Техника микроинъекций в аксоны нервных клеток, которые окружены плотной глиальной оболочкой, с использованием ультразвуковых колебаний микрокапилляра
Методика внутриклеточных микроинъекций как одна из технологий, которая позволяет осуществить прямое введение клеточных органелл и растворов веществ в живые клетки. Схема подвода инъекционного капилляра к коннективе брюшной нервной цепи речного рака.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | статья |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 30.05.2017 |
| Размер файла | 1,5 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru
Размещено на http://www.allbest.ru
Методика внутриклеточных микроинъекций (ВМ) - способ прямого введения клеточных органелл и растворов веществ в живые клетки. В последнее время он широко применяется в биологии для генетической трансформации клеток, и в медицине при искусственном оплодотворении путем введения сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ICSI). Традиционно метод ВМ используется для инъекций в клетки, извлеченные из биологических тканей - культивируемые на подложках, или удерживаемые специальными холдерами. Особую значимость метод внутриклеточных микроинъекций, в силу своей избирательности, представляет для нейротрэкинга - визуализации путей, которые образуют в нервной системе проводящие отростки нервных клеток (методика помогает понять структурную и функциональную связность различных отделов нервной системы). Однако использование микроинъекций для введения маркера в отдельные нервные клетки в составе нервной ткани имеет ограниченное применение - маркер удается вводить лишь в те нейроны, которые не окружены многослойной окутывающей оболочкой из глиальных клеток. Прокол последней с использованием традиционной техники осложнен тем, что повышение усилия, необходимого для прокола плотной глиальной оболочки, приводит к повышению вероятности поломки кончика стеклянного микрокапилляра, используемого для прокола клеток (диаметр кончика капилляра обычно составляет единицы микрон). Высокая эластичность нервной ткани приводит к ее значительной деформации до момента прокола, что создает дополнительную проблему, связанную с высоким риском сквозного прокола нервных клеток при достижении усилия достаточного для прокола окружающих оболочек.
В настоящей работе описывается техника микроинъекций в аксоны нервных клеток, окруженные многослойной глиальной оболочкой. Для отработки методики использовался модельный объект - брюшная нервная цепь (БНЦ) речного рака, которая состоит из скоплений тел нервных клеток (ганглиев), соединенных коннективами (Рис. 1). Последние состоят из проводящих отростков нервных клеток - аксонов, окруженных глиальными клетками. Вдоль каждой коннективы проходят две пары гигантских аксонов (средний диаметр 50 мкм), которые залегают на относительно небольшой глубине - порядка их диаметра, но окружены многослойной глиальной оболочкой. Брюшную нервную цепь речного рака располагали в кювете с физиологическим раствором ван Харревельда, и по краям препарата фиксировали прижимами к дну кюветы (Рис. 1).
внутриклеточный микроинъекция капилляр коннектив
Рис. 1. - Брюшная нервная цепь речного рака в экспериментальной кювете с прижимами препарата ко дну
Рис. 2. - Общий вид экспериментальной установки
За основу устройства для микроинъекций была взята конструкция Чемберса-Копака с ручной механической подачей микрокапилляра, используемая для микроинъекций изолированных клеток. Китайскими авторами было показано снижение деформации ооцитов при их проколе с помощью микрокапилляра на который передавлись ультразвуковые колебания. Поэтому конструкция Чемберса-Копака была совмещена с пьезоэлектрическим преобразователем стержневого типа, который имел канал для подачи давления от гидравлической системы и передавал микроколебания ультразвуковой частоты (25 кГц) на инъекционный капилляр (Рис. 2). Капилляры изготавливались из борсиликатного стекла с помощью прибора для вытяжки микропипеток МЭ-3 (ИБП РАН, Пущино). Диаметр кончика составлял 5-10 микрон. В некоторых случаях кончик микрокапилляра скашивали путем заточки на алмазной шлифовальной пленке. Для снижения вероятности повреждения капилляра о дно ванночки он подавался не перпендикулярно плоскости препарата, а под углом примерно 45 градусов к его продольной оси. При проколе растяжение препарата в горизонтальной плоскости ограничивалось прижимами к дну ванночки, поэтому горизонтальная составляющая движения капилляра создавала благоприятные условия для достижения достаточного натяжения ткани для прокола глиальной оболочки. Кроме того, подача микрокапилляра под углом к плоскости препарата снижала риск сквозного прокола аксонов (Рис. 3). Прокол аксонов осуществляли под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100х, когда отчетливо видны границы гигантских аксонов.
Рис. 3. - Схема подвода инъекционного капилляра к коннективе БНЦ (вид сбоку)
Рис. 4. - Коннектива БНЦ после инъекции в медиальный гигантский аксон флуоресцентного маркера Qdot 655 (красный цвет). Синий цвет - ядра глиальных клеток, окрашенные Hoechst 33342. Флуоресцентная микроскопия. Фото с дорсальной стороны препарата
Ультразвуковые микроколебания инъекционного капилляра облегчали прокол клеточных мембран, в частности, многослойных глиальных оболочек нервных клеток. Эти же колебания способствовали эффективному введению веществ без приложения дополнительного трудноконтролируемого давления к раствору внутри капилляра. Гидравлическая система, которая представляла собой шприц с пластиковой трубочкой, заполненные вазелиновым маслом, использовалась только для поддержания раствора внутри капилляра под минимальным положительным давлением с целью предотвращения засорения капилляра. На Рис. 4 представлен результат использования предложенной техники микроинъекций для визуализации морфологии аксонов при введении раствора флуоресцентного маркера Qdot 655 (Invitrogen, США) в один из гигантских аксонов БНЦ.
Предложенная техника микроинъекций индивидуальных клеток в составе тканей с использованием ультразвуковых колебаний капилляра может быть полезной не только в исследованиях на изолированных тканях, но и в экспериментах in vivo - там, где необходимо инъецировать подповерхностно расположенные клетки, окруженные плотными оболочками. Помимо визуализации клеточной морфологии предложенная техника может быть использована и для генетической трансформации клеток в составе тканей.
Конкретные физические механизмы, облегчающие прокол и введение растворов веществ в рамках предложенной нами техники, могут иметь общую природу с нелинейными эффектами действия акустических волн на биоткани.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Основные положения нейронной теории. Структурные элементы нервной клетки. Обмен веществ в нейроне, кровоснабжение нервных клеток. Особенности питания нервных клеток и обмена веществ. Основные функции нервной клетки: воспринимающая функция нейрона.
контрольная работа [28,9 K], добавлен 16.02.2010Основные механизмы деятельности клетки. Клетка как единица физиологических процессов обмена. Основные представления о регуляции. Функции клеточных органелл, мембранные системы внутриклеточных органелл. Обмен веществами между клеткой и окружающей средой.
презентация [268,6 K], добавлен 04.02.2016Функциональные возможности организма обеспечивают взаимодействие 2-х систем: нервной и гуморальной. Возможности взаимоотношений 2-х систем могут осуществляться благодаря наличию в мозгу нейросекреторных клеток. Функции нервных и секреторных клеток.
реферат [269,8 K], добавлен 31.10.2008Основные органеллы клетки. Цитоплазма - полужидкая среда, в которой находятся ядро клетки и все органоиды, ее состав. Схема строения комплекса Гольджи. Органоиды движения включения (реснички и жгутики). Форма и размеры ядра, его главные функции.
презентация [764,3 K], добавлен 13.11.2014Уникальные свойства нервных клеток, их развитие под влиянием генетических факторов и условий среды. Образование периферической нервной системы и ее формирование в раннем периоде. Образование предшественников нервных клеток и глии, миграция нейронов.
реферат [1,1 M], добавлен 31.10.2009Механизм и принцип работы ионных каналов, их разновидности в зависимости от проницаемости и характерные признаки. Пути передачи импульсов в нервной системе. Состав и элементы клеточных мембран нервных клеток и оценка их участия в передаче информации.
реферат [28,6 K], добавлен 24.10.2009Состав нервной ткани. Возбуждение нервных клеток, передача электрических импульсов. Особенности строения нейронов, сенсорного и моторного нервов. Пучки нервных волокон. Химический состав нервной ткани. Белки нервной ткани, их виды. Ферменты нервной ткани.
презентация [4,1 M], добавлен 09.12.2013Механизм передачи нервных импульсов от одной клетки организма другой, значение синапса в данном процессе. Природа синапсов и их разновидности. Метод Гольджи и его роль в изучении строения нервных клеток. Выделение медиатора при химическом синапсе.
реферат [65,0 K], добавлен 08.08.2009Процесс отражения (рефлекс), основанный на отражении объективных явлений внешней или внутренней среды организма, как основа функции нервной системы. Строение, классификация и функции нервных клеток. Ядро и цитоплазма нервной клетки, виды нейроглии.
курсовая работа [6,1 M], добавлен 22.09.2009Генная инженерия и трансгеноз. Методология получения трансгенных мышей. Использование ретровирусных векторов. Использование метода микроинъекций ДНК. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Использование трансгенных мышей.
реферат [32,2 K], добавлен 18.09.2015Функции нервной системы в организме человека. Клеточное строение нервной системы. Виды нервных клеток (функциональная классификация). Рефлекторный принцип работы нервной системы. Отделы центральной нервной системы. Учение о высшей нервной деятельности.
реферат [1,6 M], добавлен 15.02.2011Взаимосвязи в простых нервных системах, сложные нейронные сети и высшие функции мозга. Строение сетчатки и связи нейронов, тело клетки, дендриты, аксоны. Методы идентификации нейронов и прослеживание их связей. Клеточная и молекулярная биология нейронов.
реферат [363,0 K], добавлен 24.10.2009Изучение клеточной теории строения организмов, основного способа деления клеток, обмена веществ и преобразования энергии. Анализ признаков живых организмов, автотрофного и гетеротрофного питания. Исследование неорганических и органических веществ клетки.
реферат [39,6 K], добавлен 14.05.2011Химический состав клеток, функции внутриклеточных структур, функции клеток в организме животных и растений, размножение и развитие клеток, приспособления клеток к условиям окружающей среды. Положения клеточной теории по М. Шлейдену и Т. Шванну.
презентация [1,3 M], добавлен 17.12.2013Тканеспецифичные стволовые клетки, стволовые клетки крови млекопитающих. Базальные кератиноциты - стволовые клетки эпидермиса. Способность клеток к специализации (дифференцировке). Регенерация сердечной ткани. Перспективы применения стволовых клеток.
реферат [25,2 K], добавлен 07.04.2014Разделение веществ с помощью центрифугирования. Определение скорости седиментации и радиуса ротора. Дифференциальное центрифугирование как самый распространенный метод выделения клеточных органелл из гомогенатов тканей. Анализ субклеточных фракций.
курсовая работа [3,1 M], добавлен 26.07.2009Синтез белка Xvent-2 в клетках зародышей с целью дальнейшей дифференцировки стволовых клеток. Выделение клеточных органелл. Реагенты и растворы для изоэлектрического фокусирования. Получение биологического материала. Результаты работы и их обсуждение.
курсовая работа [4,5 M], добавлен 27.06.2015Виды повреждения клетки. Стадии хронического повреждения клетки. Виды гибели клетки. Некроз и апоптоз. Патогенез повреждения клеточных мембран. Высокоспециализированные клетки с высоким уровнем внутриклеточной регенерации. Состояния соединительной ткани.
презентация [12,3 M], добавлен 03.11.2013Достижения в области изучения стволовых клеток. Виды стволовых клеток, особенности их функционирования. Эмбриональные и гемопоэтические стволовые клетки. Стволовые клетки взрослого организма. Биоэтика использования эмбриональных стволовых клеток.
презентация [908,9 K], добавлен 22.12.2012Строение и функции оболочки клетки. Химический состав клетки. Содержание химических элементов. Биология опухолевой клетки. Клонирование клеток животных. А была ли Долли? Клонирование - ключ к вечной молодости? Культивирование клеток растений.
реферат [27,3 K], добавлен 16.01.2005
