Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПЕРВОЕ ВЫСШЕЕ ТЕХНИЧЕСКОЕ УЧЕБНОЕ ЗАВЕДЕНИЕ РОССИИ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра металлургии

Курсовая работа по дисциплине:

Методы контроля и анализа веществ

ТЕМА: Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

Выполнил: студент гр. МЦ - 14 /Бурый Ф.И.

Проверил: доцент кафедры металлургии /Цыбизов А.В.

Санкт-Петербург

2017



Введение

С момента открытия и описания красных кровяных телец (эритроцитов) Яном Сваммердамом в 1658 г. и независимо Антони Ван Левенгуком в 1674 г. люди долгое время не имели возможности узнать, насколько важную функцию выполняют эти мельчайшие клетки крови. В эритроцитах находится белок (гемоглобин), способный переносить кислород по крови к остальным тканям и забирать углекислый газ из них и переносить его к легким. Данная особенность гемоглобина была впервые обнаружена Г. Хюнефельдом в 1840 г., пару лет спустя немецкий биохимик Феликс Гоппе-Зейлер подтвердил данную, реверсивную возможность белка переносить и кислород, и углекислый газ, а также дал современное название гемоглобину. О роли гемоглобина в переносе кислорода по тканям организма также заявлял французский физиолог Клод Бертран в 70-е годы XIX века. Однако всеобъемлющих исследований этого белка не проводилось вплоть до середины XX в. Строение гемоглобина, как и строение многих белков, оставалось слишком сложным для того, чтобы определить его до эры такого аналитического метода химии и биохимии, как рентгеноструктурный анализ.

Большой вклад в исследование структуры и функционирование гемоглобина внёс Макс Перуц, один из отцов-основателей молекулярной биологии, получивший за это в 1962 году Нобелевскую премию. Благодаря его трудам, теперь мы знаем, что гемоглобин взрослого человека (HbA) является тетрамером, состоящим из двух б- и двух в-субьединиц (отдельных белковых цепей, объединяющихся в составной функциональный белок). б- И в-цепи гемоглобина немного отличаются аминокислотной последовательностью, но имеют сходную форму, из-за чего сам тетрамер гемоглобина представляет собой почти правильный тетраэдр.

Гемоглобин - основной дыхательный пигмент и главный компонент эритроцита Он также играет существенную роль в поддержании кислотно-основного равновесия крови. Буферная система, создаваемая гемоглобином, способствует сохранению рН крови в определенных пределах. Подсчитано, что в одном эритроците содержится около ~ 340000000 молекул гемоглобина, каждая из которых состоит примерно из 103 атомов. В крови человека в среднем содержится ~ 14,5% гемоглобина, его общее количество ~ 750 г.

С развитием медицинской биохимии было предложено множество методов определения концентрации гемоглобина. Важнейшие группы этих методов следующие:

1. Колориметрические методы. Чаще колориметрируют цветные производные гемоглобина: солянокислый гематин, карбоксигемоглобин, цианометгемоглобин, гемиохром. Колориметрические методы широко применяются на практике ввиду их простоты и доступности. Наиболее точными и надежными из них являются цианометгемоглобиновый и гемиохромный методы.

2. Газометрические методы. Гемоглобин насыщают газом, напримеркислородом или окисью углерода. По количеству поглощенного газа судят о количестве гемоглобина.

3. Методы, основанные на определении железа в гемоглобиновой молекуле. Так как гемоглобин содержит строго определенное количество железа (0,374%), то по его содержанию устанавливают и количество гемоглобина.

Две последние группы точны, но требуют много времени, технически более сложны и поэтому не нашли широкого применения в практике.

Задачей данной работы является сравнение двух наиболее часто применяющихся в медицинской практике методов количественного анализа гемоглобина: гемоглобинцианидного и гемиохромного. Нахождение концентрации гемоглобина в крови автора курсовой работы. Поиск коэффициента корреляции по построенным калибровочным графикам между двумя методами.



Методы анализа

Общая характеристика методов

Определение содержания гемоглобина в крови человека является одним из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Из «старых» методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали.

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20-30%.

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Метод основан на визуальной оценке содержания гемоглобина путем сравнения окраски исследуемой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. Ошибка метода достигает ~ 30%, на результаты определения влияют многие факторы: время реакции между гемоглобином и соляной кислотой, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от содержания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий от содержания билирубина в крови; характера освещения и пр.

Химические и спектрофотометрические методы имеют высокую точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за трудоемкости и значительной стоимости анализа для рутинных определений не применяются.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь человека - это нормальная смесь производных гемоглобина с различными спектрами поглощения. При количественном определении гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные гемоглобина только в одну форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно превращающими гемоглобин в его производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа. Однако, некоторые особенности не позволяют использовать гемиглобиназидный метод в качестве альтернативного в силу следующих причин:

1) Конечный продукт превращения гемоглобина - HbN3 имеет слабый пик поглощения при л = 540 нм, что не дает возможности использовать фотометры с широкополосными фильтрами;

2) Возникают проблемы, связанные с мутностью растворов;

3) Раствор HbN3 не хранится при комнатной температуре.

Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы лишены этих недостатков и при дальнейших исследованиях им было отдано предпочтение.

Интерференция при всех колориметрических методах анализа:

1) Повышение гемоглобина: гипертриглицеридемия, количество лейкоцитов более 25х109/л, прогрессирующие заболевания печени, наличие легко преципитирующихся глобулинов (при миеломной болезни или при макроглобулинемии Вальденстрема).

2) Понижение гемоглобина: у заядлых курильщиков вследствие образования неактивного HbСО. Пупкова В.И; Определение гемоглобина в крови; Кольцово - 2001

Гемоглобинцианидный метод

Принцип гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемиглобинцианид (то же что и цианометгемоглобин). Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

1) HbCN является стабильной производной гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;

2) Спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при л= 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при л= 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Реагенты, необходимые для количественного определения гемоглобина:

Трансформирующий реагент:

Назначение трансформирующих реагентов переводить все формы гемоглобина в гемиглобинцианид. Оптимальный состав и чистота исходных компонентов для трансформирующего раствора, предложенные Van Kampen и Zijlstra, позволяют количественно трансформировать все формы гемоглобина в гемиглобинцианид, получать результаты через 3-5 мин, которые практически не зависят от присутствия белков плазмы крови.

Состав трансформирующего раствора: К3Fe(CN)6, 200 мг; КСN, 50 мг; KH2PO4; 140 мг; неионные детергенты типа Nonic 218, Nonidet P-40, Triton X-100 по 1 мл/л. Все компоненты растворяют и разбавляют до 1 л дистиллированной водой; рН приготовленного раствора должен быть в пределах 7,0-7,4.

Модификации трансформирующего реагента:

Для гемиглобинцианидного метода оптимальный состав трансформирующего реагента указан выше. В некоторых коммерческих наборах реагентов, предназначенных для определения гемоглобина, состав и концентрация исходных компонентов трансформирующего реагента отличаются от оригинала. Так, КСN часто заменяют ацетонциангидрином, KH2PO4 - NаНСО3; во многих наборах детергенты исключены совсем.

Однако, замена рекомендуемых компонентов в определенной концентрации приводит к увеличению времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности (20 мин против 5) и меньшему сроку сохранности трансформирующего раствора.

Для устранения влияния некоторых компонентов, присутствующих в крови, в состав трансформирующих реагентов вводят соответствующие добавки. Введение липазы устраняет влияние липидов; увеличение концентрации KH2PO4 ? солей аммония; введение метанола, этанола, этиленгликоля устраняет распад компонентов реагента при его замерзании. Эти добавки не влияют на правильность результатов анализа.

Калибровочный раствор гемиглобинцианида:

При определении гемоглобина трансформирующий реагент только переводит все его формы в стойкое соединение гемиглобинцианид (метгемоглобин), но не определяет точность процедуры измерения гемоглобина. Для гарантии точности метода применяют калибровочные растворы с точно установленной концентрацией гемоглобина. Международный (стандартный) калибровочный раствор гемиглобинцианида готовится от имени ICSH и служит для аттестации коммерческих калибровочных растворов. Допустимая ошибка определения гемоглобина при использовании Международного калибровочного раствора - менее ± 2%.

Калибровочные растворы гемиглобинцианида получают, как правило, путем введения высокоочищенного раствора гемоглобина в трансформирующий раствор. Международный комитет по стандартизации в гематологии начал работу по стандартизации калибровочного раствора гемиглобинцианида в 60-х гг. Первый образец гемиглобинцианида был предложен ВОЗ в 1967 г., но в последующие годы (1980, 1981, 1983) еще проводились уточнения его характеристик, и только в 1985 г. был установлен международный стандарт гемиглобинцианида, отвечающий всем требованиям, сформулированным Международным Комитетом по стандартизации в гематологии.

Контрольные растворы гемоглобина:

Использование калибровочных растворов позволяет точно определить концентрацию гемоглобина в крови, если при анализе не было допущено различных погрешностей. Погрешности можно выявить с помощью контрольных растворов гемоглобина. Контрольные растворы гемоглобина - это высокоочищенные имитаторы крови человека, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. Концентрация гемоглобина в контрольных растворах определена с точностью ~ 2%. Аттестация этих растворов проводится на фотометрах высокого класса точности при использовании дозаторов с погрешностью дозирования менее 1%.

Наличие панели наборов реагентов для определения гемоглобина в крови: трансформирующего реагента, калибровочных растворов гемиглобинцианида и контрольных растворов гемоглобина обеспечивает возможность получения результатов с погрешностью, не превышающей ± 2%. гемоглобинцианидный медицинский калибровочный корреляция

Требования безопасности при работе с раствором, содержащим цианистые соединения:

При всех положительных параметрах гемиглобинцианидного метода большим его недостатком является то, что он основан на применении ядовитых цианистых соединений. Вместо цианистого калия многие применяют маскированный цианид ? ацетонциангидрин. Характер действия ацетонциангидрина на человека сходен с действием синильной кислоты, но эффект развивается медленнее.

Ацетонциангидрин всасывается через кожу и может вызывать тяжелые отравления. Его предельно-допустимая концентрация (ПДК) составляет 0,9 мг/м3, класс опасности 2.

Для работы с цианистыми соединениями необходимо соблюдение специальных мер предосторожности: применение фильтрующих противогазов, спецодежды; оснащение рабочего места местной и общей вытяжной вентиляцией; необходимостью проведения контроля за концентрацией ацетонциангидрина в воздухе, тщательную герметизацию аппаратуры и ее продувание перед началом работы.

Реакцию ацетонциангидрина с гемом метгемоглобина можно представить в следующем виде (где пунктирными линиями обозначены координационные связи железа):

Гемиохромный метод

С развитием методов анализа для определения гемоглобина в крови разработан новый колориметрический метод, не содержащий в составе реагентов цианистых соединений, которые заменены жирными кислотами с ферроцианидом калия или поверхностно-активными веществами, лучший из которых - додецилсульфат натрия (SDS, он же SLS - лаурилсульфат натрия).

Принцип гемихромного метода:

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну: гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфатом натрия, происходит его превращение в комплексное соединение - гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Образование комплекса происходит согласно реакции:

SLS + HGb = [SLS+HGb]

Характеристика метода:

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А.А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г. Основные достоинства гемихромного метода:

1) Гемихром - стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbChr;

2) Спектр поглощения HbChr имеет плоский максимум вблизи л= 540 нм , поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;

3) Растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при л = 540 нм в широком диапазоне концентраций;

4) Калибровочный раствор HbChr устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет;

5) Трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его составе не содержится цианистых соединений.

Сравнение гемихромного и гемиглобинцианидного методов:

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г/л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Реагенты, необходимые для определения гемоглобина:

Трансформирующие реагенты

Для перевода гемоглобина в HbChr имеется несколько трансформирующих реагентов, отличающихся по составу:

- четвертичные аммониевые соли с ПАВ (тритон Х-100, бридж - 35)

- соли жирных кислот (С14- С20) с феррицианидом калия и ЭДТА в трисовом буфере;

- SDS (или SLS, лаурилсульфат натрия, ПАВ).

Из перечисленных трансформирующих реагентов лучшим является SDS. Максимальная скорость превращения гемоглобина в HbChr отмечена именно при его взаимодействии с SDS, полное превращение которого происходит за 5 мин. Спектр поглощения HbChr в области 540 нм имеет большое сходство со спектром поглощения гемиглобинцианида.

Калибровочный раствор гемихрома:

В 1998 г. Пупковой В.И. с соавторами разработан, запатентован и внедрен в практику Набор реагентов для определения гемоглобина гемихромным методом, содержащий калибровочный раствор гемихрома. Набор зарегистрирован в МЗ РФ и рекомендован к применению. Калибровочный раствор гемихрома обладает достаточной стабильностью (не менее 1 года) и обеспечивает высокую точность измерения гемоглобина при л = 540 нм.

Созданный калибровочный раствор гемихрома соответствует всем требованиям, предъявляемым к калибровочным растворам: это стерильный водный раствор, разлитый в ампулы из светозащитного стекла, прозрачен.

Аттестация калибровочных растворов гемихрома проводится опосредованно относительно Государственного калибровочного раствора гемиглобинцианида с погрешностью, не превышающей ± 2%, поэтому и результаты одной пробы, полученные обоими методами, сопоставимы: их расхождение также не превышает ± 2%. При теоретическом молярном коэффициенте экстинкции гемиглобинцианида, равном 11,00, молярный коэффициент экстинкции гемихрома составляет ~ 10,14. Эту величину предстоит еще уточнить.

Контрольные растворы гемоглобина:

Для гемихромного метода используются те же самые контрольные растворы гемоглобина, что и для гемиглобинцианидного метода.

Описание наборов реактивов и оборудования, примененных в исследовании

Набор реактивов:

Гемоглобин-13-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови унифицированным гемиглобинцианидным методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 400 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием феррицианида калия гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) с железом в форме Fe3+, который в присутствии ацетонциангидрина трансформируется в окрашенный комплекс цианометгемиглобин (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,35, CМ = 10•10-3 моль/л

Ферроцианид калия, CМ = 6,1•10-3 моль/л

Brij 35 (Синтанол, с общей формулой C20H45O5), Сг/л = 5 г/л

Ацетонциангидрин, СМ = 11,2•10-3 моль/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 200 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Окраска стабильна в течение 6-ти часов в защищенном от света месте. Качество набора может проверяться на отечественных или зарубежных контрольных образцах крови, с аттестованным по данному методу показателем.

Нормальные величины содержания гемоглобина в крови:

Мужчины - 132-164 г/л;

Женщины - 115-145 г/л.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Меры предосторожности:

Потенциальный риск применения набора ? класс 2а. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными. В состав монореагента входит ядовитый ацетонциангидрид. При работе с набором следует избегать попадания этого реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

Гемоглобин-15-Ольвекс

Набор «ГЕМОГЛОБИН-15-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемихромным колориметрическим методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 800 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием реагента, содержащего SlS (натрия лаурилсульфат), гемоглобин трансформируется с образованием окрашенного соединения - гемихром. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520-560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,4, CМ = 1 моль/л

Натрия лаурилсульфат (SLS), Cг/л = 129 г/л

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 220 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.

Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Методы предосторожности:

Потенциальный риск применения набора - класс 1. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными при работе с набором следует не допускать попадания реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженной место большим количеством проточной воды; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. При плохом самочувствии следует обратиться к врачу. При работе с набором следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.

Оборудование

Микропипетка типа Сали объемом 20 мкл.

Предназначена для дозирования 20 мкл жидкости. Маркировка на пипетке нанесена коричневой краской, устойчивой к механическим и химическим воздействиям. Пипетка изготовлена из химико-лабораторного стекла по ГОСТ 21400-75.

Объем, 20±0,5 мкл;

Внешний диаметр: 5,0±1,0 мм;

Длина: 150±2,0 мм

Спектрофотометр

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб ПЭ - 5300В

Спектрофотометр ПромЭкоЛаб модель ПЭ-5300 В выпускается на протяжении многих лет и используется для выполнения всех фотометрических методик количественного анализа в соответствии с лабораторными требованиями любых отраслей народного хозяйства РФ.

Спектрофотометр используется для контроля состава воды, почвы, воздуха в экологических и санитарно-гигиенических исследованиях, а также при анализе сырья, готовой продукции, металлов и сплавов, хим. продукции и т.д.

Спектральный диапазон длин волн, нм	325 - 1000
Спектральная ширина щели, нм	4
Погрешность установки длины волны, нм, не более	± 2
Воспроизводимость установки длины волны, нм	1
Фотометрическая точность	±1 % T
Фотометрический диапазон: - оптическая плотность, А - коэффициент пропускания, Т	0.0 - 1.999 0 - 125 %
Фотометрический режим	T, A, C
Рабочая длина кювет, мм	5 - 100
Источник света	галогенная лампа
Цифровой выход	RS-232C
Требования по питанию	220 В / 50 Гц или 110 В / 60 Гц
Размеры (ШЧГЧВ), мм	480Ч360Ч160
Вес, кг	8,0

Скарификаторы Medlance Plus, 2 мм

Автоматические скарификаторы используются для забора крови из безымянного пальца. После дезинфекции пальца, к подушечке прикладывается скарификатор, пружина вводит иглу на 2 мм для обеспечения сильного капиллярного кровотока, первая капля крови снимается ватой, т.к. может содержать межклеточную жидкость, остальная кровь идет на забор образца и, как можно скорее, вводится в трансформирующий раствор.

Дополнительное оборудование: мерные колбы, цилиндр объемом 1 л, пробирки объемом 10 мл, пипетки объемом 1 и 5 мл, кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

Ход работы

Для гемиохромного метода:

Проведем расчеты для построения калибровочного графика эталонного раствора гемоглобина с Cг/л = 120 г/л .

Для этого флакон с концентрированным монореагентом нагреем до комнатной температуры (+18-25оС) перенесем в мерную колбу или цилиндр объемом 1000 мл, объем доведем до метки свежеприготовленной дистиллированной водой. Аккуратно перемешаем, избегая пенообразования. Подготовим пробы в соответствии с таблицей:

Объем реагента, мл	Объем калибратора, мкл
3	20
4
5
6
7
8

Рассчитаем концентрацию 0,02 мл калибратора (гемоглобин с Сг/л = 120 г/л ) в 5,02 мл раствора.

120 г/л • 2•10-5 л = 2,4 • 10-3 г;

(2,4 • 10-3 г) / (5,02• 10-3 л) = 0,48 г/л;

Рассчитаем, каким концентрациям калибратора будет соответствовать раствор, если бы мы растворяли калибраторы отличные от концентраций в 120 г/л в 5 мл растворителя (лаурилсульфата натрия). Растворяем 2,4 • 10-3 г гемоглобина в 6 мл растворителя.

(2,4 • 10-3 г) / (3,02• 10-3 л) = 0,8 г/л;

(2,4 • 10-3 г) / (4,02• 10-3 л) = 0,6 г/л;

(2,4 • 10-3 г) / (6,02• 10-3 л) = 0,4 г/л;

(2,4 • 10-3 г) / (7,02• 10-3 л) = 0,34 г/л;

(2,4 • 10-3 г) / (8,02• 10-3 л) = 0,3 г/л;

Вычислим теперь каким концентрациям эталонного гемоглобина в г/л будут соответствовать растворы при их приготовлении:

0,48 г/л -- 120 г/л

0,8 г/л -- х г/л

х = 200 г/л

Аналогичным образом выразим концентрации для других объемов растворителя.

Концентрация гемоглобина, г/л	Концентрация эталонного раствора гемоглобина, г/л	Объем добавляемого растворителя (лаурилсульфат натрия/ацетонцианогидрин)
0,8	200	3
0,6	150	4
0,48	120	5
0,4	100	6
0,34	85	7
0,3	75	8

Данные из этой таблицы будут использованы и при приготовлении калибровочных проб гемоглобинцианидного метода.

В пробирку вносится 5 мл приготовленного растворителя, затем, пипеткой Сали в раствор вводится 20 мкл крови, через 5 минут измеряется оптическая плотность приготовленного раствора при л = 540 нм против чистого растворителя. Аналогичным образом измеряется оптическая плотность калибровочных проб против чистого растворителя.

Для гемоглобинцианидного метода:

Смешать в мерной колбе необходимое количество концентрата монореагента с дистиллированной водой в соотношении 1:9.

Все остальные операции такие же, за исключением типа используемого трансформирующего реагента (растворителя).

Результаты фотометрии

Для гемоглобинцианидного метода:

Концентрация эталонного гемоглобина, г/л	Оптическая плотность, ед. опт. плотн.
75	0,195
85	0,224
100	0,252
120	0,298
150	0,389
200	0,516
Для реальной крови:
0,4

Для гемиохромного метода:

Концентрация эталонного гемоглобина, г/л	Оптическая плотность, ед. опт. плотн.
75	0,176
85	0,207
100	0,238
120	0,295
150	0,374
200	0,516
Для реальной крови:
0,385

Калибровочный график для двух методов

Где A, CN - зависимость оптической плотности раствора ацетонциангидрина от концентрации гемоглобина.

A, SLS - зависимость оптической плотности лаурилсульфата натрия от концентрации гемоглобина.

Зная оптическую плотность растворенной капиллярной крови в трансформирующем реагенте (ацетонциангидрине или лаурилсульфате натрия соответственно), мы можем по уравнениям аппроксимации найти значение концентрации гемоглобина в крови.

Для гемоглобинцианидного метода:

Для гемиохромного метода:

Поиск коэффициента корреляции между двумя методами определения гемоглобина

Поскольку шкала измерения оптической плотности является интервальной, это означает, что для расчета коэффициента корреляции должна использоваться формула Пирсона:

Где: где -- значения переменной x (оптическая плотность гемоглобинцианида); -- значения переменной (оптическая плотность гемиохрома) y; -- среднее арифметическое для переменной X; - среднее арифметическое для переменной y.



Выводы

В ходе проделанной работы были исследованы образцы крови автора работы на содержание гемоглобина. Полученные значения концентраций (152, 154 г/л) попадают в интервал нормальных значений для мужчин: 132-164 г/л.

Были закреплены навыки приготовления растворов, пипетирования и работы со спектрофотометром. При обработке полученных значений оптической плотности растворов в зависимости от концентрации гемоглобина были построены графики для гемоглобинцианидного и гемиохромного методов соответственно. По построенной графической зависимости видно, что в пределах низких концентраций гемоглобина от 75 г/л калибровочные графики не совпадают. Среднее расхождение значений оптической плотности на отрезке концентраций от 75 г/л до 200 г/л составляет около 0,011 единиц оптической плотности.

В то же время сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Из перечисленного следует, что гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов. В свою очередь, трансформирующий раствор ацетонциангидрина, использовавшийся для гемоглобинцианидного метода, может храниться при комнатной температуре, а его рыночная стоимость в среднем на 30% дешевле. Это означает, что выбор метода исследования концентрации гемоглобина основывается на личном предпочтении и наличии в лаборатории нужного оборудования.



Список литературы

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин - М.,: Медицина, 1990. - 704 с.

2. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко - СПб: ГЭОТАР-Медиа, 1998. - 472 с.

3. Пупкова В.И. Определение гемоглобина в крови / В.И. Пупкова - Кольцово: 2001. - 18 с.

4. Пупкова В.И., Жданова В.В. // Новости “Вектор-Бест”, 2000; № 1, с. 9-11.

Размещено на Allbest.ru

...