Моделирование стимуляции тимоцитов эритропоэтином в зависимости от исходного потенциала митохондрий

2- под действием возникшей продольной разности потенциалов вдоль мембраны митохондрий начинает протекать ток (со стороны матрикса)

3-это в свою очередь приводит к снижению протонного потенциала на мембране на величину .

Телеграфное уравнение позволяет рассчитать на каком расстоянии от участка возбуждения произойдет затухание волны, связанной с изменением протонного потенциала митохондрий после установления стационарного режима, когда в каждой точке .

При этих условиях телеграфное уравнение упрощается

,

Обозначим , тогда решение данного уравнения дает выражение:

,

Ясно, что , при и - длина митохондриального ретикулума, при которой первоначальный электрохимический потенциал снизится в раз.

коэффициент утечки продольного тока через мембрану, а -сопротивление продольному току.

Выразим через удельное сопротивление матрикса (и через удельное сопротивление мембраны (:

,

,

При

Полученная величина означает, что волна изменения ПП вдоль МЭК снижается по амплитуде в е раз на расстоянии, равном, примерно, длине двух митохондрий. Следовательно, именно это количество митохондрий необходимо для обеспечения энергией АТФ одного сократительного элемента вблизи митохондрии в течение периода его сокращения и расслабления.

Можно представить, что в результате ЭПО - стимуляции на поверхности тимоцита возникают мелкие волны, которые сопряжены с последовательным сокращением микротрубочек, микрофиламентов ЦС, обеспечивающих движение клетки.

6.3 Электро-механо-энергетическое сопряжение процесса возбуждения тимоцита при действии ЭПО

Из предыдущего следует, что неспецифический механизм стимуляции тимоцитов ЭПО при 37°С может быть обусловлен активацией кальциевых насосов (Са²⁺-АТФаз) на плазматической мембране после присоединения ЭПО к рецепторам и быстрого входа ионов Na²⁺, вызывающего временную деполяризацию мембраны.

В результате в тимоците может запускаться процесс сокращения-расслабления элементов цитоскелета - филаментов, связанных с автоволновым процессом колебаний концентрации кальция внутри клетки и с волновым процессом на мембранной поверхности тимоцита, который синхронно должен поддерживаться энергией ПП митохондрий в МЭК

Этапы в модели электромеханического сопряжения при ЭПО- возбуждении Т-хелпера:

1- При подаче на клетку стимулирующего ЭПО-сигнала (связывание с рецепторами), происходит снижение проницаемости мембраны, открываются быстрые (время активации порядка мс) натриевые каналы, ионы входят в клетку, вызывая временную деполяризацию мембраны;

2- В результате деполяризация плазматической мембраны в ней открываются потенциал-зависимые медленные кальциевые каналы (время жизни сотни мс), и ионы поступают из внеклеточной среды, где их концентрация внутрь клетки (внутриклеточная концентрация ;

3- Кальций, поступающий в клетку, активирует мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и митохондрий, являющиеся внутриклеточными депо ионов и высвобождает кальций. Ионы из ЭПР поступают в кальмодулированный комплекс в филаментах, что вызывает сокращение белков в активных центрах и дальнейшее развитие силы и укорочения филаментов, приводящие к волнообразному движению мембранной поверхности и к движению тимоцита.

4- По окончании процесса сокращения филаментов ионы с помощью кальциевых насосов активно закачиваются внутрь депо или пассивно входят по отрицательному градиенту электрического поля в митохондрии. Процесс заканчивается тем, что пассивно выходит из клетки, вызывая реполяризацию мембраны;

5- Ионы активно выводятся во внеклеточную среду с помощью кальциевых насосов (АТФ-аз), затрачивая энергию, получаемую при гидролизе АТФ.

Схема-модель электромеханоэнергетического сопряжения при ЭПО - возбуждении тимоцита (Т-хелпера) при связывании эритропоэтина (ЭПО) с рецепторами (Р). Фазы сокращения филаментов (1-3) и их расслабления (4-6). Митохондрии (МХ) разряжаются, поставляют энергию ПП (в форме АТФ) филаментам (Ф) и выбрасывая кальций в обмен на протон. При сокращении Ф происходит гидролизАТФ, после расслабления выделяется АТФ, которая используется для закачки ионов Са²⁺ в ЭПР и во внешнюю среду, в МХ-ях ионы кальция обмениваются на Н и ПП восстанавливается, затем всё повторяется в автоволновом режиме.

Таким образом электро-механо-энергетическогое сопряжение может обеспечить автоволновой процесс сокращений элементов цитоскелета при движении Т- хелперов. Остановка клеток при снижении температуры до 20° С вызывает прекращение волны изменения ПП в МЭК. Теперь эта энергия в течение минут затрачивается на аккумуляцию катионов зонда ДСМ в МХ-ии, что проявляется по возгоранию в них яркой флуоресценции зонда.



7. Оценка порогового уровня энергии тимоцита при ЭПО-стимуляции

Оценить уровень энергии АТФ, необходимой для ЭПО- стимуляции тимоцита. можно теоретически, подсчитав баланс энергии на всех этапах электромеханического сопряжения и используя экспериментальные данные по аккумуляции зонда-катиона ДСМ в митохондриях до и после воздействия ЭПО в тимоцитах ( из разных тимусов). Последнее позволяет, в принципе, оценить долю энергии, которая была затрачена на сократительные процессы в клетке. Сначала по флуоресценции ДСМ в экспериментах с тимоцитами оценим суммарный ТМП и энергию митохондрий в тимоцитах.

7.1 Оценка суммарного потенциала тимоцитов по аккумуляции флуоресценетного зонда-катиона ДСМ до и после воздействия ЭПО

В свете современных представлений клетку упрощенно можно рассматривать как мембранную везикулу, поделенную внутренними мембранами на отдельные замкнутые отсеки. Из данных, полученных в экспериментах с флуоресцентным зондом ДСМ, следует, что основными мембранными отсеками для катионов ДCМ в клетках являются митохондрии и цитоплазма. Лимфоцит можно моделировать как "мембранные везикулы внутри везикулы". Митохондрии можно рассматривать как основные везикулы, аккумулирующие катионы ДСМ, что сопряжено с генерацией протонного потенциала (ПП) на их мембранах

В соответствие с теорией Планка-Нернста [8, 20] свободная энергия (ДG) аккумуляции катионов ДCМ в митохондриях может служить мерой для оценки суммарного трансмембранного потенциала (ТМП) на внешней и митохондриальной мембране и его изменения после воздействия гормона ЭПО:

,

Тогда согласно термодинамике и теории Нернста равновесные концентрации катионов ДСМ лимфоцита в цитоплазме и митохондриях будут равны:

C₁=C₀*exp(-zF_ф?ц₁/RT)

C₂=C₀*exp(-zF_ф (?ц₁+?ц₂)/RT)

Где ?ц₁ , ?ц₂ -трансмембранный электрический потенциал (ТМП) на плазматической и митохондриальной мембранах соответственно, z- заряд в единицах заряда протона, F_ф- число Фарадея.

Таким образом, интенсивность флуоресценции катионного зонда ДСМ в митохондриях является ключевым индикатором энергетического состояния тимоцитов, в которых энергетические ресурсы обеспечиваются прежде всего за счёт работы митохондрий и практически нет гликолиза.

Согласно равновесным уравнениям для определения величин ?ц₁,?ц₂ или (?ц₁+?ц₂), необходимо знать концентрации C₁ и C_2..

С₁ задана в эксперименте, С₂=1,5 мМ и является насыщающей концентрацией ДСМ, когда достигается предел растворимости ДСМ в среде митохондрий, что соответствует предельной точке окончания линейного роста интенсивности флуоресценции ДСМ в зоне митохондрий. Выше этого предела растворимости ДСМ образует кристаллы, которые могут повреждать митохондрии, в результате ТМП и флуоресценция зонда снижаются. Микрофлуорометрический способ оценки величины суммы ТМП (?ц₁+?ц₂) в интактной клетке основан на регистрации интенсивности флуоресценции ДСМ в митохондриальных областях клетки (через оптический зонд флуорометрирующей насадки) [Г.Е. Добрецов, Г.И. Морозова, 1982]

Определение максимальной концентрации ДСМ в наружной среде С_0макс для насыщяющей концентрации ДСМ внутри митохондрий по экспериментальной кривой роста интенсивности флуоресценции ДСМ в зоне митохондрий при разных экспериментальных С_0.

В экспериментах ЭПО минимальная С₀= 0,15мкМ. Используя равновесные уравнения и данные экспериментов с ДСМ, получим максимальную энергию, запасённую в суммарном ТМП клетки ( в расчёте на одну митохондрию):

.

Согласно теории Планка-Нернста эта величина ТМП соответствует свободной энергия(ДG) аккумуляции катионов ДCМ в митохондриях и может служить мерой для оценки суммарного ТМП на внешней и митохондриальной мембране, а именно:

.

Если исходить из известных данных о величине потенциала покоя на мембране лимфоцита порядка - 60 мВ, то тогда по нашей оценке ТМП митохондрий лимфоцита составляет порядка - 170-180 мВ, что соответствует запасу свободной энергии в ПП одной митохондрии



_мх= 17-18 кДж/моль.

7.2 Количественная оценка энергии тимоцитов до и после воздействия ЭПО

В целом митохондриальная активность клетки определяется числом энергизированных митохондрий (n_мх) и уровнем их ПП.

Если после предварительной инкубации тимоцитов с ЭПО в клетках возросло число яркофлуоресцирующих митохондрий (при одинаковых условиях последующей инкубации этих клеток с ДСМ), значит, соответственно увеличивалась суммарная свободная энергия (), запасаемая в ПП митохондрий, которую можно оценить по данным экспериментов с тимоцитами (см. главу 4).

Согласно таблице 7.2.1. среднее число митохондрий в тимоцитах после инкубации клеток с ЭПО в среднем (для 27 тимусов) увеличилось на 10 шт.

Таблица 7.2.1. Влияние ЭПО (0,15 мкМ) на число активных митохондрий( N_m и на интенсивность флуоресценцию ДСМ (F) в тимоцитах (средние значения для клеток из 12 тимусов) [25 ].

	Контроль, %	+ ЭПО, %	Р
Доля клеток без флуоресцирующих митохондрий (Nс-фм )	39 ± 6 **)	3.7 ± 0,7	< 0.001
Доля клеток с флуоресцирующими митохондриями (Nс+фм )	61 ± 7	97 ± 1	< 0.025
Среднее число «энергизированных» митохондрий на клетку (Nm)	6.0 ± 0.7	16 ± 1	< 0.025
F (усл.ед.)	29 ± 6	74 ± 7	< 0.005



Следовательно, средняя энергия на клетку возросла в среднем до значений

,

Как показано выше в главе 1, при активации кальциевого насоса (переноса двух ионов кальция) необходима энергия порядка 47,5 кДж/моль, однако, после деактивации АТФ-аз обратно возвращается энергия порядка 17 кДж /моль, которая затем может использоваться в следующем цикле транспорта кальция. Отсюда следует, что для последующей активации одного кальциевого насоса в лимфоците достаточно 42 кДж/моль, т.е. энергии, выделяемой при гидролизе макроэргической фосфатной связи одной молекулы АТФ

В то же время необходимо наличие электрокабеля из нескольких митохондрий, в котором может происходить перераспределение энергии ПП и кальция в процессе распространения сокращения элементов ЦС в тимоците.

Из рассмотренных результатов экспериментов с ЭПО следует, что для индивидуальных тимусов исходная митохондриальная активность и концентрации кальция в цитоплазме тимоцитов могут сильно различаться, что отражается на интенсивности и характере флуоресцентного ответа клеток с ДСМ на действие ЭПО.

Зрелые малые Т- хелперы имеют определённый размер с диаметром порядка 7 мкм. Тогда на половине окружности меридиана уместится примерно 10-14 митохондрий размером 0,5 мкм каждая. Действительно как видно на фото число активных МХ-ий в одной цепи, соединяющей полюса стимулированного тимоцита составляет примерно 12 штук. Интересно, что на этом изображении можно видеть волнообразное искривление этой цепочки (с амплитудой в две МХ). Из решения телеграфного уравнения следует, что для запуска волны сокращений после ЭПО-сигнала достаточно две связные митохондрии вблизи поверхности, которые обеспечат включение МЭК после ЭПО-сигнала. протонный митохондриальный кальциевый

Остановка движения лимфоцитов при переносе суспензии клеток на стекло (при комнатной температуре) восстанавливает ПП митохондрий, который теперь не тратится на механические сокращения. Этим можно объяснить возгорание флуоресценции ДСМ в большем числе митохондрий (в 25 % тимоцитах), что и регистрируется как стимулирующий ЭПО - эффект.

Из опытных данных получим, что средняя суммарная энергия митохондрий на клетку при этом возрастает на:

17(16 - 6) = 170 кДж/моль,

если не учитывать возможное изменение на каждую митохондрию (. В принципе она должна быстро выравниваться в МЭК.

Это энергия была потрачена: на сигнальные процессы внутри клетки, на сократительные процессы, сопряженные с работой кальциевых насосов.

Из работ других исследователей [8,12]следует, что один элементарный акт сокращения использует свободную энергию гидролиза молекулы АТФ, преобразуя её энергию упругой деформации белка в микрофиламенте.

В этом акте стационарная скорость энергопродукции:

, где

- число тормозящих мостиков, - константа скорости распада тормозящих мостиков

- длина зоны, в которой мостик развивает тянущую силу, - сила мостика,



,

энергия гидролиза одной молекулы АТФ в одном элементарном цикле (тратится)

Однако, на сегодня не известно какие именно сократительные белки могут участвовать в связывании с комплексом кальций-кальмодулин при стимуляции тимоцитов гормонами. Известно, что микрофиламенты ЦС лимфоцита содержат актин, уже фосфорилированный миозин и тропонин, поэтому предполагается, что процесс сокращения - расслабления микрофиламентов в этих зонах идёт путём скольжения по типу замыкания - размыкания мостиков ( как в мышечных клетках: рис.).

Процесс замыкания-размыкания мостиков в сократительном элементе

Вопрос о конкретном механизме сокращения белков в тимоцитах требует специальных исследований.

Из рассмотренных результатов экспериментов с ЭПО следует, что для индивидуальных тимусов исходная митохондриальная активность и концентрации кальция в цитоплазме тимоцитов могут сильно различаться, что отражается на интенсивности и характере флуоресцентного ответа клеток с ДСМ на действие ЭПО.

Пороговый уровень энергии, необходимый для запуска волнового процесса в при ЭПО-стимуляции тимоцитов можно оценить из данных экспериментов на тимоцитах с ДСМ (табл.7.2.1): в контроле число активных митохондрий на клетку, имеющий рабочий уровень ПП - 6 шт.

Используя формулу (3) для выбранной рабочей концентрации ДСМ, свободная энергия, запасённая в ПП митохондрий одного тимоцита будет:

= 6х17 = 102 ( кДж/моль)

Полученная оценка нижнего порога энергии оказалась порядка величины энергии, выделяемой при гидролизе трёх молекул АТФ, т.е. необходимой для активации двух кальциевых насосов и одного акта элементарного сокращения.

Об инверсии дозы-эффекта ЭПО.

В то же время, как следует из кривых доза-эффект ЭПО (Рис 3.1), при росте дозы ЭПО свыше С_ЭПО > 20 U/мл происходит снижение эффекта стимуляции митохондрий или даже инверсия его. Это может быть связано с повреждением мембран и кальциевых каналов (АТФ-аз), токсическая концентрация кальция в цитоплазме повреждает часть митохондрий и они теряют ПП [3] .

Таким образом, по-видимому, чем больше в Т-хелпере исходно активных митохондрий с высокими ПП, тем эффективнее она реагирует на ЭПО, возбуждая большую площадь поверхности, «включая» в работу все МЭК.

Важно отметить, что впервые на основе такого подхода можно обобщить механизм неспецифических эффектов и других гидрофильных гормонов в не мышечных клетках, для которых характерно наличие МЭК, а именно в Т-хелперах и В-лимфоцитах, а также в макрофагах.

Согласно нашей модели гормональный сигнал ЭПО включает МЭК и активирует подвижность Т-_хелперов в течение первой фазы до 60 мин, при этом не исключено, что начинается и внутриклеточный каскад реакций, вызывающих активацию ядерных процессов и синтез специфических белков (типа лимфокинов), который может реализовываться в последующих фазах (свыше 90 мин).

Известно, что повышенное содержание гормонов в крови могут способствовать аллергической иммунной реакции. По данным наблюдений с зондом ДСМ в крови [2] больных с аллергическим синдромом, как правило, повышена подвижность Т-хелперов. Имеются клинические данные, указывающие на то, что при некоторых патологических состояний ЭПО повышает выход в кровь макрофагов, лимфоцитов, усиливая их миграцию [16.28,29] Эти факты находятся в согласии с нашей моделью ЭПО-стимуляции лимфоцитов гормоном ЭПО.



Выводы

1. Рассмотрены основные физико-химические механизмы рецепции и проведения гормональных сигналов в клетках, в том числе эритропоэтина.

2. Рассмотрены биофизические механизмы получения энергии в митохондриях и роль распространения протонного потенциала (ПП) в системе митохондриального электрокабеля (МЭК) при стимуляции клеток.

3. Кинетическая модель колебаний внутриклеточной концентрации ионов кальция под влиянием гормона рассмотрена с учётом сопряжённого изменения ПП в митохондриях.

4. Представлена модель распространения волны изменения протонного потенциала в МЭК Т-хелпера на основе телеграфного уравнения. Получена оценка параметра затухания (л) в митохондриях, согласующаяся с экспериментальными наблюдениями.

5. Предложена модель электромехано -энергетического сопряжения при ЭПО - стимуляции Т-хелперов.

6. Оценены энергозатраты при ЭПО-стимуляции тимоцитов и пороговый уровень энергии, необходимые для запуска первой фазы реакции клеток.



Список литературы

1. Афонькин С.Ю., Пинаев Г.П. Цитоскелет сигнализирует// Биология, 2000. № 22.

2. Владимиров Ю.В.. Кальциевые насосы живой клетки. Соровский образовательный журнал. 1998. № 3. С.20-27.

3. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация.2003

4. Акопова О.В. Обратимость энергозависимого накопления кальция в митохондриях. Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины. Киев. 2008.

5. Бакеева Л.Е., Ченцов Ю.С. Митохондриальный ретикулум: Строение и некоторые функции // Итоги науки. Общие проблемы биологии. 1989.

6. Бауман В. К. Роль кальция в структуре и функционировании биологических мембран. //Биомембраны. Структура, функции, методы исследования. Рига, 1977. C.198-215

7. Бейли И.Н. Статистические методы в биологии. М.: Наука, 1963. 277 с.

8. Биофизика (под ред. В.Ф. Антонова ). М.: Владос. 2003.

9. Веренинов А.А., Малахова И.И. Транспорт ионов у клеток в культуре. Л.: Наука, 1986.

10. Волькенштейн М.В. Биофизика М.: Наука. 2000.

11. Геннис Р., Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М. Мир 1997.

12. Дещеревский А.В. Математические модели мышечного сокращения. М., 1977.

13. Добрецов Г. Е., Дубур Г. Я., Морозова Г. И. и др.. Флуоресцентный зонд 4 (n-диметиламиностирил)-1-метилперединий: оптические свойства, Биофизика , 1981, т. 26, стр. 376-377

14. Добрецов Г. Е. , Морозова Г. И. , Баренбойм Г.М. Свободная энергия аккумуляции флуоресцентного зонда-катиона ДСМ в митохондриях живого лимфоцита, Биофизика,1985,т.30,с. 833-836

15. Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов , М. Наука, 1989.

16. Колесник, ИМ. Покровский, В.А. Лазаренко Фармакологическое прекондиционирование эритропоэтином - новые возможности оптимизации выживаемости ишемизированных тканей/ И.М. Колесник, М.В. // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье".: 2010. №3. С.32-36.

17. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. М., 1986.

18. Кучеренко Н.Е., Войцицкий В.М. Биоэнергетика. Киев.1982. 270 с.

19. Ляшенко В.А., Дроженников В.А., Молотковская И.М. Механизмы активации иммунокомпетентных клеток. М.: Наука.1988. 240 с.

20. Маркин В.С., Чизмаджев. Ю.А. Индуцированный ионный транспорт М., 1974.

21. Морозова Г.И. Трансмембранные потенциалы и митохондриальная активность клеток. Практикум по курсу «Введение в биофизику». 2013. 21 с.

22. Морозова Г.И., Аношин А.А., Оболонкова А.Н. Моделирование иммунной сети на основе структурно-энергетических параметров клеточных популяций в крови./ Труды 18-й международной конференции «Математика. Компьютер. Образование. Москва-Ижевск, АНО НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», Январь-февраль,2011.С. 56.

23. Морозова Г.И., Баренбойм Г.М., Добрецов Г.Е. Взаимодействие некоторых ксенобиотиков с живыми клетками: исследование методом флуресцентных зондов. // Хим.-фарм.ж. 1982. № 12. С.1452-1457.

24. Морозова Г.И., Добрецов Г.Е., Дубуре Р.Р., Дубур Г.Я., Голицын В.М., Владимиров Ю.А. Флуоресценция зонда 4-(n-диметиламиностирил)-1-метилпиридиния в живой клетке. //Цитология. 1981. Т.23. № 8. С. 916-923.

25. Морозова Г.И., Пархоменко Т.В., Клитченко О.А., Томсон В.В. Стимулирующее влияние эритропоэтина на энергетику тимоцитов, выявляемое по флуоресценции потенциал-чувствительного зонда в митохондриях. //Биологические мембраны. 2007.Т. 24. № 6. С.472-478.

26. Морозова Г.И., Полетаев А.И., Борщевская Т.А. Инвертированный электрохимический потенциал на ядерной мембране клеток и его связь с клеточной энергетикой. // Тез.докл. 2-го съезда биофизиков России. М. 23-27 августа, 1999. С. 256-257.

27. Morozova G.I., Kamyshov A.N., Frolova E.V., Gyrlin A.V. Changes of сell energetics and membrane potentials at the animal organ surfaces during ieshemia, revealed by the method of fruorescent probes. Аbstractsconstuent congress “ International society for pathophysiology”. Moscow. May28-Iune, 1991. P.55.

28. Осиков М. В. Григорьев T. A. Масленникова Н. П. Роль эритропоэтина в реализации межклеточных взаимодействий в крови у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности. // Проблемы здравоохранения: Вестник ЮгУрГУ № 7. С.224

29. Осиков М.В., Кишкин А.М., Федосов А.А.. Механизмы влияния эритропоэти на показатель адаптивного иммунитета при экспериментальной термической травме.// Современные проблемы науки и образования. 2015. № 3

30. Рамазанова ЖА., Морозова Г.И. Моделирование автоволнового процесса на поверхности сердца с учетом митохондриальных электрокабелей //Труды XLVI Всероссийской конференции по проблемам математики. физики, химииМ.:РУДН, 2010.С.13.

31. Романовский Ю.М., Степанова Н.В., Чернавский Д.С. Математическое моделирование в биофизике. Введение в теоретическую биофизику. Москва-Ижевск: Институт компьютерных исследований. 2004

32. Рубин А.Б., Биофизика. 2004. Т1. С.17-50

33. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М: Наука, 1989.

34. Скулачев. В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М. Наука, 1972. 203 С.

35. Трухан Э.М. Введение в биофизику. М.,2008. 242 С.

36. Футолон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клеток. М.: Мир, 1987.

Размещено на Allbest.ru

...