Анализ микроорганизмов, обитающих в ризосфере и ризоплане Astragalusaustriacusl

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева»

Факультет естественных наук

Кафедра ботаники, физиологии и биохимии растений

Выпускная квалификационная работа

Направление подготовки:06.03.01 Биология

Квалификация: бакалавр

Анализ микроорганизмов, обитающих в ризосфере и ризоплане Astragalusaustriacusl.

Малинина Анастасия Юрьевна

Научный руководитель:

к.б.н., доцент

Цуцупа Татьяна Анатольевна

Орел 2016



Введение

Элементы микробиоценоза почвы, составляющего одну из сторон биогеоценозов, характеризуются тесными и сложными взаимоотношениями с растениями, о чем свидетельствуют многочисленные данные, полученные экспериментальным путем [1, 2, 4, 9, 25]. Роль микроорганизмов ризосферы и ризопланы весьма разнообразна, но функции их сводятся, в большинстве случаев, к положительному влиянию на растения. К таковым относятся и симбиотические отношения азотофиксирующих клубеньковых бактерий с бобовыми растениями, и равновесный взаимообмен различными веществами (ауксинами, аминокислотами, витаминами, ферментами и др.) между микроорганизмами и растениями, и защитные барьеры против патогенных грибов, которые образуют аборигенные микроорганизмы ризосферы [23, 28].

Разнообразные группы микроорганизмов, отличающиеся биологической и биохимической специфичностью, принимают активное участие и в формировании почвы [14]. Количественный же состав и соотношение представителей микробоценоза зависит от конкретных факторов, воздействующих на почву: влажность, химический состав, способ обработки и др. Кроме того, изменение смены бактериальных компонентов ризосферы и ризопланы коррелирует с процессами формирования биоморфы и вегетации растений [1, 4, 9].

На сегодняшний день недостаточно данных о составе микробоценозов различных нестерильных почв естественных биогеоценозов. Степные сообщества накапливают значительную биомассу, как в надземных, так и в подземных частях. Органические остатки, разлагаясь при высоких летних температурах и недостатке влаги, образуют гумус, который легко минерализуется. Гумусовый слой почвы подвергается промыванию, так как воды осадков не просачиваются вглубь, оставаясь близ поверхности; он богат соединениями кальция и обладает прочной комковой структурой. Так, на территории памятника природы «Балка Непрец», расположенного в окрестностях города Орел Орловской области, на осадочных породах, бедных микроэлементами расположены деградированные черноземы с мощным гумусовым и неразвитым подзолистым горизонтом с незначительным количеством подвижных форм фосфора и калия. Даже черноземы имеют слабую обеспеченность растений элементами пищи, в том числе и некоторыми микроэлементами. Кроме того, на склонах балки встречаются осыпи известняковой щебенки, обнажившейся в результате разработок известняка для строительства дорог[24], где слой гумуса незначительный (до 10 -12 см).

Актуальность. На сегодняшний день недостаточно данных о составе микробоценозов различных нестерильных почв естественных биогеоценозов. В связи с чем, изучение микробного населения карбонатных почв под остепненными лугами весьма актуально. Полученные результаты могут быть использованы при решении вопроса улучшения естественных угодий, как пастбищных и сенокосных, так и восстанавливаемых на территориях ООПТ и, в частности, памятников природы.

Цель нашей работы состояла в изучении состава микроорганизмов ризосферы и ризопланы генеративных растений астрагала австрийского (AstragalusaustriacusL.).

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. выявить состав микроорганизмов ризосферы и ризопланы астрагала австрийского;

2. определить сезонное влияние на качественное и количественное содержание бактерий;

3. спрогнозировать варианты улучшения состояния и состава почвенного покрова на территории северных степей, сформировавшихся на осадочных породах (девонская, каменноугольная, юрская, меловая и четвертичная системы).

Предмет исследования: почвы, формирующиеся под северными степями, в условиях обнажения известняка, влияние микроорганизмов на улучшение ее структуры и состава.

Объект исследования: микробное население ризосферы и ризопланы астрагала австрийского.

Научная новизна. Новизна исследования связана с изучением микробного населения карбонатных почв конкретных территорий естественных биогеоценозов с целью улучшения или восстановления почвенного слоя, что коррелирует с сохранением биоразнообразия растительного и животного мира. Особенности нестерильных карбонатных почв, обладающих невысокой плодородностью, определяют характер растительности, на них формирующейся. Растения не имеют глубокую корневую систему и получают необходимые микроэлементы только из верхних слоев почвы, разнообразие которых, порой, может быть весьма незначительным. Кроме того, нейтральная или слабощелочная среда препятствует усвоению растениями железа и марганца.

Ожидаемые результаты: Определение микробного населения прикорневой зоны растений позволяет определить качественный состав бактерий, способствующих решению проблемы улучшения плодородия почвы и снабжения растений необходимым набором микроэлементов. При решении вопроса о коренном улучшении состава карбонатных почв будут определены группы микроорганизмов, штаммы которых можно будет вносить в прикорневую сферу конкретных растений для их активного роста и улучшения физиологический активности.

Апробация работы:

1. В форме статьи «Состав микробных ценозов ризосферы и ризопоаны астрагала австрийского (AstragalusaustriacusL.), произрастающего на карбонатных почвах» в материалах III Международной очной научно-практической конференции «Актуальные проблемы естественнонаучного образования, защиты окружающей среды и здоровья человека», 2016г;

2. На ежегодной научной конференции "Неделя науки - 2016" в Орловском государственном университете имени И.С. Тургенева, выступление с докладом;

3. Во «Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов» в номинации «Лучший научно-исследовательский проект» на базе Волгоградского государственного социально-педагогического университета с научным проектом «Оценка микробных ценозов ризосферы и ризопланы растений, произрастающих на карбонатных почвах». Проект занял третье призовое место.

микробный ризосфера растительный



1. Материал и методика исследования

Объектом нашего исследования явились микроорганизмы ризосферы и ризоплана астрагала австрийского (Astragalus austriacus Jacq.).

Исследования проводили в течение вегетационного периода (весна - осень 2015г.) на территории памятника природы «Балка Непрец» (Орловский район, Орловская область).

При выполнении работы были использованы следующие методики, изложенные в «Практикуме по микробиологии» [3, 21, 22]:

1. Определение полевой влажности почвы.

2. Приготовление питательных сред.

3. Приготовление почвенной суспензии и посев.

4. Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова.

5. Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер).

6. Метод окраски клеток микроорганизмов по Граму.

Рассмотрим каждую методику подробнее.

Определение полевой влажности почвы

Пробы для определения влажности почвы брали в поле ножом со стенки разреза глубиной 10 см. Образцы отбирали из отдельных горизонтов почвы. Почвенные пробы помещали в стерильные бумажные пакеты.

В лаборатории на технических весах взвешивали алюминиевые бюксы с точностью до 0,01 г, наполняли 1/3 часть их почвой, закрывали крышкой и снова взвешивали. Затем ставили в сушильный шкаф при t = 100 - 105°С и сушили до постоянной массы. Крышки снимали и одевали на дно стаканчиков. После просушивания закрытый стаканчик охлаждали в эксикаторе и снова взвешивали.

Полевую влажность почвы рассчитали по формуле:

W=100а/в, (1)

где W - полевая влажность, %;

а - масса испарившейся влаги, г;

в - масса сухой почвы, г.

Полученные данные изложены в таблице №1.

Таблица №1 Показатели полевой влажности почвы

Генетический горизонт и глубина образца, см	Номер бюкса	Масса бюкса, г	Масса бюкса с влажной почвой, г	Масса бюкса с сухой почвой, г	Масса сухой почвы, г	Масса испарившейся влаги, г	Содержание влаги, %
10	1	105,32	115,34	113,38	8,06	1,96	24,32
10	2	96,23	106,24	103,91	7,68	2,33	30,34
10	3	96,21	106,23	104,07	7,86	2,16	27,48
10	4	105,19	115,19	113,22	8,03	1,97	24,53
10	5	102,56	112,57	110,69	8,13	1,88	23,12

Приготовление питательных сред

Мясо-пептонный бульон (МПБ). Для приготовления мясо-пептонных сред мы использовали мясной бульон, который получали следующим образом: 500 г мелко изрубленного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливали в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50 °С, и оставили настаиваться 1 ч при 50--55 °С в жаро - сушильном шкафу. Мясо отжимали, экстракт процеживали через марлю со слоем ваты, кипятили 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтровали дважды (первый раз через марлю с ватой, второй -- через бумажный фильтр). Фильтрат доливали водой до 1 л, разливали в колбы, закрывали ватными пробками и стерилизовали при 120 °С 20 мин (пробки колб закрывали сверху колпачками из бумаги). Пробки на колбы изготовляли из ваты и марли и стерилизовали. Пробки делали плотными, так как они служат фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации.

Затем устанавливали нейтральную реакцию среды, добавляя незначительное количество мела (CaCO₃).

После этого среду снова кипятили 5--10 мин, и белки, свернувшиеся при изменении реакции среды, отфильтровывали через бумажный фильтр без осветления бульона. Смесь кипятили, помешивая, на слабом огне 10 мин, затем фильтровали. Прозрачный мясо-пептонный бульон разливали в колбы, закрывали ватными пробками и стерилизовали при 120°С 20 мин.

В дальнейшем МПБ использовали для приготовления МПА.

Мясо-пептонный агар (МПА). К 1 л МПБ добавляли 15 - 20 г агара. Среду нагревали до растворения агара (температура его плавления -- 100°С, затвердевания -- 40^о С), установили слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Ка₂С0₃ и через воронку разливали по чашкам Петри слоем 0,5 - 0,7 мм и маркировали (номер чашки и номер повторности) (Рисунок 1).

Чашки со средой стерилизовали в автоклаве при 120°С 20 мин.

Рисунок №1 Пронумерованные чашки Петри

Картофельный агар. Для приготовления КА мы использовали 200 г очищенного и промытого водой картофеля, который нарезали ломтиками, заливали 1 л водопроводной воды, варили 30 мин. Отвар профильтровывали через вату и добавили воду до первоначального объема. К полученной жидкости прибавляли 2% агара, кипятили до его расплавления и устанавливали нейтральную реакцию среды (рН = 7) добавив незначительное количество мела (CaCO₃). Среду стерилизовали 20 мин при 120^о С сухим жаром в электросушильном шкафу.

Приготовление почвенной суспензии и посев

Для приготовления почвенной суспензии использовали почву, принесенную с поля. Часовые стекла, шпатели и ложки стерилизовали 20 мин при 120^о С сухим жаром в электросушильном шкафу. На стерильное часовое стекло, предварительно взвешенное, стерильным шпателем помещали 10 г почвы. Чтобы при взвешивании в почву не попали микроорганизмы из воздуха, особенно споры грибов, часовое стекло накрывали другим часовым стеклом.

Навеску почвы переносили в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывали 10 мин и давали отстояться грубым частицам почвы.

Одновременно со взятием навески для анализа из средней пробы отбирали 10 - 20 г почвы для определения влажности, так как полученные при анализе данные пересчитывали на 1 г абсолютно сухой почвы.

Перед приготовлением суспензии для каждого образца готовили 2 стерильные колбы на 250 мл; одна содержала 100 мл стерильной водопроводной воды, другая -- пустая. Водой из первой колбы растертую почвенную массу смывали в пустую стерильную колбу. Колбу с полученной суспензией встряхивали 5 мин, затем оставили на 30 с (Рисунок 2) и готовили разведения, содержащие разные концентрации почвы. 1 мл суспензии в первой колбе соответствовало разведению 10^-1. Последующие разведения (10^-2; 10^-3; 10^-4; 10^-5; 10^-6 и т. д.) тоже делали в колбах на 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды.

Из каждого предыдущего разведения отдельной стерильной пипеткой брали 10 мл суспензии и переносили в следующую колбу с 90 мл воды (Рисунок 3). Всякий раз пипетку ополаскивали и отставляли. Последующие колбы встряхивали по 1 мин.

Из полученных разведений делали посев на плотные и жидкие среды.

Оценку видового состава изучаемых микроорганизмов проводили методом посева полученной суспензии на плотные питательные среды: МПА, картофельный агар.

Рисунок №2. Приготовление почвенной суспензии



Рисунок №3. Подготовка последовательных разведений почвенной суспензии

На плотные питательные среды посев проводили преимущественно поверхностно. Для этого агаризованные питательные среды разливали в стерильные чашки Петри и после охлаждения подсушивали в термостате при 40°С. На поверхность агаровой пластины стерильной градуированной пипеткой наносили 0,05 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения, затем стеклянным шпателем Дригальского растирали каплю досуха; при этом открытую чашку держали в вертикальном положении около пламени горелки. Посев из каждого разведения проводили минимум на 5 параллельных чашках.

Для глубинного посева брали 1 мл почвенной суспензии из разведения на порядок меньшего, чем для поверхностного посева.

Суспензию вносили в стерильную чашку Петри, заливали агаром, расплавленным и охлажденным до 45°С, и смешивали с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие, чем при поверхностном.

Учет бактерий в ризосфере методом Красильникова

Стерильной лопатой подкапывали почву под растением, стерильным пинцетом извлекали корни. Приставшую к корням почву стряхивали в стерильную чашку Петри, перемешивали и из нее брали навеску в 1 г.

Навеску помещали в 100 мл стерильной водопроводной воды и готовили ряд разведений.

При поверхностном посеве из полученных разведений стерильной микропипеткой наносили на поверхность питательных пластин (МПА) по 0,05 мл и шпателем досуха втирали в агар. При глубинном посеве из разведений стерильной пипеткой брали 1 мл суспензии и вносили в стерильную чашку Петри, а затем добавляли соответствующую агаризованную питательную среду.

Выросшие на агаре колонии подсчитывают визуально и под лупой.

Для определения качественного состава бактерий колонии на чашке группировали по культуральным признакам. Из каждой группы готовили препарат и выявляли форму бактерий.

Учет ризосферной и корневой микрофлоры методом последовательных отмываний корней (по Теппер)

Из выкопанных монолитов почвы с растениями стерильными пинцетом и ножницами отбирали 1 г молодых корней примерно одного диаметра с приставшими к ним частицами почвы.

Корни помещали в 1 - ю колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды и взбалтывали 2 мин. Стерильным крючком, сделанным из обычной бактериологической иглы, корни извлекали и переносили последовательно во 2 - ю, 3 - ю и т. д. до 7 - й колбы, также содержащие по 100 мл стерильной водопроводной воды. В каждой колбе корни отмывали по 2 мин. В последнюю 7-ю колбу перед стерилизацией добавили в воду 3 - 5 г песка.

Из каждой колбы отдельно стерильной пипеткой брали 0,05 мл отмывной воды, наносили на поверхность питательной пластины (МПА) и отдельным шпателем Дригальского, держа полуоткрытую чашку около пламени горелки, втирали в среду досуха. Чашки помещали в термостат при t=28 - 30 °С. Спустя 3--5 сут чашки анализировали.

Метод окраски клеток по Граму

На хорошо обезжиренное стекло наносили три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них - контрольные, с заведомо известным отношением к окраске по Граму: дрожжи - грамположительные, кишечная палочка - грамотрицательная). Мазки высушивали на воздухе, фиксировали над пламенем горелки и окрашивали в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держали стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливали и, не промывая препарат водой, наносили на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае держали в наклонном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывали, непрерывно покачивая, 96% - ным спиртом в течение 15 - 20 секунд.

Промыв водой, препарат окрашивали фуксином Пфейфера в течение 1 мин. После чего снова промывали водой. При этом поле зрения оставалось прозрачным, а бактерии имели ярко выраженную окраску. После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобрели тёмно - фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрасились лишь в цвет дополнительной окраски (фуксина).

Результаты окраски по Граму зависели от возраста культуры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашивались грамотрицательно.

Идентификацию микроорганизмов осуществляли используя культуральные признаки и морфологические свойства.

Особое внимание уделяли таким систематическим признакам микроорганизмов как: профиль колоний, край колоний, размеры, поверхность, оптические свойства поверхности, цвет, структура колоний, консистенция.

Определение культур проводили с помощью определителя Берджи [19].



2. Почвенные микробные сообщества, их роль в жизни растений

2.1 Связь растений с микроорганизмами

2.1.1 Роль микроорганизмов в жизни растений

Всю деятельность микроорганизмов, окружающих растение можно свести к двум наиболее значимым воздействием на растительный организм: положительное и отрицательное воздействие.

Позитивная роль микробов связана, в первую очередь, с разложением и минерализацией растительных остатков в частности и отмершей органики в целом. Положительный эффект этого процесса направлен на возвращение в почву минеральных элементов, необходимых для роста и развития растений, углекислого газа (CO₂), аммиака (NH₃) и некоторых других газов - в атмосферу, которые в последствие вновь усваиваются растениями самостоятельно или с участием различных бактерий.

Азот, необходимый живым организмам для построения собственных аминокислот, вовлекается в биогенные циклы бактериями, именно им отводится в этом ключевая роль. Наиболее изученные азотофиксаторы - это симбиотические азотфиксирующие бактерии рода Rhizobium, Bradyrhizobium, Azospirillum и некоторые другие.

Поступлению фосфора в растение способствуют грибы, мицелий которых обрастает корни растений с образованием микоризы.

Ризосферные микроорганизмы способствуют защитным свойствам одних растений относительно других. Положительная роль микроорганизмов в жизни растений определяется также и биологически активными веществами, выделяемыми бактериями.

Биологически активные вещества способствуют активному росту растений, увеличению урожайности и повышению качества продукции.

Негативное воздействие на растения определяется паразитизмом.

2.1.2 Роль растений в жизни микроорганизмов

Микроорганизмы, как редуценты, используют в качестве источника питания отмершую органику, которую составляют организмы животных и растений. Бактерии, участвующие в минерализации органических веществ могут быть как аэробами, так и анаэробами.

Нередко микроорганизмы, изначально паразитируя на растениях, приводят их к гибели, после чего уже в пассивной форме используют их как источник питания. В целом растение можно расценивать как среду обитания для бактерий, микромицетов и макромицетов. В то же время растения способны организовать в своем окружении определенные условия, благоприятно сказывающихся на рост и развитие микроорганизмов. Экспериментально доказано, что нарушение этого равновесия связано с недостаточным синтезом растениями аминокислот (BrianR.W.): цистеина, пролина, а также факторов роста - биотина и тиамина (WestP.M.).

Корневые выделения могут составлять около 20% от общего количества продуктов фотосинтеза растений. В их составе: пептиды, аминокислоты, алколоиды, гликозиды, витамины, органические кислоты, такие как, яблочная, лимонная, фумаровая, янтарная, винная, щавелевая и др.

Корневые выделения - благоприятный пищевой субстрат для активного роста в зоне корня представителей микрофлоры. При этом наличие тех или иных веществ в составе корневых выделений определяют рост в зоне корня представителей микрофлоры разных таксонов и их активность как антагонистов в отношении микобиоты.

Растения обеспечивают и защиту микроорганизмов, и их распространение в почве, что проявляется в физическом переносе микрофлоры как вглубь, так и на поверхность почвы.

При поедании растений животными разного уровня организации микроорганизмы попадают в желудочно-кишечный тракт этих животных. Часть микроорганизмов погибает, а часть с экскрементами опять попадает на поверхность растений и почву. Поэтому можно говорить о цикле микроорганизмов, где растения исполняют роль и переносчиков, и субстратов одновременно.

2.2 Понятие ризосферы и ризопланы

2.2.1 Характеристика ризосферы

Ризосфера (сфера корня) - пространство почвы, окружающее корень растения примерно от 0 до 8 мм в диаметре, характеризующееся более высокой плотностью микроорганизмов - бактерий, актиномицетов, грибов. Численность их может в сотни раз превышать количество микробных клеток в окружающем грунте [5, 7, 12, 14]. Что связано с выделениями корня и взаимообратным влиянием микроорганизмов на корневую систему растений.

Микробная активность ризосферы определяется корневыми эксудатами, которые микроорганизмы используют для питания и защиты от антагонистических действий других микроорганизмов. В ризосфере могут быть обнаружены бактерии и полезные свободноживущие, и «ассоциативные», и нейтральные для растений, и патогены - возбудители болезней. Микроорганизмы, оказывающие положительный эффект на растения, принято называть plantgrowth - promotingrhizobacteria (PGPR) [14, 17, 27].

Экспериментально неоднократно было отмечено, что состав микроорганизмов ризосферы меняется в зависимости от вегетации и сезона, от влажности почвы и климатических условий [4]. К примеру, в ризосфере CucurbitapepoL. (тыквы), TriticumaestivumL. (пшеницы), HordeumdistichonL. (ячменя), AvenasativaL. (овса) наибольшая численность микроорганизмов наблюдается в период цветения и плодоношения [4, 9]. Кроме того, выявлена и стимулирующая активность последних на рост растений. Так для проростков льна наиболее активными стимуляторами являются Bacillusvulgaris, B. agglomeratus, Pseudomonasrubigenosa, P. caudatus[25]. Микроорганизмы выделяют биологически активные вещества, способные усиливать рост растений и повысить урожайность и качество продукции. При этом, если выделенные штаммы бактерий из ризосферы одного растения внести в ризосферу растений других видов, можно добиться более активного роста и устойчивости растений к некоторым заболеваниям [25]. Подобные исследования по выявлению определенных видов бактерий, способных активизировать рост растений, проводились и на бобовых растениях. Выявленными штаммами бактеризовали семена зерновых сельскохозяйственных культур, картофеля и свеклы. Определенное влияние на развитие растений оказывают витамины, аминокислоты, гетероауксины и ферменты, продуцируемые микроорганизмами [10, 12, 27].

Микробы, населяющие ризосферу, в основном сапрофиты, более активны в присутствие углеводов: маннита, крахмала, лактозы, ксилозы, сорбита. Источники углерода активизируют микроорганизмы на синтез продуктов метаболизма, стимулирующих рост растений в целом, и проростков в частности [25].

Представители рода Rhizobium, относящиеся к симбиотрофам, перед вступлением с растениями во взаимовыгодные отношения первоначально должны распознать вещество (состав которого пока неизвестен), выделяемое корнями бобовых растений, после чего сами вырабатывают Nod-фактор. Этим самым сообщая растению о своем присутствии в прилегающем к корню слое почвы. После чего, на корнях растения формируются корневые клубеньки, в которых поселяются бактерии, получающие от растения-хозяина питательные вещества. Эти микробы переводят азот в форму, легко усваиваемую растением.

Кроме симбиотических азотофиксаторов в ризосфере присутствует целая армия свободноживущих азотофиксирующих бактерий, фиксирующих азот в почве, окружающей, например, корни многих злаков. Однако тесной связи с растениями эти бактерии не имеют, но от их деятельности зависит состояние растений. Например, азотофиксирующие бактерии, обитающие в ризосфере риса, имеют сходные с растениями суточные циклы и поставляют в почву больше связанного азота в фазу активного роста растения, которое именно в данный период особенно в нем нуждается [29].

Кроме того, микробное население ризосферы активно вовлекает различные химические элементы в биогенные процессы. Например, фиксация азота воздуха, перевод его в простые соли, растворение фосфора и калия. Некоторые бактерии являются источником микроэлементов, другие - ферментативно разлагают гуминовые соединения. Уже доказано, что функция азотофиксации принадлежит не только Azotobacter, Clostridium, Azospirillum, Beijerinckia, Derxia, но в большей степени энтеробактериям. В настоящее время к фиксации азота из атмосферы способны 80-90% всех известных бактерий [5, 16].

Растения, в свою очередь, бережно относятся к своим партнерам, защищая их от хищных организмов, выделяя в окружающую среду фитонциды и антибиотики. С другой стороны, в ризосфере встречаются антагонисты, препятствующие размножению патогенных организмов [12, 27]. Поэтому в природе растения практически не страдают от корневых гнилей.

В целом, по утверждению Алексиной [1], механизмы влияния микробов на растения можно свести к следующим моментам:

1. Контроль за поступлением в корень минеральных элементов из почвы.

2. Синтез фитогормонов.

3. Ингибирование роста растений различными метаболитами.

4. Подавление активности неблагоприятной для растений микробиоты.

5. Стимулирование эндосимбиоза растений и микроорганизмов.

2.2.2 Характеристика ризопланы

Ризоплана - это пространство поверхности корня, заселенное микроорганизмами [12, 17, 27]. Впервые термин «ризоплана» был применен Кларком в 1949г.

Так же как и в ризосфере, в ризоплане отмечается интенсивная микробная активность, которая напрямую зависит от корневых экссудатов и условий среды. Было отмечено, что в ризоплане слабо размножаются целлюлозоразлагающие микроорганизмы, актиномицеты и грибы, численность которых в несколько раз превышает таковых в ризосфере [2]. Увеличение же численности целлюлозоразлагающих микроорганизмов связано со стадиями развития растений. Наибольшее их количество обнаружено в фазе цветения растений, но к фазе созревания численность бактерий резко сокращается. Возможной причиной может быть изменение состава корневых выделений у растений, служащих источником питания для бактерий [1, 2]. В ризоплане преобладают сопрофитные бактерии, и в первую очередь бактерии рода Pseudomonas.

Количество микроорганизмов в ризоплане значительно больше, чем в ризосфере [2]. К доминирующим бактериям микробоценоза ризопланы, например, Cucurbitapepo, относят Shewanellaputrefaciensи Serratiaodorivera- грамотрицательные палочки. В меньшей степени (по сравнению с ризосферой) в ризоплане отмечены Bacillussubtilis, B. Megaterium[4].

Микроорганизмы ризопланы находятся в более выгодном положении, чем в ризосфере, так как при любых негативных проявлениях внешних условий (например, уменьшение влажности) корневые выделения растений служат своеобразной «буферной» средой.

2.2.3 Микробно - растительные взаимодействия в ризосфере и ризоплане

Большинство растений, продуцируя семена, снабжают свои зародыши питательными веществами и обеспечивают необходимой энергией проростки в первые дни их жизни. Все семена имеют защитные семенные оболочки, которые защищают зародыши от механических повреждений, перепадов температур и болезнетворных микроорганизмов. Но существует общеизвестный факт, что семена некоторых растений не способны прорасти без участия микроорганизмов. Например, орхидные обязательно вступают в симбиотические отношения с грибами именно в период набухания и прорастания семян. Именно грибы обеспечивают необходимыми веществами, а, следовательно, и энергией зародыши орхидных, семена которых не имеют своих запасных питательных веществ. Таким же образом семена и прорости других растений сталкиваются с разнообразными микроорганизмами в почве[27].

Прорывая семенную кожуру корешок первым проникает в грунт, где контактирует с бактериями, актиномицетами и грибами. Тем самым вокруг корешка начинает формироваться ризоплана и ризосфера. По мере прорастания в контакт с микроорганизмами вступает и корневая шейка, и гипокотиль, и, у многих растений, базальные участки побегов. Причем, первые этапы развития растения характеризуются слабой экссудативной способностью. Молодой корешок при прорастании сталкивается с неспецифическими микроорганизмами. Вследствие чего не происходит его инфицирования. Однако, если в окружающем корень слое почвы присутствуют специфические для него бактерии - его инфицирование происходит. Этот процесс могут осуществлять и непатогенные микроорганизмы (клубеньковые бактерии, микоризные грибы) и типичные патогены [12].

Дальнейший рост растения и развитие корневой системы связаны с процессами формирования в прикорневой зоне особой сложной экологической ниши, где с успехом могут заселяться и полезные, и нейтральные, и патогенные для растения микроорганизмы. Как результат, в процессе онтогенеза растения в ризосфере складываются микробно - растительные взаимодействия, основанные на раздельном симбиотрофизме. Микроорганизмы используют в качестве питания выделения растений, размножаются в ризосфере и ризоплане, контролируют, в свою очередь, поступление веществ в корни. Существуют определенные закономерности влияния на микробные сообщества конкретных растений. Решение вопроса о возможности использования определенных штаммов микроорганизмов, выделенных из ризосферы и ризопланы одних растений и внедрение их в прикорневую зону других, позволит определить пути повышения урожайности сельскохозяйственных культур и плодородия почвы [27].

В качестве одного из показателей ризосферы растений используется количественное отношение - ризосфера/почва (R/S). Оно иллюстрирует заселенность прикорневой зоны различными микроорганизмами, при этом показывает количественное преобладание определенных видов (родов, семейств и т.д.) в ризосфере над таковыми в почве. Установлено, что величина R/S составляет примерно от 2 до 25.

Так, микробное население ризосферы в большей степени составляют грамотрицательные бактерии с преобладанием среди них представителей рода Pseudomonas. Некоторые их штаммы (P. putida, P. fluorescens, P. aureofaciens, P. corrugateи др.) обеспечивают лучший рост и развитие растений. Всеонивходятвгруппу PGPR (plant growth - promoting rhizobacteria). Кроме того, на ранних этапах развития растений, среди доминирующих бактерий отмечены псевдомонады, флавобактерии, азотобактер.

По мере роста и развития растения эти микроорганизмы заменяются на грамположительные. Это связано с тем, что бактерии, использующие продукты экзоосмоса растений, замещаются на гидролитиков, разлагающих корневой отпад и биомассу микробов. Кроме того, в процессе онтогенеза изменяется характер состава корневых выделений [15].

Например, И.Б. Бороздиной [6] было отмечено, что в ризосфере гороха, фасоли и подсолнечника уменьшается численность аэробных гетеротрофов, азотофиксирующих бактерий и актиномицетов. Но при этом, возрастает численность нитрифицирующих бактерий и микромицетов.

Увеличение численности микроорганизмов в прикорневой зоне напрямую коррелирует с эксудатами корня. Это явление принято называть ризосферным эффектом.

Однако не следует забывать, что общая численность микроорганизмов зависит от типа почвы, ее структуры и влажности, от вида растения, его онтогенеза, сезона и т.п. Еще один фактор, который не следует забывать при характеристике микробно-растительных взаимодействий - снижение численности микробов в почве и изменение их качественного состава связаны с чрезмерной нагрузкой на окружающую среду, например, вырубка леса [8].

2.3 Ризосферная микрофлора

Все растения на Земле, в основном, являются основным источником питательных веществ для подавляющего числа микробного населения почв - гетеротрофов, и оказывают огромное влияние на микробные ценозы. Особенно активно микроорганизмы развиваются в зонах, примыкающих к корням растения. Это связано, прежде всего, с выделениями из корней (экзосмосом) органических веществ, синтезированных растениями. Ризосферной микрофлорой называют зону вокруг корней растений, а саму зону - ризосферой [18].

Так же, имеет место представление о ризоплане - непосредственной поверхности корня, заселенной микробами. Естественно, что обмен веществ корней, оказывает большое влияние на почвенную среду, непосредственно у корней. Известно, что корни увеличивают кислотную среду микрослоев почвы за счет выделения углекислоты и H⁺ ионов. Эти изменения возможны только в пределах нескольких миллиметров вокруг корня. Главным источником стимуляции почвенной микробиоты являются выделения корнями питательных веществ [11].

Патогенные и симбиотические микроорганизмы привязаны к ним и даже способны растворять стенку клеток корня и проникать внутрь цитоплазмы.

Экзосмос органических веществ из корней растений обусловлен активными процессами, пассивной диффузией или выделениями из отмирающих клеток.

Корневые отростки обычно покрыты слизистыми чехликами обильно заселенными микробами.

В микроскопических выделениях корней обнаружено большое количество различных веществ, в том числе: 10 разных сахаров, 23 аминокислоты, 10 витаминов, полисахаридные слизи, органические кислоты и многие другие вещества. Химический состав выделений зависит от вида и возраста растений.

По увеличению числа микробов, по мере приближения к поверхности корня, сфера воздействия корней на микрофлору определяется лишь приблизительно. В ризосфере (Р) насчитывается больше групп микроорганизмов, чем в окружающей почве (П), что можно выразить отношением Р/П (Таблица №2).

Не все бактерии одинаково реагируют на стимулирующее действие корней. Замечено, что грамотрицательные бактерии явно лучше развиваются в ризосфере, чем грамположительные. Способность бактерий заселять зону корня связана не только с выделяемым веществом, но и с отношением к физическим факторам, антагонизму.

Таблица №2 Сравнение числа бактерий и актиномицетов в ризосфере пшеницы и в контрольной почве

Организмы	Ризосферная почва	Контрольная почва	Р/П
Бактерии Актиномицеты	1200*106 46*106	53*106 7*106	23 7
Группы бактерий: Аммонификатоы Газообразующие анаэробы Анаэробы Денитрификаторы Анаэробные целлюлозоразлагающие Аэробные целлюлозоразлагающие Спорообразующие	500*106 39*104 12*106 126*106 9*103 7*105 930*103	4*106 3*104 6*106 1*105 3*103 1*105 575*103	125 13 2 1260 1 7 1

Замечено, что типичные обитатели ризосферы способны разлагать целлюлозу, растворять фосфаты, использовать белки и сахара, и бактериальные полисахариды. Так же отмечается некоторая корреляция между таксономическими и физиологическими группами бактерий в ризосфере. Так, например, виды Pseudomonas доминируют в ризосфере, а виды Arthrobacter - в окружающей почве. Представители обоих родов заметно различаются по потребностям в ростовых факторах.

Существует мнение, что актиномицетам уделяется меньше внимания, хотя их причастность к ризосфере установлена. Есть вероятность, что в определенных условиях актиномицеты образуют активные вещества (антибиотики), которые препятствуют развитию патогенов на корнях. Актиномицеты обитающие в почве и ризосфере не отличаются по физиологии и видовому составу.

Многие факторы влияют на микрофлору ризосферы , а особенно: вид и возраст растений, их состояние, положение и характер распределения корней, тип почвы и окружение. Стимуляция или угнетение развития микробов корнями растений проявляются в разной степени. Например, бобовые растения лучше всего стимулируют развитие микроорганизмов в прикорневой зоне.

В случае длительного выращивания одних и тех же растений на одних и тех же площадях приводит к так называемому «почвенному утомлению». На поверхности одного корешка микрофлора оказывается разнообразной, а обилие микроорганизмов нарастает к кончикам корней, где отмечен наибольший экзосмос аминокислот.

После прорастания семени, а особенно в период цветения и плодоношения растений, ризосферный эффект увеличивается. В виду этого, возраст и старение растений играет большую роль в формировании и деятельности ризосферной микрофлоры.

Так же на микроорганизмы и их жизнедеятельность влияют тип почвы, на которой произрастает растение, степень освещенности, корневые выделения, температура воздуха.

Ризосферный эффект более ярко выражен в песчаных почвах и менее - в гумусных. Огромное воздействие на микроорганизмы оказывают обитатели почвы; во много раз больше чем изменение окружающей среды и агротехнические мероприятия. Ризосферная зона представляет собой своеобразную «буферную» систему, препятствующую воздействию среды на микрофлору.

Некоторые микроорганизмы способны существовать даже при крайних (экстремальных) значениях факторов внешней среды и часто становятся узкоспециализированными - обязательными по отношению к уровню действующего фактора. Таковыми являются облигатные галофилы (род Halobacterium), растущие в насыщенных растворах солей, многие облигатные термофилы, глубоководные барофильные бактерии (устойчивые к высокому давлению), выдерживающие давление 1400 атм, облигатные анаэробы, погибающие при незначительных примесях кислорода в атмосфере (род Selenomonas и др.). Некоторые виды бактерий и грибов способны размножаться даже при 0°С, если водный раствор не замерзает.

Опасным температурным пределом для животных, включая простейших, является 50 °С, максимум для грибов 56--60 °С. Сине-зеленые водоросли (род Synechococcus) активны в горячих источниках при 73--75 °С, а некоторые флексибактерии активно размножаются в горячих гейзерах (90 °С). Границы жизнедеятельности микроорганизмов колоссальны. Эта особенность микроорганизмов обеспечивает им практически беспредельное развитие на нашей планете [26].

В научном мире, в последние годы, уделяется большое внимание микрофлоре ризосферы.

Многие исследователи приводят данные о значительном скоплении микроорганизмов в прикорневой зоне. Кацнельсон нашел в ризосфере свеклы в 100--1000 раз больше микробов, чем вне корневой зоны. Том и Хэмфильд приводят такие цифры: в ризосфере маиса имеется 136 млн. бактерий, а вне ризосферы (контроль) -- 5 млн. на один грамм почвы.

По данным Старки, в ризосфере фасоли насчитывается 200 млн/г бактерий, свеклы -- 427 млн/г и зерновых культур -- 653 млн/г. Контрольные образцы почв имели от 1 до 5 млн. бактерий в одном грамме.

Химический состав почвы, так сказать, ее плодородность оказывают огромное влияние на количественный состав микрофлоры ризосферы. Современные приемы агротехники с внесением соответствующих удобрений увеличивают видовой состав микроорганизмов в ризосфере [13].

По мере углубления в почву микробы обычно насчитываются единицами, тогда как в ризосфере растений даже на глубине 2 - 3м они развиваются в изобилии.

В условиях глубинного роста корневая система растений создает вполне благоприятные условия для развития микроорганизмов не только выделением питательных веществ, но, по-видимому, и такими факторами, как улучшение условий дыхания и обмена веществ.

С возрастом растений количество микробов в прикорневой зоне меняетмя. Максимальное число их обнаруживается в период наиболее бурного роста растения.

Чем интенсивней протекают жизненные процессы, тем больше выделяется корнями органических веществ и тем интенсивнее идет размножение микробов в ризосфере.

Обильное развитие микроорганизмов происходит и на ранних стадиях развития растений, однако самый бурный рост микробов наступает в период цветения или непосредственно перед ним.

Иногда отмечаются два и даже три подъема кривой роста микробов: первый, небольшой подъем -- в ранней стадии, второй, больший -- перед цветением и во время цветения, а третий -- перед созреванием. Последний обычно бывает чуть заметным.



3. Характеристика микробного сообщества ризосферы Astragalusaustriacusl.

Исследователи почвенной микробиологии считают, что основную часть микроорганизмов, обитающих в ризосфере, составляютPseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligens, Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Burkholderia, Flavobacterium, Campilobacter. Функцией ризосферного микробного сообщества является активный синтез различных ферментов, оказывающих влияние на развитие растений. Кроме того, здесь обитает достаточное количество антагонистов, не позволяющих размножаться патогенной микрофлоре. Наше внимание было направлено, в первую очередь, на те таксоны микроорганизмов, которые относятся к наиболее активным и часто встречаем бактериям, ассоциированных с корнями растений.

Нами было отмечено, что численность и разнообразие бактерий изменяются в течение всего вегетационного периода. Максимальные показатели общего микробного числа приходятся на июнь - период, когда растения астрагала зацветают.

Как считает Н.В. Алесина (2010), связано это «с увеличением синтеза корневых выделений растений».

Изменение качественного состава микрофлоры связано с деятельностью самого растения (корневые экссудаты) и активностью микроорганизмов, питающихся продуктами экзосмосаили разлагающих органические остатки подземной сферы растения (корневой отпад, старые, отмершие боковые и придаточные корни).

Численность почвенных грибов, актиномицетов и целлюлозоразлагающих организмов, достаточно высокаявесной, снижается к моменту цветения астрагала.

Весной и начале лета, в ризосфере A. austriacus отмечаются грамотрицательные бактерии родов Azotobacter, Bacterium, Pseudomonas,Azotomonas(Рисунок 4) и грамположительные бактерии рода Clostridium(Рисунок 5).

Рисунок №4. Грамотрицательные бактерии рода Azotomonas

Рисунок №5. Грамположительные бактерии рода Clostridium

Преобладающими микроорганизмами в ризосфере являются бактерии рода Pseudomonas. Это является нормой для формирования микробного сообщества данной зоны почвы.

По мере развития растения, во второй половине лета и осенью, с наступлением фазы плодоношения, в его ризосфере увеличивается объем отмершей органики, представленной отслоившимися покровными тканями корня, мелкими мертвыми корешками, погибшими бактериями ризопланы и ризосферы. Снижается метаболическая активность корня, количество выделяемых метаболитов низкая, что, вероятно, связано с уменьшением объема углеводов, поступающих в корень. Это ведет к тому, что численность диазотрофов начинает резко падать и на их смену приходят целлюлозоразрушающие микроорганизмы, почвенные грибы и актиномицеты.

Увеличивается процент содержания бактерий родов Agrococcus (Рисунок 6), Agrobacterium(способный разлагать целлюлозу и лигнин), Bacillus(возрастание численности этих бактерий коррелирует с появлением растительного опада), Streptococcus.

Рисунок №6 Грамположительные бактерии рода Agrococcus

4. Характеристика микробного сообщества ризопланы Astragalusaustriacusl.

Общая численность бактерий в ризоплане значительно превышает таковую ризосферы. Это связано, видимо, с более тесными отношениями микроорганизмов и растений, корни которых выделяют в окружающую среду продукты экзосмоса, а бактерии, в свою очередь, обеспечивают растения витаминами, аминокислотами, ферментами, гетероауксинами. Это подтверждается и увеличением количества бактерий в ризоплане в фазу бутонизации и цветения астрагала австрийского.

Микробное население ризопланы несколько отличается от микрофлоры ризосферы. Микросообщество ризопланы представлено, главным образом, грамотрицательными бактериями. Так же как и в ризосфере здесь преобладают представители рода Pseudomonas. Кроме того, были отмечены представители родов Klebsiella, Azotobacter, в незначительном количестве Rizobium. Появившись в ризоплане корня бактерии рода Rizobium, вступают в симбиотические отношения с растением. Но и в свободном виде ризобиум встречается в почве, но активность его невелика. Скопления этих бактерий отмечается у корневых волосков, где и происходит инфицирование корня. В результате на корнях формируются клубеньки. При их разрушении Rizobium вновь попадают в почву.

Нами отмечено, что в ризоплане процентное содержание целлюлозоразлагающих бактерий, почвенных грибов и актиномицетов ниже, чем в ризосфере, но больше микроорганизмов, вступающих в симбиотические отношения с корнями растения (Bacterium, Rizobium). Свободноживущие азотофиксирующие бактерии рода Azotobacter активно размножаются как в ризоплане, так и в ризосфере. Этому способствует и состав карбонатных почв (рН=7 или немногим выше), что является оптимальным фактором для существования данных бактерий [20].

Так же как и в ризосфере, в ризоплане изменяется видовой состав микроорганизмов в зависимости от сезона и фазы развития растений. В стадию бутонизации, цветения и начала плодоношения преобладают неферментирующие бактерии представители семейства энтеробактерий, рода Pseudomonas(Рисунок 7), Azotobacter и Bacterium. А так же, симбиотические микроорганизмы рода Rizobium.

Рисунок №7. Pseudomonas - грамотрицательные палочки

Осенью, к концу вегетации и в ризоплане увеличивается количество целлюлозоразлагающих микроорганизмов, почвенных грибов и актиномицетов (Рисунок 8).



Рисунок №8. Актиномицеты

К этому времени эксудаты корня практически не попадают в почвы, однако возрастает объем отмершей органики, что является благоприятной средой для группы гидролитических микроорганизмов. Эккрисотрофы, жизнедеятельность которых коррелирует с продуктами экзоосмоса растений, к этому времени снижают свою активность и их количество снижается по сравнению с предыдущими фазами развития растений.



5. Влияние различной влажности почвы на состав микробных ценозов ризосферы и ризопланы Astragalusaustriacusl.

Численность микроорганизмов в почве зависит от различных факторов среды (температура, влажность, состояние растительного покрова) не только в течение года, но и в небольшие промежутки времени. Нами было установлено, что в конце весны-начале лета, когда почвы на склонах балки влажные (55-60%), численность микроорганизмов достаточно высокая. В летний период почвы пересыхают, а незначительные осадки в виде дождя не обеспечивают достаточного их промокания. Это связано с тем, что вода, скатываясь по склонам балки, не успевает впитаться в почву и промокаемый слой грунта составляет 0,5-1,0 см. При этом боковые корни, расположенные в верхних слоях почвы, находятся в условиях длительного дефицита влаги. А, следовательно, это снижает активную деятельность микрофлоры и численность бактерий резко снижается.

В это же время активизируются актиномицеты и почвенные грибы. Их мицелий, разрастаясь, оплетает частицы почвы, примыкающие к корням. Формируются водостойкие агрегаты, которые впоследствии могут скрепляться гумусом.

Нами было установлено, что при влажности почвы 60% устанавливаются наиболее благоприятные условия для развития корневой микрофлоры. Возрастает численность бактерий родов Pseudomonas, Azotobacter, Bacterium, Azotomonas. Но уменьшается количество почвенных грибов, актиномицетов, целлюлозоразлагающих бактерий, по сравнению с летними месяцами при более низкой влажности почвы. Многочисленные бактерии родаPseudomonas при снижении влажности почвы заменяются микроорганизмами других родов, например,Baccilus.

Осенью, когда влажность почвы вновь достигает высокого значения, но температуры понижаются, увеличивается процент содержания бактерий родов Agrococcus, Agrobacterium, Bacillus, Streptococcus.

Таким образом, уровень влажности 60% - наиболее оптимален для развития микроорганизмов ризосферы и ризопланы. Недостаток влаги (40% и ниже) влечет за собой уменьшение общей микробной численности. Осеннее повышение влаги в почве способствует увеличению о.м.ч., но микробное население ризосферы и ризопланы весенних и осенних микробоценозов отличается по видовому составу.



Выводы

Подводя итог проведенным исследованиям можно сказать, что численности микробного населения ризосферы и ризопланы в процессе вегетации связано с изменением качества и количества корневых выделений астрагала австрийского, которые являются источниками питания для микроорганизмов-эккрисотрофов. А увеличение отмершей органики способствует активизации группы гидролитиков, участвующих в процессах ее разложения.

На характер микробного биоценоза влияет состав и влажность почвы.Исследования проводились на черноземах и деградированных черноземах с мощным гумусовым и неразвитым подзолистым горизонтом. Они бедны микроэлементами и содержат незначительное количество подвижных форм фосфора и калия. Кроме того, основная масса корней астрагала австрийского расположена на в верхнем горизонте (до 10 см) почвы.Известняковыми отложениями затрудняют продвижение корней вглубь и максимальная глубина, на которую способен проникнуть главный корень астрагала, составляет 20-25см.

Недостаточное водоснабжение в летний период на склонах балки, где, в основном, и расположена популяция астрагала австрийского, неблагоприятно сказывается на микробном составе ризосферы, что определяет незначительное число видов бактерий в прикорневой зоне.

Для улучшения состава почвы и увеличения микробной активности на деградированных черноземах следует обратить внимание на штаммы бактерий ризосферы и ризопланы астрагала австрийского и других растений, способных к активным взаимоотношениям с корнями различных видов растений.

На основе выше сказанного, можно сделать следующие выводы:

1. Численность и многообразие микроорганизмов ризосферы и ризопланы зависит от комплекса факторов и меняется в течение сезона. К таким факторам относятся: состав и влажность почвы, видовое разнообразие растений и фазы их развития.

2. Общая численность микроорганизмов в ризосфере Astragalus austriacus L. изменяется в различные фазы развития растений и наибольшее их число отмечается в фазу бутонизации и цветения. В ризосфере растений в фазу плодоношения и у сенильных растений возрастает доля актиномицетов, почвенных грибов и целлюлозоразрушающих микроорганизмов.

3. Общая численность эккрисотрофов ризоплана Astragalus austriacus L. достаточно высокая в фазы бутонизации, цветения и плодоношения растения, но по мере его старения и переходе в фазу вегетации после плодоношения - количество эккрисотрофов уменьшается, но увеличивается численность гидролитиков, разлагающих корневой отпад, отмершие ткани корня и микробную биомассу.

...