Морфология бактериофагов. Наследственность и мутации

Размещено на http://www.allbest.ru/

План

1. Бактериофаги: морфология. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения и фаговая конверсия

2. Понятие наследственности. Организация ДНК у бактерий

3. Плазмиды и их классификация

4. Изменчивость. Классификация и характеристика форм изменчивости

5. Диссоциации у бактерий

6. Мутации. Классификация. Мутагены выявление мутантов

7. Генетические рекомбинации у бактерий. Механизмы и значение. Трансформация. Трансдукция

8. Механизмы фаговой конверсии

9. Конъюгация и конъюгативные плазмиды

10. R-плазмида. Бактериоциногенный фактор. Бактериоцины. Бактериоцинотипирование и бактериоциногенотипирование

11. Практическое значение учения о генетике

12. Молекулярно-генетические методы. ПЦР. Молекулярная гибридизация

1. Бактериофаги: морфология. Вирулентные и умеренные фаги. Лизогения и фаговая конверсия

Вирусы бактерий (бактериофаги). Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий:

1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

3.Репродукция фага.

4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов. Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие фаговую конверсию. В последнем случае геном фага в клетке не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении. Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями - в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на:

- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа). Смотри протокол (методы выявления фагов!).

Практическое использование бактериофагов:

1.Для идентификации бактерий (определение фаготипа при фаготипировании). Используется для эпидемиологического анализа!!!

2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

2. Понятие наследственности. Организация ДНК у бактерий

Наследственность - это способность сохранять и передавать исходные видовые признаки из поколения в поколение.

Ген - наследственный фактор, единица наследственного материала - определенный участок молекулы ДНК у высших организмов (РНК у ряда вирусов), ответственный за синтез определенного белка.

Генотип - совокупность всех генов организма, его наследственная материальная основа.

Фенотип - совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся на основе взаимодействия генотипа с условиями внешней среды.

Генетический материал у бактерий содержится в нуклеоиде (бактериальной хромосоме) и во внехромосомных генетических элементах -- плазмидах и мигрирующих генетических элементах (транспозоны и IS-последовательности).

Организация ДНК у бактерий:

n нуклеоид (бактериальная хромосома) кодирует жизненно важные признаки

Молекула ДНК (нуклеоид) представляет собой замкнутую, спирально закрученную двунитчатую структуру, свободно располагающуюся в цитоплазме. Длина бактериальной хромосомы в развернутом состоянии составляет приблизительно 1 мм.

n внехромосомные генетические элементы

не жизненно важные признаки. Относятся:

1. Транспозоны: Нуклеотидные поледовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК (и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую)

2. IS-последовательности: Вставки нуклеотидных последовательностей (более 1 000 пар нуклеотидов)

Функция: Координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации

Регуляторная (регуляция транскрипции генов путем их «включения/выключения")

Индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5 - 9 пар нуклеотидов)

3. Плазмиды и их классификация

Плазмиды - внегеномные элементы, представляющие собой циркулярную двухцепочечную ДНК, реплицирующиеся автономно от геномной ДНК. Большинство плазмид распространяется конъюгативным путем, часть - при трансформации и трансдукции. Выделяют автономные (не связанные с хромосомой бактерий) и интегрированные (встроенные в хромосому) плазмиды.

Плазмиды -- кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации. Их возможные состояния:

1. автономное (в цитоплазме);

2. интегрированное (в нуклеоиде).

Конъюгативные плазмиды способны к самопереносу из одной клетки в другую. Неконъюгативные плазмиды способны к переносу с помощью конътативных плазмид и бактериофагов.

Функции плазмид:

· регуляторная - компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида

· кодирующая - вносит в генотип новую информацию

Плазмиды подразделяются на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий:

Категории плазмид	Кодируемое свойство
F-плазмида (половой фактор или фактор фертильности)	Способность к переносу плазмидных и хромосомных генов при конъюгации бактерий через половые ворсинки
R-плазмида (фактор множественной лекарственной устойчивости)	Придает бактериям устойчивость к нескольким антибиотикам и другим лекарственным веществам
Плазмиды бактериоциногении	Кодируют синтез бактериоцинов (особых белков), вызывающих гибель близкородственных бактерий. Например, бактериоцины E.coli вызывают гибель патогенных энтеробактерий.
Ent-плазмида	Синтез энтеротоксинов
Hly-плазмида	Синтез гемолизинов
К-88, К-99	Кодируют синтез поверхностных антигенов у бактерий
Биодеградативные плазмиды	Разрушение различных органических и неорганических соединений

4. Изменчивость. Классификация и характеристика форм изменчивости

Изменчивость - способность микроорганизмов изменять видовые признаки и свойства.

Может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации).

Модификации - временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды. Модификации находятся под контролем генома, но не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК и вскоре утрачиваются. Модификации проявляются в изменении морфологических, биохимических и ряда других признаков.

Биохимическую основу модификации составляет индуцибельный синтез ферментов. Так, например, кишечная палочка только в присутствии лактозы синтезирует ферменты, необходимые для ее расщепления.

Выделяют 2 вида модификационной изменчивости:

а) стабильную (длительную) модификацию. Она сохраняется в потомстве в течение нескольких поколений.

б) кратковременную модификацию. Она исчезает сразу после прекращения действия фактора, вызвавшего ее.

Модификации могут возникать под действием антибиотиков. При этом образуются L-формы, лишённые клеточной стенки. После прекращения действия пенициллина происходит реверсия - возврат к исходному фенотипу.

При выращивании многих бактерий на питательной среде с бактериостатическими концентрациями антисептиков (фенол, например) также можно получить модификации (например, утрата жгутиков).

5. Диссоциации у бактерий

R-S-диссоциация бактерий - это образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип -- R-колонии (англ. rough -- неровный) -- характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип -- S колоний (англ. smooth-- гладкий) - имеет круглую форму, гладкую поверхность.

Диссоциацию большинство ученых рассматривают как закономерную форму модификации, а некоторые относят ее к мутациям. В основе диссоциации лежат изменения в структуре липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки грамотрицательных микроорганизмов

Процесс диссоциации обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний (исключение - чумная палочка, бациллы сибирской язвы, микобактерии туберкулеза).

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды! наследственность рекомбинация генетический трансдукция

Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются во внешней среде.

S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику инфекционных заболеваний.

Свойства бактерий из S- и R-колоний

S-колонии	R-колонии
Гладкие с ровными краями	Шероховатые с изрезанными краями
Диффузно-мутящий рост в МПБ	Придонный рост в МПБ
Обычно вирулентны	Обычно не вирулентны, за исключением возбудителей туберкулеза, сибирской язвы, дифтерии, чумы
У капсульных видов есть капсула	Капсула отсутствует
У подвижных видов есть жгутики	Жгутики отсутствуют
Чувствительны к фагу	Мало чувствительны к фагу
Биохимически более активны	Биохимически менее активны
Полноценны в антигенном отношении	Неполноценны в антигенном отношении

6. Мутации. Классификация. Мутагены выявление мутантов

Мутации - это изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закрепленной утрате или изменении какого-либо признака.

Классификация мутаций:

По характеру изменения генотипа:

§ Генные (точечные)

§ Хромосомные

По характеру изменения фенотипа:

§ Летальные

§ Морфологические

§ Физиологические

§ Биохимические

По происхождению:

§ Спонтанные

§ Индуцированные

По локализации в клетке:

§ Ядерные

§ Цитоплазматические (мутации внеядерных генов)

По фенотипическим последствиям:

§ Прямые

§ Обратные

Мутагены

Определение	Химические вещества или физические факторы, вызывающие предмутационные изменения в ДНК, которые в результате ошибок в работе репарирующих ферментов или в процессе репарации переходят в мутацию
Классификация по механизму действия	Аналоги азотистых оснований замена пар оснований Акридиновые красители выпадения или вставки оснований УФ, некоторые продукты микробного метаболизма нарушение работы ДНК-полимеразы образование тиминовых димеров Нитрозосоединения множественный эффект («супермутагены»)

Мутантные штаммы бактерий используются:

1) для получения продуктов биосинтеза бактерий-антибиотиков, аминокислот, ферментов и др.;

2) для получения вакцин;

3) для индикации мутагенности веществ.

7. Генетические рекомбинации у бактерий. Механизмы и значение. Трансформация. Трансдукция

Определение рекомбинационной изменчивости у бактерий - изменчивость, происходящая в результате включения в ДНК реципиентной клетки участка ДНК донорской клетки.

Трансдукция - перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту с помощью умеренного бактериофага. Фаг переносит небольшой фрагмент ДНК бактерии-донора. В результате трансдукции бактерия-реципиент приобретает новые фенотипические признаки: ферментативные свойства, устойчивость к антибиотикам, вредным воздействиям окружающей среды, вирулентность и др. При выходе бактериофага из клетки, фрагмент донорской трансдуцированной ДНК остается в хромосоме клетки-реципиента, а, следовательно, сохраняются и новые фенотипические признаки. Бактериофаг при трансдукции выполняет только транспортную функцию.

Типы трансдукций:

1. Неспецифическая трансдукция. В процессе репродукции фага в момент сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может проникнуть какой-либо фрагмент ДНК бактерии-донора. В клетки реципиентного штамма могут быть перенесены любые гены донора. Фаги являются только переносчиком генетического материала от одних бактерий к другим. Фаговая ДНК не участвует в образовании рекомбинантов.

2. Специфическая трансдукция осуществляется фагами, обладающими избирательной локализацией на хромосоме бактерий. Образование трансдуцирующего фага происходит путем выщепления профага из бактериальной хромосомы вместе с генами, расположенными на хромосоме клетки-донора рядом с профагом. При взаимодействии фагов с клетками реципиентного штамма происходит включение гена бактерии-донора вместе с ДНК дефектного фага в хромосому бактерии-реципиента.

3. Абортивная трансдукция. Принесенный фагом фрагмент ДНК донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.

Во время деления бактериальной клетки фрагмент ДНК может передаваться только одной из двух дочерних клеток, т.е. наследоваться однолинейно и в конечном итоге утрачиваться в потомстве.

Вариантом специфической трансдукции является Фаговая (лизогенная) конверсия. Это изменения свойств бактерии-реципиента под влиянием генов умеренного фага.

8. Механизмы фаговой конверсии

Трансформация - перенос генетического материала от одного организма к другому, где посредством генетической рекомбинации часть трансформирующей молекулы ДНК может обмениваться с частью хромосомной ДНК донора.

Трансформация бактерий -- форма генетической изменчивости, при которой бактерия-реципиент поглощает из внешней среды трофическим путем фрагменты ДНК бактерии-донора. Это приводит к образованию рекомбинантных бактерий, обладающих некоторыми свойствами донорских клеток.

Впервые феномен трансформации был установлен Ф. Гриффитсом в 1928 г. на модели бескапсульного и капсульного пневмококков. Для проведения опыта использовали трех белых мышей. Первую мышь заражали живыми, бескапсульными (невирулентными) пневмококками. Второй мыши вводили убитую культуру капсульных (вирулентных) пневмококков; третьей мыши -- смесь живых невирулентных пневмококков и убитых вирулентных пневмококков. В результате опыта в живых оставались первая и вторая мыши; погибала третья мышь, так как живые бескапсульные пневмококки поглощали фрагменты ДНК убитых капсульных и сами превращались в капсульные (вирулентные) пневмококки. Механизм такой трансформации оставался неясным в течение 16 лет. В 1944 г. осуществили трансформацию бескапсульных пневмококков в капсульные in vitro. Они добавили к культуре бескапсульных пневмококков ДНК, выделенную из капсульных пневмококков, в результате чего бескапсульные превратились в капсульные и стали вирулентными для мышей. Опыт доказал, что носителем единиц наследственности (генов) является ДНК.

Процесс трансформации бактерий можно подразделить на несколько фаз:

1) адсорбция ДНК-донора на клетке-реципиенте;

2) проникновение ДНК внутрь клетки-реципиента;

3) соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией.

Эффективность трансформации зависит от степени гомологичности ДНК донора и реципиента. Чем выше гомологичность, тем эффективнее спаривание, и тем больше образуется рекомбинантных бактерий. Межвидовая трансформация происходит гораздо реже, чем внутривидовая.

9. Конъюгация и конъюгативные плазмиды

К конъгативным плазмидам относятся F-плазмиды, плазмиды бактериоциногении и часто R-плазмиды.

F-плазмида, или половой фактор. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. F-плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra-опероном F-плазмиды (от англ. transfer -- перенос), обеспечивающим конъюгативность. F-плазмиды содержат только tra-оперон, в их составе нет никаких других генов.

F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии.

F-плазмиды:

Определение	Половой фактор (tra-оперон, других генов нет)
Состояние	Интегрированное	Hfr-клетки
	Автономное	F+-клетки
		F-клетки

Конъюгация - однонаправленная передача генетической информации в результате непосредственного контакта между донорной и реципиентной клетками

Бактерии, имеющие F-плазмиду, называются мужскими F⁺-клетками. Женские (F-) клетки не имеют этой плазмиды. F-клетки - клетки, у которых F-плазмида несёт дополнительные донорские гены.

Процесс конъюгации между F⁺ и F- клетками имеет следующие стадии:

1. установление контакта между донором и реципиентом с помощью половых ворсинок;

2. прохождение генетического материала через канал половой ворсинки от донора к реципиенту;

3. рекомбинация между донорской и реципиентной ДНК.

F-плазмида может находиться как в автономном состоянии в цитоплазме, так и в интегрированном с хромосомой клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос при конъюгации. В результате F- клетка превращается в F⁺ клетку, содержащую F-плазмиду. Если F-плазмида интегрирована с хромосомой бактерии, то при конъюгации она контролирует перенос части хромосомной ДНК в клетку-реципиент. С помощью интегрированной F-плазмиды частота переноса хромосомных генов между бактериями существенно возрастает. Поэтому бактерии, у которых F-плазмида интегрирована с хромосомой, обозначают как Hfr (от англ. high frequency recombination), т.е. обеспечивающие высокую частоту рекомбинаций.

10. R-плазмида. Бактериоциногенный фактор. Бактериоцины. Бактериоцинотипирование и бактериоциногенотипирование

Бактериоциногенные плазмиды (на примере Col-плазмиды E.coli)

плазмиды, детерминирующие синтез колицинов (антибиотикоподобных веществ)

n состав

– гены, детерминирующие синтез колицина

– tra-оперон

n особенности

– редко интегрируют в нуклеоид

– обычно репрессированы

– при их дерепрессии бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает (потенциально летальная плазмида)

n биологическое значение

– «разрежение» бактериальной популяции при истощении питательной среды

n медицинское значение

– участвуют в нормализации естественного микробиоценоза кишечника

Свойства бактериоцинов:

n Представляют собой вещества белковой природы и функционируют как антибиотики с узким спектром действия.

n Вызывают гибель клетки не нарушая ее целостности.

n Ингибируют синтез ДНК, РНК и белка.

n Обладают летальным признаком - после выделения бактериоцина бактериальная клетка может погибнуть.

n Клетка, выделяющая бактериоцины, устойчива к действию гомологичных бактериоцинов извне.

Практическое значение бактериоциногении:

1. Бактериоциногения обеспечивает один из видов антагонистических взаимоотношений. Бактериоциногения у нормальной микрофлоры - это фактор, обеспечивающий устойчивость организма к инфекции, у патогенных микроорганизмов - это фактор их патогенности.

2. Бактериоциногения - это эпидемиологическая метка микроорганизма, являясь наследственным признаком, т.е. определенный штамм бактерий выделяет бактериоцины соответствующего типа.

3. Из живых колициногенных штаммов E. coli М17 готовят лечебный препарат - колибактерин.

Бактериоцинотипирование см. протокол!

R-плазмиды:

Определение	Плазмиды множественной лекарственной устойчивости
Состав	r-оперон(ы) + tra-оперон (RTF)
	r-оперон(ы)
Состав r-оперона	Гены, детерминирующие синтез ферментов	Инактиврующие данный антибиотик
		Модифицирующие данный антибиотик
		Снижающие проницаемость КС для данного антибиотика
	Может содержать	Транспозон
		IS-последовательности
Пути передачи	Г+	При трансдукции
	Г-	При конъюгации

11. Практическое значение учения о генетике

Генная инженерия в медицинской микробиологии. Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью рекомбинантных штаммов бактерий

– вакцины

– гормоны

– интерфероны

– цитокины

Получение рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В. встраивание гена вируса гепатита В, детерминирующего синтез HBs-Ag (поверхностный антиген вируса гепатита) в геном дрожжевой клетки

манифестация (проявление) гена

синтез дрожжевой клеткой HBs-Ag

очистка HBs-Ag

вакцина, содержащая HBs-Ag, но не содержащая вирусных частиц или их фрагментов

12. Молекулярно-генетические методы. ПЦР. Молекулярная гибридизация

Генетические методы, применяемые в микробиологической диагностике:

- процентное содержание Г+Ц бактериальном геноме

- метод молекулярной гибридизации

- полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод молекулярной гибридизации:

Цель

Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов - сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)

Полимеразная цепная реакция:

Цели

обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры

идентификация микроорганизмов

генотипирование микроорганизмов

Принцип проведения:

патологический материал или штамм микроорганизма

выделение ДНК

нагрев

расплетение ДНК на две нити

добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3'-концам искомого гена)

охлаждение

связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена

добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов

нуклеотиды присоединяются к 3'-концам праймеров

повторение циклов (30-80) - накопление (амплификация) искомого гена

резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена

определение количества ДНК с помощью электрофореза

Размещено на Allbest.ru

...