Изучение динамики формирования меристематических очагов в культуре растительной ткани методом ямр-спектроскопии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Изучение динамики формирования меристематических очагов в культуре растительной ткани методом ямр-спектроскопии

Черных Елена Николаевна

Культура тканей растения -- способность растительных клеток размножаться на искусственных питательных средах. Она основана на выращивании в длительной пересадочной культуре тканей растений в виде недифференцированной каллусной массы в стерильных условиях [1].

Процесс клонального микроразмножения растений состоит из четырех этапов [2]. Первый этап - выбор растения донора, изолирование и стерилизация экспланта, создание условий для его роста на питательной среде in vitro.

Все факторы, влияющие на рост и развитие растений условно можно разделить на физические, химические и гормональные. К физическим факторам относятся температура, свет, кислотность среды и др.

От температуры как фактора, координирующего работу ферментов, зависит скорость метаболических процессов, а также транспирации, влияющих на поглощение. При низких температурах транспортные белки в мембране работают медленнее. А при высоких, вследствие повышения проницаемости мембран, пассивно выделяются ионы из клетки [3]. Свет - один из важнейших факторов роста и развития растений, так как он выполняет две функции: субстратную и регуляторную. В темноте поглощение солей замедляется и постепенно прекращается, плохо развиваются корни. На свету же усиливается транспирационный ток. С увеличением температуры увеличивается и величина минимальной интенсивности света. Там, где комбинация этих факторов наиболее благоприятна, резко увеличивается рост.

На клональное микроразмножение и рост растений также влияет и кислотность среды, определяющая доступность для растений питательных веществ. Известно, что сильнокислые или щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов, например, фосфора и железа, делая их относительно нерастворимыми и этим ограничивая рост растений. В то же время при высокой кислотности большое количество этих элементов переходит в растворенное состояние и становится токсичным для эксплантов.

Как правило, ткани и органы растений культивируют на питательной среде с рН 5,6--5,8 [4]. Однако эти условия не всегда могут быть оптимальными. Например, для культуры зародышей сосны обыкновенной было показано, что изменение кислотности питательной среды от 4,7 до 5,2 позволяет увеличить в 2,5--3 раза способность зародышей образовывать адвентивные почки, а для культуры ели обыкновенной наиболее благоприятный уровень рН среды находился в пределах 5,2--5,6. Эти данные полностью совпадают с кислотностью почвы, на которых успешно произрастают данные породы в естественных условиях. Поэтому в экспериментах по культуре ткани необходимо уделять особое внимание кислотности питательной среды, учитывая кислотность почв естественного произрастания исследуемых растений.

Современные методы исследования динамики формирования меристематических очагов в культуре растительной ткани можно разделить на физические и химические. Из них большинство методов являются разрушающими [5], то есть, для проведения эксперимента образец либо подвергается участию в химической реакции (химические методы), и по количественному составу продуктов последней судят об изучаемом объекте, либо образец должен пройти серию физико-химических превращений для пригодности исследования соответствующим методом (например, методы исследования коэффициентов преломления раствора, методы электронной микроскопии, рентгеновской дифракции и т. п.).

К неразрушающим образец методам относятся, в основном, спектроскопические, такие как методы диэлектрической спектроскопии (ДС и ВДС), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), электронный спиновый резонанс (ЭСР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и некоторые другие.

Среди всех перечисленных методов, особое место занимает ЯМР [6]. Основные его преимущества можно сформулировать так:

ЯМР является неразрушающим материал методом;

Несложный процесс приготовления образцов;

Большей частью в образцах не присутствует дополнительный компонент (например, растворитель), что часто повышает точность эксперимента, позволяя не учитывать влияние примесей;

ЯМР является экспресс - методом, то есть время проведения и интерпретации эксперимента не превышает нескольких минут;

Информация о состоянии ядер атомов - их взаиморасположении и формах движения, получаемая посредством ЯМР, во многом более ценна и точна в отношении физико-химической интерпретации, чем например данные ЭПР-, ЭСР-, ВДС- экспериментов.

Ядерный магнитный резонанс - неразрушающая и неинвазивная методика, у которой есть большое количество анатомических и физиологических приложений к растительным клеткам, органам растения и живым растениям [7, 8, 9, 10, 11]. 1Н ЯМР долго использовался для исследования физического состояния воды в растительной ткани и для неразрушающего измерения молекулярного смещения, такого как поток и диффузия в растениях [12].

Содержание воды и гидравлическая удельная электропроводность, включающая транспорт внутри клеток, по мембранам, между клетками, и дальний транспорт ксилемы и флоэмы, сильно зависит от дефицита воды в растении. Благодаря возможности измерить эти процессы транспорта неинвазивно, в неповрежденном растении, будет возможно исследовать многие аспекты функционирования и производительности растения.

Приведенные доводы свидетельствуют в пользу того, что ЯМР является исключительно важным методом исследования динамики меристематических очагов в культуре растительной ткани, хотя, конечно же, ни в коей мере не умаляют значения всех остальных методов исследования.

Таким образом, ядерный магнитный резонанс является неразрушающим материал экспресс методом, дающим информацию о различных морфологических и физиологических параметрах растительных объектов, например, о размерах вакуолей в клетках растений, проницаемости клеточной мембраны, содержании воды в клетках [13], скорости и объеме потока веществ в проводящей системе [14]. Современные ЯМР эксперименты позволяют получать количественное распределение молекул воды различной подвижности (степени связности).

Цель работы - изучение возможности применения метода ЯМР-спектроскопии для оценки динамики формирования меристематических очагов в культуре ткани в зависимости от кислотности питательной среды и определение оптимальных параметров развития эксплантов растений на основе водных потоков в меристематических очагах.

Материалы, методы и объекты исследований. Обязательным условием клонального микроразмножения является использование объектов, сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса - от экспланта до растения в поле. Этому условию удовлетворяют апикальные меристемы побега [15]. Поэтому объектом для исследований являлись изолированные меристемы ели европейской (Picea abies), культивируемые на искусственных питательных средах in vitro.

Изолированные почки промывали детергентами, в проточной воде и стерилизовались поверхностно погружением в 70%-ый этанол на 30 секунд, с последующим погружением на 5 минут в 3%-ый раствор лизоформина. После этого почки были промыты в стерильной дистиллированной воде в 3- кратной повторности по 5 минут.

В качестве исходной среды для культивирования эксплантов ели европейской была выбрана среда SH (Schenck and Hildenbrandt) с добавлением кинетина (Кн) в концентрации 10 мг/л. Концентрация сахарозы в среде составляла 30 г/л, агара 6 г/л. Культивирование проводили при 21?С, освещенности 1800 люкс, фотопериоде 16/8. Кислотность среды варьировала от 4,8 до 6,0 с градаций в 0,1. Данные с образцов собирались в различные периоды культивирования (через 2, 3 и 4 недели).

Методика выполнения измерений предназначена для проведения исследований биохимических, биофизических и биологических процессов в живом растении. Чтобы характеризовать подвижность сегментов макромолекул и функциональных групп, использовалось время спин-спиновой релаксации Т2, которое возрастает с уменьшением времени корреляции движений 11H в изучаемом образце [16]. На основе измерений амплитуды ССИ определялось количество протонов водорода в образце, так как эти величины связаны линейно. Для определения времени ядерной магнитной релаксации Т2 и амплитуды сигнала ЯМР исследуемых образцов использовались импульсные последовательности Карра - Перселла - Мейбума - Гилла (КПМГ) [17,18], спада свободной индукции (ССИ) и спинового эха Хана. Время спин-решеточной релаксации (Т1) определялось путем снятия кривой восстановления продольной намагниченности (импульсная последовательность 900 - - 900). Все измерения проводились на ЯМР-анализаторе «Spin Track», зарегистрированном в Государственном реестре средств измерений Российской Федерации под номером 32677 - 06 [5], поддерживающем все возможные приложения ЯМР низкого разрешения. Процедура подготовки образца в большинстве приложений сводится лишь к помещению анализируемого вещества в пробирку и установке ее в датчик прибора. Основные параметры ЯМР-анализатора «Spin Track» приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Основные характеристики ЯМР-анализатора «Spin Track»

Теоретические расчеты, моделирование и аппроксимация экспериментальных данных проводились с использованием современного программного обеспечения Origin 6.1 и MATHCAD 2001 Professional. Построение графиков и обработка данных осуществлялась при помощи пакета программ Microcal Origin 6.1. Результаты исследований. Для экспериментов по исследованию динамики формирования меристематических очагов в культуре растительных тканей были взяты стерильные меристемы ели европейской Picea abies. Для формирования меристематических очагов были созданы условия, благоприятные для каллусообразования эксплантов, из которых в последующем при определенных сочетаниях фитогормонов можно добиться получения морфогенных структур. Результаты проведенных экспериментов по ЯМР-релаксации во временной области для Picea abies приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Экспериментальные данные ЯМР-релаксации образцов Picea abies в зависимости от кислотности среды и продолжительности культивирования

спектроскопия культивируемый неинвазивный метод

Анализируя данные, можно сделать вывод, что кислотность среды влияет на формирование меристематических очагов у анализируемых образцов. Это объясняется тем, что уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т2 говорит о снижении подвижности протонов в исследуемых образцах, что, в свою очередь, может свидетельствовать о формировании меристематических очагов в растительной ткани, которое сопровождается увеличением числа клеток и протонной плотности. Увеличение времени Т2 в процессе культивирования свидетельствует об отсутствии формирования меристематических очагов у анализируемых образцов.

На средах с кислотностью питательной среды в пределах 4,8-5,5 время спин-спиновой релаксации с течением времени уменьшается, что свидетельствует процессе формирования меристематических очагов.

На рисунке 1 показана зависимость формирования меристематических очагов культуры Picea abies от кислотности питательной среды.

Рисунок 1 - Формирования меристематических очагов культуры Picea abies в зависимости от кислотности питательной среды

Так, у образцов Picea abies наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдается на среде с кислотностью 5,2. Дальнейшее увеличение кислотности снижает интенсивность формирования меристематических очагов.

Таким образом, у образцов Picea abies уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т2, а, следовательно, и наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдается на питательной среде с кислотностью 5,2.

На следующих рисунках приведены графики спада поперечной намагниченности у образца Picea abies, культивируемого на среде с кислотностью 5,2 через 2 (рис. 2) и 4 (рис. 3) недели культивирования.

Рисунок 2 - Спад поперечной намагниченности у образца Picea abies, культивируемого на среде с кислотностью 5,2 через 2 недели культивирования

Рисунок 3 - Спад поперечной намагниченности у образца Picea abies, культивируемого на среде с кислотностью 5,2 через 4 недели культивирования

Таким образом, применение ЯМР-спектроскопии в культуре ткани позволяет своевременно оценивать и, при необходимости, изменять условия культивирования эксплантов на различных этапах микроклонального размножения, а также существенно увеличивать эффективность подбора компонентов питательных сред и, как следствие, ускорять процесс размножения растений [19].

Также с помощью магниторезонансной релаксации возможно проведение исследований биохимических, биофизических и биологических процессов в живом растении. ЯМР-спектроскопия позволяет получать распределение плотности вещества, исследовать диффузные и направленные потоки в объеме образца, не прибегая к препарированию. Это позволяет изучать объекты непосредственно в живом состоянии (in vivo).

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на на 2007 - 2013 годы» при финансовой поддержке Минобрнауки России (Государственный контракт №14.518.11.7055 от 20.07.2012 г.) на базе Биотехнологического комплекса по воспроизводству высших растений в условиях «чистой комнаты».

Список литературы

1. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: Учеб. пособие / Р.Г. Бутенко. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

2. Кузнецов, Вл.В. Физиология растений: Учеб. для вузов / Вл.В. Кузнецов, Г.А. Дмитриева. М.: Высш. шк., 2005. - 736 с.

3. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Дегтярёв, Г.М. Артамонова и др. М.: Изд-во МСХА, 1995. - 310 с.

4. Слонимский, Г.Л. Современные физические методы исследования полимеров/ Под. ред. Г.Л. Слонимского - М.: Химия, 1982.

5. Рот, Г.К. Радиоспектроскопия полимеров / Г.К. Рот, Ф. Келлер, Х. Шнайдер - М.: Мир, 1987.

6. Walter, L. Studies of plant systems by in vivo NMR spectroscopy / L. Walter, R. Callies, R. Altenburger // In: de Certaines JD, Boveґe WMMJ, Podo F, eds. Magnetic resonance spectroscopy in biology and medicine. Oxford: Pergamon Press. - 1992. - P. 573-610.

7. Ratcliffe, R.G. In vivo NMR studies of higher plants and algae / R.G. Ratcliffe // Advances in Botanical Research. - 1994. - Vol. 20. - P. 42-123.

8. Shachar-Hill, Y. Nuclear magnetic resonance in plant biology / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Rockville: American Society of Plant Physiologists. - 1996.

9. Chudek, J.A. Magnetic resonance imaging of plants / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. - 1997. - Vol. 31. - P. 43-62.

10. Ishida, N. The NMR microscope, a unique and promising tool for plant science / N. Ishida, M. Koizumi, H. Kano // Annals of Botany. - 2000. - Vol. - 86. - P. 259-278.

11. MacFall, J.J. Magnetic resonance imaging of plants / MacFall J.J, As. H. Van // The American Society of Plant Physiologists.-.1996. - P. 33-76.

12. Scheenen T.W.J, van Dusschoten D., de Jager P.A., Van As H., Quantification of water transport in plants with NMR imaging, J. Exp. Bot. 51(351), 2000, p. 1751-1759.

13. Windt C.W., Gerkema E., Oosterkamp J., Van As H., MRI of long-distance water transport: a comparison of the phloem and xylem flow characteristics and dynamics in poplar, castor bean, tomato and tobacco, Plant Cell Envir. 29(9), 2006, p. 1715-1729.

14. Чижик В.И., Ядерная магнитная релаксация.- Ленинград, Изд-во Ленинградского университета, 1991.

15. Грунин, Л.Ю. Протонная магнитная релаксационная спектроскопия природных полимеров: дис. … канд. хим. наук : 02.00.04 : защищена 21.12.98 : утв. 14.05.99 / Грунин Леонид Юрьевич. - Йошкар-Ола, 1998. - 142 с.

16. Грунин, Ю. Б Импульсный метод ЯМР для определения термодинамических характеристик адсорбционных процессов в биополимерах / Ю. Б.Грунин, Л. Ю.Грунин, Е. А.Никольская // Журн. физ. химии. - 2007. - Т.81, № 7. - С. 1165-1170.

17. Сергеев, Р.В. Изучение растительных объектов в культуре in vitro методом ЯМР релаксации // Р.В. Сергеев, П.С. Новиков, Е.Н. Черных, А.И. Шургин, Е.А. Лобанова, Т.Ф. Худякова / http://ej.kubagro.ru/a/viewaut.asp?id=2396

18. http://www.9lc.com/kultura-tkaney-rasteniya.html

19. Butenko, R.G. Biologija kletok vysshih rastenij in vitro i biotehnologija na ih osnove: Ucheb. posobie / R.G. Butenko. M.: FBK-PRESS, 1999. - 160 s.

20. Kuznecov, Vl.V. Fiziologija rastenij: Ucheb. dlja vuzov / Vl.V. Kuznecov, G.A. Dmitrieva. M.: Vyssh. shk., 2005. - 736 s.

21. Sel'skohozjajstvennaja biotehnologija / V.S. Sheveluha, S.V. Degtjarjov, G.M. Artamonova i dr. M.: Izd-vo MSHA, 1995. - 310 s.

22. Slonimskij, G.L. Sovremennye fizicheskie metody issledovanija polimerov/ Pod. red. G.L. Slonimskogo - M.: Himija, 1982.

23. Rot, G.K. Radiospektroskopija polimerov / G.K. Rot, F. Keller, H. Shnajder - M.: Mir, 1987.

24. Walter, L. Studies of plant systems by in vivo NMR spectroscopy / L. Walter, R. Callies, R. Altenburger // In: de Certaines JD, Boveґe WMMJ, Podo F, eds. Magnetic resonance spectroscopy in biology and medicine. Oxford: Pergamon Press. - 1992. - P. 573-610.

25. Ratcliffe, R.G. In vivo NMR studies of higher plants and algae / R.G. Ratcliffe // Advances in Botanical Research. - 1994. - Vol. 20. - P. 42-123.

26. Shachar-Hill, Y. Nuclear magnetic resonance in plant biology / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Rockville: American Society of Plant Physiologists. - 1996.

27. Chudek, J.A. Magnetic resonance imaging of plants / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. - 1997. - Vol. 31. - P. 43-62.

28. Ishida, N. The NMR microscope, a unique and promising tool for plant science / N. Ishida, M. Koizumi, H. Kano // Annals of Botany. - 2000. - Vol. - 86. - P. 259-278.

29. MacFall, J.J. Magnetic resonance imaging of plants / MacFall J.J, As. H. Van // The American Society of Plant Physiologists.-.1996. - P. 33-76.

30. Scheenen T.W.J, van Dusschoten D., de Jager P.A., Van As H., Quantification of water transport in plants with NMR imaging, J. Exp. Bot. 51(351), 2000, p. 1751-1759.

31. Windt C.W., Gerkema E., Oosterkamp J., Van As H., MRI of long-distance water transport: a comparison of the phloem and xylem flow characteristics and dynamics in poplar, castor bean, tomato and tobacco, Plant Cell Envir. 29(9), 2006, p. 1715-1729.

32. Chizhik V.I., Jadernaja magnitnaja relaksacija.- Leningrad, Izd-vo Leningradskogo universiteta, 1991.

33. Grunin, L.Ju. Protonnaja magnitnaja relaksacionnaja spektroskopija prirodnyh polimerov : dis. … kand. him. nauk : 02.00.04 : zashhishhena 21.12.98 : utv. 14.05.99 / Grunin Leonid Jur'evich. - Joshkar-Ola, 1998. - 142 s.

34. http://www.nmr-design.com/ru/

35. Grunin, Ju. B Impul'snyj metod JaMR dlja opredelenija termodinamicheskih harakteristik adsorbcionnyh processov v biopolimerah / Ju. B.Grunin, L. Ju.Grunin, E. A.Nikol'skaja // Zhurn. fiz. himii. - 2007. - T.81, № 7. - S. 1165-1170.

Размещено на Allbest.ru