Изучение растительных объектов в культуре in vitro методом ЯМР релаксации

Определение и характеристика значения разработки и внедрения новых экономически эффективных методов размножения ценных сортов декоративных растений в садоводстве. Исследование и анализ основных факторов создания эффективной биотехнологической системы.

Рубрика Биология и естествознание
Вид статья
Язык русский
Дата добавления 29.04.2017
Размер файла 191,6 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБОУ ВПО «Поволжский государственный технологический университет»

Изучение растительных объектов в культуре in vitro методом ЯМР релаксации

Сергеев Роман Владимирович, к.с-х.н.

Новиков Петр Сергеевич

Черных Елена Николаевна

Шургин Алексей Иванович, к.с-х.н., доцент

Лобанова Елена Александровна

Худякова Татьяна Федоровна

Йошкар-Ола

Аннотация

В статье дан обзор неинвазивного метода ЯМР релаксации и проведена оценка эффективности использования данного метода в изучении культивируемых в условиях in vitro растительных объектов на примере растений Rosa hybrid.

Ключевые слова: in vitro, меристема, ЯМР релаксация, экспресс метод, 6-БАП

Введение

В садоводстве, важное значение имеет раздел, связанный с разработкой и внедрением новых экономически эффективных методов размножения ценных сортов декоративных растений. Одним из таких способов является получение корнесобственных саженцев путем микроклонального размножения [1]. Он позволяет повысить коэффициент размножения и освобождает растения от вирусных болезней. Многие сорта роз возможно успешно и активно размножать посредством микроразмножения [2]. Однако существуют сложности в изучении и размножении особо ценных генотипов растений, ввиду отсутствия эффективных методов оценки роста и развития растительных клеток в культуре in vitro [3]. Ядерный магнитный резонанс - неразрушающая и неинвазивная методика, у которой есть большое количество анатомических и физиологических приложений к растительным клеткам, органам растения и живым растениям [4,5,6,7,8]. 1Н ЯМР долго использовался для исследования физического состояния воды в растительной ткани и для неразрушающего измерения молекулярного смещения, такого как поток и диффузия в растениях [9].

Содержание воды и гидравлическая удельная электропроводность, включающая транспорт внутри клеток, по мембранам, между клетками, и дальний транспорт ксилемы и флоэмы, сильно зависит от дефицита воды в растении. Благодаря возможности измерить эти процессы транспорта неинвазивно, в неповрежденном растении относительно его клеток и тканей, можно исследовать и многие физиологические аспекты вегетирующего растения.

Одним из основных факторов создания эффективной биотехнологической системы является подбор оптимальной питательной среды, максимально полно обеспечивающей потребности растущей клеточной культуры продуцента в растительных регуляторах роста, макро- и микроэлементах минерального питания, факторов регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, необходимых для высокого биосинтеза целевого продукта.

Современные методы исследования интенсивности роста растений можно разделить на физические и химические. Из них большинство методов являются разрушающими [10], то есть, при анализе объекта его экспериментальный образец либо подвергается участию в химической реакции (химические методы), и по количественному составу продуктов последней судят об изучаемом объекте, либо образец должен пройти серию физико-химических превращений для пригодности исследования соответствующим методом (например, методы исследования коэффициентов преломления раствора, методы электронной микроскопии, рентгеновской дифракции и т. п.).

К неразрушающим образец методам относятся, в основном, спектроскопические, такие как методы диэлектрической спектроскопии (ДС и ВДС), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), электронный спиновый резонанс (ЭСР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и некоторые другие.

Ядерный магнитный резонанс является неразрушающим материал экспресс методом, дающим информацию о различных морфологических и физиологических параметрах растительного объекта, например, о размерах вакуолей в клетках растений, проницаемости клеточной мембраны, содержании воды в клетках [12], скорости и объеме потока веществ в ксилеме и флоэме [13].

Цель работы - изучить возможность применения метода ЯМР релаксации для оценки пролиферативной активности и определения оптимальных параметров развития эксплантов растений в культуре in vitro на основе водных потоков в меристематических очагах.

Материалы, методы и объекты исследований. Объектом для исследований являлись растительные ткани образцов Rosa hybryda, культивируемые in vitro.

ЯМР в настоящее время является одним из самых популярных методов исследования микроструктуры соединений природного происхождения. Ядерная магнитная релаксация - это процесс установления термодинамического равновесия внутри спиновой системы с характерным временем T2, и в системе спины-решетка с общим временем релаксации T1 [14]. Спин-спиновая (поперечная) релаксация происходит в плоскости xy и сопровождается излучением фотонов, т. е. является наблюдаемой величиной. Продольная спин-решеточная релаксация не вызывает излучательных переходов в спин-системе и наблюдается косвенно [15,16]. Следует отметить, что время Т2 непосредственно зависит от подвижности протонов и если протоны подвижны, то Т2 длиннее. Этот параметр мы использовали для оценки интенсивности роста растительных объектов в культуре in vitro.

Чтобы характеризовать подвижность сегментов макромолекул и функциональных групп, в работе использовалось время спин-спиновой релаксации Т2, которое возрастает с уменьшением времени корреляции движений 11H в изучаемом образце. На основе измерений амплитуды ССИ определялось количество протонов водорода в образце, так как эти величины связаны линейно. Для определения времени ядерной магнитной релаксации Т2 и амплитуды сигнала ЯМР исследуемых образцов использовались импульсные последовательности Карра - Перселла - Мейбума - Гилла (КПМГ) [17,18], спада свободной индукции (ССИ) и спинового эха Хана. Время спин-решеточной релаксации (Т1) определялось путем снятия кривой восстановления продольной намагниченности (импульсная последовательность 900 - - 900).

Все измерения проводились на ЯМР-анализаторе «Spin Track», зарегистрированном в Государственном реестре средств измерений Российской Федерации под номером 32677 - 06 [19], поддерживающем все возможные приложения ЯМР низкого разрешения. Процедура подготовки образца в большинстве приложений сводится лишь к помещению анализируемого вещества в пробирку и установке ее в датчик прибора. Основные параметры ЯМР-анализатора «Spin Track» приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные характеристики ЯМР-анализатора «Spin Track»

Параметр

Значение

Постоянное магнитное поле B0 (в зависимости от типа магнита)

0,1..1,5 T

Диапазон рабочих частот спектрометра

2-60 МГц

Программируемый фазовый сдвиг РЧ импульсов

00, 900, 1800, 2700

Время восстановления чувствительности (для датчика с ампулой на 10мм, 0.47T)

7 мкс

Разрешение по времени в последовательности

0.1 мкс

Импульсная последовательность

Полностью программируемая

Коэффициент усиления приемного тракта

70 .. 95 дБ

Шаг дискретизации АЦП

Программируемый

Минимальный шаг дискретизации АЦП

0,2 мкс

Число разрядов АЦП

10

Операционная система управляющих программ

Windows 9x, NT, Me, 2000, XP

Связь с компьютером

Full Speed USB 2.0

Программная совместимость данных

ASCII, Microsoft Excel®

Область чувствительности датчика с ампулой на 10 мм (высота заполнения пробирок образцом)

10 мм

Теоретические расчеты, моделирование и аппроксимация экспериментальных данных проводились с использованием современного программного обеспечения Origin 6.1 и MATHCAD 2001 Professional. Построение графиков и обработка данных осуществлялась при помощи пакета программ Microcal Origin 6.1.

Для экспериментов по исследованию интенсивности роста и динамики формирования меристематических очагов в культуре растительных тканей были взяты культуры Rosa hybrida сортов `Парцелайн' и `Ле руж э ле нуар'. Все образцы культивировались на среде по прописи MS [20] с различной концентрацией 6-бензиламинупирина в пробирках Видаля. Данные с образцов собирались в различные периоды культивирования (через 2, 3 и 4 недели). Измерения магнитно-релаксационных параметров проводились на ЯМР релаксометре «Spin Track» с частотой резонанса 19 МГц [17]. Времена спин-спиновой релаксации Т2 измерялись при помощи импульсной последовательности Карра-Парселла-Мейбума-Гилла. Времена спин-решеточной релаксации Т1 были получены в эксперименте с импульсной последовательностью 90--90. Результаты проведенных экспериментов по ЯМР-релаксации во временной области для Rosa hybrida сорта `Парцелайн' представлен в таблице 2.

Таблица 2 - Экспериментальные данные ЯМР-релаксации образцов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' в зависимости от продолжительности культивирования

Концентрация 6-БАП, мг/л

Время Т2 в зависимости от продолжительности культивирования, мкс

Наличие меристематических очагов

2 недели

3 недели

4 недели

0

6100

6437

9083

нет

0,5

222

184

175

есть

2

222

201

194

есть

5

240

227

222

есть

7

222

214

208

есть

Анализируя данные, можно сделать вывод, что наличие в питательной среде фитогормонов влияет на формирование меристематических очагов у анализируемых образцов. Это объясняется тем, что уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т2 говорит о снижении подвижности протонов в исследуемых образцах, что в свою очередь может свидетельствовать о формировании меристематических очагов в растительной ткани, которое сопровождается увеличением числа клеток и протонной плотности. Так, на питательной среде без содержания фитогормонов время спин-спиновой релаксации Т2 через 2 недели культивирования составило 6100 мкс, через 3 недели - 6437 мкс, через 4 недели 9083 мкс. Увеличение времени Т2 в процессе культивирования свидетельствует об отсутствии формирования меристематических очагов у анализируемых образцов.

На средах с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, 2 мг/л, 5 мг/л и 7 мг/л время спин-спиновой релаксации с течением времени уменьшается, что свидетельствует процессе формирования меристематических очагов.

На рисунке 1 показана зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Парцелайн' от концентрации 6-БАП в питательной среде. растение садоводство биотехнологический

Рисунок 1 - Зависимость формирования меристематических очагов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' от концентрации 6-БАП в питательной среде

У образцов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдали на среде с добавлением 6-БАП в концентрациях 0,5 мг/л и 2 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации 6-БАП снижает интенсивность формирования меристематических очагов. Результаты проведенных экспериментов по ЯМР-релаксации во временной области для Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Экспериментальные данные ЯМР-релаксации образцов Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' в зависимости от продолжительности культивирования

Концентрация фитогормона, мг/л

Время Т2 в зависимости от продолжительности культивирования, мкс

Наличие меристематических очагов

2 недели

3 недели

4 недели

0

111

109

123

нет

0,5

215

175

156

есть

2

163

142

139

есть

5

189

159

147

есть

7

176

151

143

есть

Данные показывают, что наличие в питательной среде фитогормонов влияет на формирование меристематических очагов у анализируемых образцов. Так, на питательной среде без содержания фитогормонов время спин-спиновой релаксации Т2 через 2 недели культивирования составило 111 мкс, а через 4 недели - 123 мкс. Увеличение времени Т2 свидетельствует об отсутствии формирования меристематических очагов у анализируемых образцов.

На средах с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, 2 мг/л, 5 мг/л и 7 мг/л время спин-спиновой релаксации с течением времени уменьшается, что свидетельствует о процессе формирования меристематических очагов.

На рисунке 2 показана зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' от концентрации 6_БАП в питательной среде.

Рисунок 2 - Зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' от концентрации 6-БАП в питательной среде

Таким образом, у образцов Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т2, а, следовательно, и наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдается на питательной среде с добавлением фитогормона в концентрации 0,5 мг/л.

На следующих рисунках приведены графики спада поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 (рис. 3) и 4 недели (рис. 4) культивирования.

Рисунок 3 - Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 недели культивирования

Рисунок 4 - Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 4 недели культивирования

На следующих рисунках приведены графики спада поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 (рис. 5) и 4 недели (рис. 6) культивирования.

Рисунок 5 - Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6_БАП через 2 недели культивирования

Рисунок 6 - Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 4 недели культивирования

Применение магнитнорезонансной релаксации в изучении пролиферативной активности клеток растений позволит своевременно оценить и при необходимости изменить условия культивирования эксплантов на различных этапах онтогенеза, а также существенно увеличить эффективность подбора компонентов питательных сред и как следствие ускорить процесс размножения растений.

Список литературы

1. Поздняков, И.А. Особенности микроклонального размножения шиповника и декоративных сортов рода Rosa L.: автореф. дис. канд. с-х. наук / И.А. Поздняков. - М., 2007. - 25 с.

2. Arnold, N.P. A study of the effect of growth regulators and time of plantlet harvest on the in vitro multiplication rate of hardy and hybrid tea roses / N.P. Arnold, M.R. Binns, N.N. Barthakur, D.C. Cloutier // Journal of Horticultural Science 67. - 1992. - N. 6. - P. 727-735.

3. Сергеев, Р.В. Выращивание декоративных цветочных растений в культуре in vitro с использованием субстратов из органических отходов / Е.М. Романов, Д.И. Мухортов, А.Д. Средин, Р.В. Сергеев, А.И. Шургин // Вестник МарГТУ. № 3(13)., 2011. - С. 72-81.

4. Walter, L. Studies of plant systems by in vivo NMR spectroscopy / L. Walter, R. Callies, R. Altenburger // In: de Certaines JD, Boveґe WMMJ, Podo F, eds. Magnetic resonance spectroscopy in biology and medicine. Oxford: Pergamon Press. - 1992. - P. 573-610.

5. Ratcliffe, R.G. In vivo NMR studies of higher plants and algae / R.G. Ratcliffe // Advances in Botanical Research. - 1994. - Vol. 20. - P. 42-123.

6. Shachar-Hill, Y. Nuclear magnetic resonance in plant biology / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Rockville: American Society of Plant Physiologists. - 1996.

7. Chudek, J.A. Magnetic resonance imaging of plants / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. - 1997. - Vol. 31. - P. 43-62.

8. Ishida, N. The NMR microscope, a unique and promising tool for plant science / N. Ishida, M. Koizumi, H. Kano // Annals of Botany. - 2000. - Vol. - 86. - P. 259-278.

9. MacFall, J.J. Magnetic resonance imaging of plants / MacFall J.J, As. H. Van // The American Society of Plant Physiologists.-.1996. - P. 33-76.

10. Современные физические методы исследования полимеров / Под. ред. Г.Л. Слонимского. - М.: Химия, 1982.

11. Рот, Г.К. Радиоспектроскопия полимеров / Г.К. Рот, Ф. Келлер, Х. Шнайдер - М.: Мир, 1987.

12. Scheenen, T.W.J. Quantification of water transport in plants with NMR imaging / T.W.J. Scheenen, D. van Dusschoten, P.A. de Jager, H. Van As // J. Exp. Bot. 2000. - 51(351). - P. 1751-1759.

13. Windt, C.W. MRI of long-distance water transport: a comparison of the phloem and xylem flow characteristics and dynamics in poplar, castor bean, tomato and tobacco / C.W. Windt, E. Gerkema, J. Oosterkamp, H. Van As // Plant Cell Envir. - 2006. - 29(9). - P. 1715-1729.

14. Чижик, В.И. Ядерная магнитная релаксация. / В.И. Чижик //- Ленинград., изд-во Ленинградского университета, 1991.

15. Фаррар, Т. Импульсная и фурье-спектроскопия ЯМР / Т.мФаррар, Э. Беккер. - М: Мир, 1973.

16. Эмсли, Дж. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения / Дж. Эмсли, Дж. Финей, Л. Сатклифф. - М.: Мир, 1968.

17. http://www.nmr-design.com/ru/

18. Грунин, Ю. Б Импульсный метод ЯМР для определения термодинамических характеристик адсорбционных процессов в биополимерах / Ю. Б.Грунин, Л. Ю.Грунин, Е. А.Никольская // Журн. физ. химии. - 2007. - Т.81, № 7. - С. 1165-1170.

19. Carr, H.Y. Purcell E.M. Physical Review В 94 (35), p. 630 - 638, 1954.

20. Meiboom, S., Gill D. The Review of Scientific Instruments B 29 (45).

21. Грунин, Л.Ю. Протонная магнитная релаксационная спектроскопия природных полимеров : дис. … канд. хим. наук : 02.00.04 : защищена 21.12.98 : утв. 14.05.99 / Грунин Леонид Юрьевич. - Йошкар-Ола, 1998.

22. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T.Murashige, F.Skoog // Physiologia Plantarum. - 1962. - Vol. 15. - P. 473 - 497.

Размещено на Allbest.ru

...

Подобные документы

  • Особенности изучения проблемы интродукции, акклиматизации, вопросов устойчивости и адаптации растений в городских зеленых насаждениях. Обзор свойств декоративных, диких растений семейства цветковых. Морфогенез микроспор в культуре пыльников подсолнечника.

    реферат [22,2 K], добавлен 12.04.2010

  • Исследование особенностей вторичного обмена растений, основных методов культивирования клеток. Изучение воздействия биологически активных растительных соединений на микроорганизмы, животных и человека. Описания целебного действия лекарственных растений.

    курсовая работа [119,9 K], добавлен 07.11.2011

  • Культура ткани в размножении пшеницы. Гормональная регуляция в культуре ткани, схема контроля органогенеза. Роль гуминовых кислот в процессе стимуляции роста растений, их влияние на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.

    курсовая работа [1,9 M], добавлен 05.11.2011

  • Получение регенерантов из каллусной ткани и изучение их свойств. Тестирование индукции каллусного потенциала двух сортов шалота с различными гормонами и гормональными комбинациями. Исследование свойств регенерантов на предмет хромосомных перестроек.

    практическая работа [763,8 K], добавлен 14.08.2015

  • Исследование основных жизненных форм растений. Описание тела низших растений. Характеристика функций вегетативных и генеративных органов. Группы растительных тканей. Морфология и физиология корня. Видоизменения листа. Строение почек. Ветвление побегов.

    презентация [21,1 M], добавлен 18.11.2014

  • Обобщение основных видов вредителей овощных культур семейства луковых. Биологические средства борьбы с вредителями. Правила агротехники комнатных растений - мероприятий, направленных на предотвращение резких изменений основных факторов окружающей среды.

    контрольная работа [28,4 K], добавлен 05.02.2011

  • Вегетативное размножение - размножение растений при помощи вегетативных органов: ветвей, корней, побегов, листьев или их частей. Преимущества вегетативного размножения. Разные способы размножения растений, методы выращивания растений семенным способом.

    реферат [19,9 K], добавлен 07.06.2010

  • Создания и совершенствования сортов культурных растений и пород домашних животных, применение этих методов в растениеводстве (селекция растений) и животноводстве (селекция животных). Сорта растений и породы животных с нужными биологическими свойствами.

    презентация [598,9 K], добавлен 25.10.2011

  • Виды растений, которые применяются в озеленении: обзор и краткая характеристика. Растения для озеленения городов с многочисленным населением, ассортимент деревьев и кустарников. Особенности размножения декоративных растений. Формирование кроны деревьев.

    курсовая работа [537,5 K], добавлен 17.11.2014

  • Виды вегетативного размножения растений. Типы искусственного вегетативного размножения растений. Деление куста, корневые и стеблевые отпрыски. Размножение растений отводками и прививками, окулировка и копулировка. Характеристика метода культуры клеток.

    реферат [6,0 M], добавлен 09.12.2011

  • Рассмотрение и анализ основных групп факторов, способных вызвать стресс у растений. Ознакомление с фазами триады Селье в развитии стресса у растений. Исследование и характеристика физиологии стрессоустойчивости растений с помощью защитных систем.

    контрольная работа [194,8 K], добавлен 17.04.2019

  • Использование хвойных растений в озеленении. Посадка черенков и уход. Основные способы размножения хвойных растений. Характеристика можжевельника казацкого и туи западной. Развитие корневой системы растений. Характеристика участка для посадки черенков.

    научная работа [22,2 K], добавлен 08.01.2010

  • Исследование взаимодействия чистых молочнокислых бактерий и дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae, входящих в состав микробиологического препарата "Эмбико", с корнями растений огурца (Cucumis sativus L.) сортов Конкурент и Феникс плюс in vitro.

    реферат [1,8 M], добавлен 25.04.2014

  • Способы размножения растений: вегетативное и половое. Факторы, влияющие на прорастание семян. Способы размножения луковичных растений. Характеристика регуляторов роста ("Эпин экстра", "Циркон", "Флоравит 3Р") и их влияние на рост и развитие растений.

    дипломная работа [3,7 M], добавлен 17.06.2017

  • История развития генетического модифицирования. Определение преимуществ использования трансгенных технологий как усовершенствованного скрещивания с целью создания улучшенных сортов растений. Изучение вопроса безопасности модифицированных организмов.

    статья [25,0 K], добавлен 12.06.2010

  • Понятие и значение селекции как науки о создании новых и улучшении существующих пород животных, сортов растений, штаммов микроорганизмов. Оценка роли и значения микроорганизмов в биосфере, и особенности их использования. Формы молочнокислых бактерий.

    презентация [1,1 M], добавлен 17.03.2015

  • Характеристика каллусных клеток. Этапы микроклонального размножения. Классификация методов микроклонального размножения. Успехи микроклонального размножения хризантемы. Стерилизация посадочного материала. Каллусогенез на эксплантах различной локализации.

    дипломная работа [606,8 K], добавлен 08.04.2015

  • Исследование однодольных растений как второго по величине класса покрытосеменных или цветковых. Хозяйственное значение и характерные признаки ароидных, осоковых и пальмовых семейств. Изучение размножения, цветения, развития корней и листьев растений.

    реферат [10,6 K], добавлен 17.12.2014

  • Особенности роста и развития растений. Культура и морфогенетические особенности каллусных тканей. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Применение культур растительной ткани. Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений.

    реферат [7,0 M], добавлен 22.09.2009

  • Рассмотрение основных функций тканей высших растений. Изучение места обитания, строения, питания и способов размножения водорослей, их роль в природе и в жизни человека. Ознакомление с разнообразием растений тундры и их адаптивными особенностями.

    контрольная работа [22,9 K], добавлен 26.10.2011

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.