как самостоятельной науки

Предмет биотехнологии. Что же включает в себя понятие биотехнологии? Этот термин происходит от греческих слов bios -- жизнь, techne -- искусство, logos -- слово, учение, наука. В литературе есть множество его определений.

· Биотехнология -- объединение биохимии и микробиологии, инженерных дисциплин для технологического использования микроорганизмов, культуры клеток, тканей и отдельных структур клетки.

Биотехнология -- наука об использовании биологических процессов в технике и промышленном производстве.

· Биотехнология -- промышленное использование биологических процессов на основе микроорганизмов, культуры клеток и тканей, а также отдельных структур и компонентов клеток животных и растений с заданными свойствами.

Из приведенных определений ясно, что как бы ни стремились точнее передать значение термина «биотехнология», остается ясным одно -- эта наука рождена усилиями многих дисциплин, изучающих живую материю, и соответствует социальному заказу современного человека.

История развития биотехнологии. Биотехнология формировалась и эволюционировала с развитием человеческого общества. Ее становление ряд ученых условно подразделяют на 4 периода (Блинов Н. П., 1995):

1. эмпирический,

2. этиологический,

3. биотехнический,

4. генотехнический.

Эмпирический (от греч. empeirios -- опытный), или доисторический, период -- самый длительный, охватывающий примерно 8 ООО лет, из которых более 6 ООО лет -- до нашей эры и около 2 ООО лет -- нашей эры. Древние народы интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к разряду биотехнологических. В те древние времена продукты растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. К этому же периоду относятся:

· получение кисломолочных продуктов,

· квашеной капусты,

· медовых алкогольных напитков,

· силосование кормов,

· мочка лубоволокнистых растений.

Таким образом, исстари народы пользовались результатами микробиологических процессов, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и для практики применения полезных растений и животных.

Второй, этиологический (от греч. aitia -- причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX в. и первую треть XX в. (1856 -- 1933 гг.). Этот этап связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 -- 1895) -- основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). Он:

· раскрыл микробную природу брожений,

· доказал возможность жизни в бескислородных условиях,

· экспериментально опроверг представление о самопроизвольном зарождении живых существ,

· создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии,

· предложил метод стерилизации, называемый теперь пастеризацией, и т. д.

В биотехнологии важными являются питательные среды для культивирования ряда биообъектов. Уже в 1859 г. Л. Пастер приготовил первую жидкую питательную среду, метод выращивания грибов на желатине предложил О. Брефельд в 1864 г.

Третий период в развитии биологической технологии -- биотехнический, обусловленный внедрением в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудования, обеспечившего протекание различных процессов в стерильных условиях. Особенно мощный толчок в разработке промышленного биотехнологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (во время Второй мировой войны, 1939 -- 1945 гг., когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфицированными ранами). Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудования, в том числе главного из них -- биореакторов, которые используют и в настоящее время.

Четвертый период в биотехнологии -- генотехнический (от лат. genos -- род) -- начался в 1972 г., когда П. Берг со своими сотрудниками в США создал первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с коллегами выделила в химически чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем самым возможность направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было бы невозможным достижение современных результатов в области биотехнологии.

Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК, выделение и изучение специфичных ферментов привели к формированию строго научного подхода к разработке биотехнологических процессов на основе генно-инженерных работ.

В этом -- суть генотехнического периода.

Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин, выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусственно встроенную генетическую информацию об этом гормоне Зная строение аппарата наследственности у разных организмов, удается манипулировать не только нуклеиновыми кислотами, но и целыми хромосомами (хромосомная инженерия) и клетками (клеточная инженерия).

2. Задачи современной биотехнологии, тенденции и перспективы ее развития

Основные цели и задачи биотехнологии:

1. Активация и поддержание путей обмена клеток, ведущих к накоплению заданных продуктов при доминировании над другими реакциями обмена у культивируемого организма.

2. Получение клеток или их составных частей (преимущественно ферментов) для направленного изменения сложных молекул (например, рестриктазы, изомеразы, пенициллинамидазы).

3. Углубление и совершенствование форм рДНК для биотехнологии и клеточной инженерии с целью получения особо ценных результатов в фундаментальных и прикладных разработках.

4. Создание безотходных и экологически безопасных биотехнологических процессов.

5. Совершенствование и оптимизация аппаратурного оформления биотехнологических процессов с целью достижения максимального выхода конечных продуктов при культивировании естественных видов с измененной наследственностью методами клеточной и генной инженерии.

6. Повышение технико-экономических показателей биотехнологических процессов по сравнению с существующими.

Также в задачи биотехнологии входит создание и широкое освоение:

1. новых биологически активных веществ (БАВ) и лекарственных препаратов для медицины (интерферона, инсулина, гормонов, моноклональных антител), позволяющих осуществить раннюю диагностику и лечение тяжелых заболеваний; микробиологических средств защиты растений от болезней и вредителей, бактериальных удобрений и регуляторов роста культур; новых высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторам внешней среды сортов и гибридов;

2. ценных кормовых добавок и БАВ для повышения продуктивности животноводства;

3. новых методов биоинженерии для эффективной профилактики, диагностики и терапии основных болезней сельскохозяйственных животных;

4. новых технологий получения хозяйственно-ценных продуктов для использования в пищевой, химической, микробиологической и др. отраслях промышленности;

5. технологий глубокой и эффективной переработки сельскохозяйственных, бытовых и промышленных отходов, использования сточных вод для производства биогаза и высококачественных удобрений.

Эти задачи определяют перспективы развития биотехнологии.

Сегодня уже известны примеры вживления в организм человека микрочипов, клонирование человеческих органов находится в стадии разработки, а разработанные бионические конечности достигли уровня имитирования движений человека, кроме того существуют специальные костюмы которые помогают парализованным людям передвигаться, но пока они находятся на стадии тестирования. Помимо технологий для человеческого тела, специалисты биотехнологий разрабатывают возможности увеличения количества белка в растениях, что позволит в будущем отказаться от мяса. Для агрокомплекса ведутся разработки в направлении усовершенствования функций самозащиты растений от насекомых-вредителей, посредством выделения яда. В медицине разрабатываются вакцины против известных болезней, кроме того исследуется область омоложения клеточного уровня человека, что позволит замедлить старение. В промышленном секторе биотехнологии используются для получения биотоплива и биогаза, что снизит загрязнение окружающей среды и сократит размеры использования природных ресурсов. Таким образом, развитие биотехнологических методов существенно изменит жизнь человека в лучшую сторону, посредством повышения качества пищи, использования новых медицинских препаратов, а также понижения уровня загрязнения экологии планеты.

биотехнология клетка растение соматический

3. Культуры соматических клеток растений. Этапы каллусогенеза. Методы культивирования клеток и тканей растений

В основе культивирования растительных клеток лежит свойство тотипотентности, благодаря которому соматические клетки растения способны полностью реализовать наследственную информацию, то есть обеспечить развитие всего растения. Следует отметить, что в отличие от животной, растительная клетка предъявляет менее жесткие требования к условиям культивирования.

Изменяя условия (добавляя в состав питательной среды те или иные гормоны), можно вызвать дифференциацию недетерминированных клеток. Культура растительной ткани позволяет получить многочисленные популяции в сравнительно короткое время и в ограниченном пространстве. Клетки в условиях in vitro лишаются очень многих важных взаимодействий, которые определяют их судьбу и дифференциацию в целом организме. В определенных пределах дифференциация культивируемых клеток поддается контролю со стороны экспериментатора.

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллус. Каллусная ткань - один из видов клеточной дифференцировки, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток органов растения. У растений в природе каллусная ткань возникает в исключительных обстоятельствах (например, при травмах) и функционирует непродолжительное время. Эта ткань защищает место поражения, может накапливать питательные вещества для анатомической регенерации или регенерации утраченного органа.

Основные этапы получения каллусных культур

Выбор экспланта.

· Двудольные травянистые.

· Однодольные травянистые.

· Зерновые культуры.

· Голосемянные.

Каллусы двудольных растений могут быть легко получены из:

· отрезков стебля и корней;

· изолированных фрагментов паренхимы тканей клубня;

· сердцевины стебля;

· мезофилла листа;

· органов цветка (завязи, пыльцы)

Каллусы однодольных растений обычно получают из:

· зародышей;

· отрезков основания стебля;

· корней.

Подбор питательной среды, условий культивирования.

Стерилизация растительного материала:

· престерилизация,

· стерилизация,

· постстерилизация.

Изоляция эксплантов (минимальный критический размер экспланта). Перенос стерильных эксплантов на питательную среду.

Герметизация

Культивирование:

· наращивание первичного каллуса;

· субкультивирование - перенос трансплантана свежую питательную среду. В оптимальных условиях осуществляется через 3-4 недели.

Отбор каллуса:

· для решения фундаментальных проблем биологии;

· для биотехнологических целей.

Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro можно разделить на 2 группы:

· вспомогательные технологии,

· вторая группа методов.

Она ведет к самому, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений. Оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости) проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение м/у выбранными парами в естественных условиях. Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами:

· культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой;

· завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи кото?ы? или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца.

Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш не ?переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению.

Преодоление постгамной несовместимости. Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндос?ерма.

Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Эмбриокультура дает возможность вырастить гибридные растения из неполноценных зародышей. Однако выход гибридных растений мал, и гибриды часто бывают стерильны. Получение гаплоидов in vitro и использование их в селекции. Роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет быстрее найти нужную комбинацию, сокращает время для создания сорта. Гаплоиды используются для получения стабильных гомозиготных линий. Для мутагенеза также удобнее использовать гаплоиды, поскольку на гаплоидном уровне облегчается отбор рецессивных мутаций.

Криосохранение растений. Криосохранение соматических клеток растений в жидком азоте (тем?ература - 196° С) - новое направление в биотехнологии, которое широко стало развиваться с начала 70-х годов XX столетия. Цель данной технологии заключается в сохранении в культуре in vitro генофонда.

Клеточная селекция растений: сомаклональная вариабельность. Метод культуры изолированных клеток, тканей и органов растений in vitro, широко используемый для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений, сегодня находит все большее применение и при создании новых биотехнологий Клеточные изменения могут происходить в изолированных клетках, растущих на искусственных питательных средах, и причины, их вызывающие. С разработкой техники получения растений-регенерантов из каллусной ткани появилась возможность получать новые формы растений, отличающиеся как по фенотипическим, так и по генетическим признакам от исходных растений.

Селекция растений на клеточном уровне. Значительный интерес представляет вопрос об использовании клеточной селекции в комплексе с получением сомаклонов.

Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для с/х - возможность на основе сомаклональных вариаций или индуцированных мутаций отбирать в жестких селективных условиях клетки, характеризующиеся искомыми признаками.



4. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном

Завершающим этапом молекулярного клонирования является идентификация тех клеток-реципиентов, которые несут встроенный ген-мишень. Эффективность выбранного метода отбора определяет успех генно-инженерного проекта. Необходимо при этом учитывать, что не все клетки являются трансформированными и несут необходимый ген. Поэтому отбор обычно проводят в два этапа.

На первом этапе отбирают клетки, несущие соответствующий вектор, использованный для переноса генетической информации. Чаще всего клетки-реципиенты выделяют по тем маркерам, которые несет встроенный вектор. В случае применения в качестве вектора плазмиды pBR322, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам, отбор трансформированных клеток можно вести на агаризованиой среде, содержащей ампициллин или тетрациклин, в которой эти клетки формируют колонии, и дальнейший отбор проводят уже среди них.

Помимо обнаружения клеток, трансформированных соответствующим вектором, существует необходимость отобрать среди них те, которые не только несут вектор, но и нужный ген -- ген-мишень.

Поэтому по завершении первого этапа идентификации приступают ко второму, на котором используют две группы методов, описанных ниже. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов. Определение гена-мишени проводят двумя способами:

· прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК (по методу Максама -- Гилберта или по методу Сейгера);

· гибридизационный анализ с соответствующей ДНК/РНК.

Методы, основанные на выявлении признака, кодируемого геном-мишенью:

· иммунологическая детекция;

· культивирование селективных питательных сред;

· определение по продукту гена-мишени.

Прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят, как уже было сказано выше, либо по методу Максама -- Гилберта, либо по методу Сейгера. Их отличие заключается в следующем.

В первом используется принцип химической модификации нуклеотидных оснований ДНК с последующим выщеплением олигонуклеотида по модифицированному остатку. Полученный набор коротких олигонуклеотидов с различными концевыми основаниями и различной длины разделяют электрофоретически и идентифицируют при помощи радиоавтографии.

В методе, предложенном Сейгером, набор коротких нуклеотидов получают не химической модификацией, а при помощи ДНК-полимеразной реакции. При этом вместе с обычными нуклеотидами в синтезе используют терминирующие дидезоксирибо нуклеотиды.

Вторая рассматриваемая группа основана на идентификации признака, кодируемого геном, и включает следующие методы.

1. Непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок (продукт встроенного гена). При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности.

2. Отбор клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые встроенным геном. Так, например, отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяций клеток, трансформированных смесью химерных плазмид.

3. Использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень. Например, если встроен ген Р-галактозидазы, то клетки можно отобрать на среде с лактозой. Иммунологическая детекция. Например, если в клетку встроен ген человеческого белка -- интерферона, то трансформированные клетки можно отобрать при помощи антител к этому белку. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга на основе специфического их взаимодействия с антителами часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизированных бактерий связываются с антителами на диске. Их положение определяют с помощью радиоавтографии.

5. Создание безопасных вакцин против вируса гепатита В

Вирус гепатита В вызывает сывороточный гепатит (вирусная болезнь печени). Исход ее трудно прогнозировать. У тяжелых и ослабленных больных заражение происходит:

· при переливании крови,

· через шприцы,

· половым путем.

До недавнего времени против этого вируса не было общедоступной вакцины. Он не размножается in vitro в культуре тканей. Размножение происходит только в организме больного. Поэтому ранее единственным способом его получения было выделение вирусных частиц из крови больных людей, а единственной вакциной служили антитела, выделенные из сыворотки крови носителей вируса. Эти антитела использовались для пассивной иммунизации больных с острой формой гепатита.

В плазме крови зараженных людей содержатся различные количества частиц разного размера и формы:

· сферические и нитевидные частицы диаметром около 22 нм, которые лишены ДНК и являются оболочками вируса;

· частицы Дэйна диаметром 42 нм (они встречаются реже) -- представляют собой вирионы и состоят из оболочки и нуклеокапсида диаметром 27 нм, содержащего молекулы ДНК.

Препараты очищенных нуклеокапсидов служат источником материала для приготовления вакцины, их иммунохимические свойства интенсивно изучаются.

Вирус гепатита В относится к семейству гепаднавирусов.

Его капсид имеет липопротеидную природу, куда входит поверхностный Hbs- белок и Hbs-аптиген (HbsAG). Вирусная оболочка, вероятно, состоит из бислоя липидов, содержащего димеры полипептидов, в которых имеются межмолекулярные и внутримолекулярные дисульфидпые связи, определяющие третичную и четвертичную структуру белка, а также антигенные и иммуногенные свойства HbsAG. Внутри вирионов содержится нуклеотид, образованный ядерным белком HbcAG. Плазма зараженных людей содержит также другой антиген -- HbeAG. Вирусная ДНК включает 3 200 нуклеотидов и состоит из двух цепей:

· одна из которых длинная (L), с фиксированной длиной,

· другая -- короткая (S), с изменяющейся длиной.

Передача вируса гепатита В в естественных условиях или в эксперименте происходит только у шимпанзе и у человека. Его не удается размножать в культуре ткани, а опыты с несколькими видами лабораторных животных оказались безуспешными. Таким образом, изучение биологии вируса было затруднено его узкой специализацией. Его геном клонировали и вводили (весь или по частям) в линии клеток, после чего изучалась экспрессия генов. Так, в 1980 г. Дюбуа с коллегами добился успеха при введении вирусной ДНК в L-клетки мышей. Они обнаружили, что вирусная ДНК интегрировалась в клеточную ДНК и что частицы HbsAG секретировались в культуральную среду без лизиса мышиных клеток.

В 1981 г. Мариарти и его сотрудники создали гибридную молекулу ДНК, содержащую ДНК вируса SV40 и фрагмент ДНК вируса гепатита В. При введении в клетки почек обезьян она обусловливала синтез частиц HbsAG. Клонирование вирусной ДНК в клетках Е. coli и ее последующее введение в линии клеток млекопитающих позволили преодолеть часть трудностей, вызванных отсутствием системы in vitro для размножения вируса.

С другой стороны, синтез HbsAGв прокариотических и эукариотических клетках с использованием клонированной вирусной ДНК, вероятно, помог бы получить другие типы антигенов, возможно, более экономичные и безопасные при производстве вакцин. Так, Раттер (США) получил клетки дрожжей, образующих гликозилированный поверхностный антиген. Был получен также Hbc-белок, выделенный из вирусных частиц и синтезированный под контролем рекомбинантной ДНК в бактериях. Этот белок защищал шимпанзе от последующей инфекции вирусом гепатита В.

Использование техники рекомбинантной ДНК для получения вакцин -- шаг на пути к разработке синтетических вакцин. Несколько групп исследователей синтезировали иммуногенные пептиды, которые, возможно, послужат началом разработки синтетической вакцины против гепатита В. Это два циклических пептида, которые вводили мышам внутрибрюшинно, используя различные адъюванты. Через 7 -- 14 дней после иммунизации были выявлены антитела к поверхности вируса гепатита В.



6. Ферменты, используемые при создании рекомбинантных ДНК. Способы конструирования рекомбинантных ДНК

В генетической инженерии для конструирования рекомбинантных ДНК используется множество различных ферментов. В клетке межнуклеотидные связи в ДНК и РНК расщепляются нуклеазами. В генетической инженерии используют эндонуклеазы рестрикции -- рестриктазы. Эти ферменты распознают в молекулах ДНК определенные нуклеотидные последовательности из четырех, пяти или шести остатков и поэтому расщепляют эту кислоту на сравнительно небольшое число строго определенных фрагментов.

Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coliу введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 г. установлено, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК. В 1969 г. были открыты:

· специфический модифицирующий фермент,

· метилирующий ДНК,

· рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК.

Однако этот фермент не был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности этой кислоты. Вскоре была выделена первая рестриктаза, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК.

Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRl свидетельствует о том, что этот фермент получен из Escherichiacoli. Каждый фермент узнает определенную 4 -- 7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание последней по этим сайтам приводит к образованию:

· либо тупых (например, при действии рестриктазы Hpal),

· либо липких, т. е. перекрывающихся (например, BamHI), концов.

Для конструирования гибридных молекул особенно удобны последние.

Если допустить, что нуклеотиды распределены по молекуле ДНК совершенно случайным образом, можно рассчитать частоту встречаемости участка узнавания для данной рестриктазы. В каждой нуклеотидной позиции молекулы ДНК с одинаковой вероятностью может оказаться один из 4 нуклеотидов (A, G, С, Т), поэтому фермент, узнающий четырехзвенную последовательность, будет находить одну мишень из 256 пар оснований. В то же время фермент, различающий шестизвенную последовательность, определит специфический участок узнавания 1 раз из 4 096 пар оснований.

Любой фрагмент ДНК обладает характерным расположением сайтов узнавания различных рестриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. Небольшие геномы, например, геномы вирусов, митохондрий, хлоропластов, или части крупных геномов могут быть таким образом расщеплены на определенное число рестрикционных фрагментов. В дальнейшем эти фрагменты можно выделить, чтобы определить, каким генам и (или) регуляторным участкам они соответствуют. Их также можно использовать, чтобы синтезировать гетерологичные рекомбинантные молекулы, встроив, например, какой-либо фрагмент в плазмиду и размножив его с помощью Е. coli. Получение коротких фрагментов ДНК необходимо и для установления последовательности оснований в более крупных фрагментах.

Рестриктазы бывают:

· мелкощепящими,

· крупнощепящими.

Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем вторые, распознающие последовательность из шести нуклеотидных пар.

Для создания рекомбинантных ДНК используют также РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы, ревертазы), синтезирующие ДНК на матрице мРНК. Применяются и ферменты, соединяющие концы фрагментов ДНК, т. е. ДНК-лигазы, выделяемые из Е. coliи фага Т4. Для изменения структуры концов фрагментов ДНК используют:

· нуклеазу BamI,

· экзонуклеазу III из E.coli,

· нуклеазу SIиз Aspergillusorysae.

Субстратом для таких ферментов являются:

· однотяжевые РНК и ДНК,

· двутяжевые ДНК, которые распадаются до 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов и нуклеозид-5'-фосфатов.

Для приготовления гибридизационных проб используется ДНК- полимераза I из Е. coli.

Существует три способа конструирования рекомбинантных ДНК.

· Первый -- объединение ДНК-фрагментов по липким концам. Как мы уже говорили, некоторые рестриктазы способны образовывать их при специфическом разрезании ДНК. Используя это, необходимый ген выделяют из нее при помощи какой-либо рестриктазы. Ею же обрабатывают ту ДНК, к которой хотят присоединить ген. В результате как на выделенном гене, так и на другой ДНК образуются комплементарные липкие концы.

· Второй способ -- коннекторный. Существуют рестриктазы, образующие при специфическом расщеплении ДНК тупые концы. Для гена, полученного таким образом, необходимо пришить липкие концы. Это достигается приливанием, например, смеси аденозина или тимина.

· Третий способ, линкерный, предполагает, что при необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Для этого к первым присоединяют двухцепочечные последовательности (линкеры) с участками узнавания рестриктазы, дающей липкие концы.

Размещено на Allbest.ru

...