Полиморфизм промоторной области гена APT(однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G)

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ГОУ ВПО «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Н. И. ЛОБАЧЕВСКОГО»

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра молекулярной биологии и иммунологии

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной биологии и генной инженерии НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского

Курсовая работа

Полиморфизм промоторной области гена APT(однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G)

гр.0143-5 Шарова М.А.

Научные руководители:

доц.,к.б.н. Казацкая Ж.А.

м.н.с. Сахарнов Н.А.

Нижний Новгород 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs)

1.2 Fas-антиген

1.2.1 Однонуклеотидные полиморфизмы гена Fas

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Ферменты и биопрепараты

2.2 Выделение тотальной РНК

2.3 Обратная транскрипция

2.4 Полимеразная цепная реакция

2.5 Визуализация результатов ПЦР методом электрофореза

нуклеиновых кислот в 1,5% агарозном геле

2.6 Определение нуклеотидной последовательности

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Определение первичной структуры кДНК промоторного участка гена FAS в клетках опухолевых очагов больных раком толстого кишечника

3.2 Разработка метода аллельспецифической ПЦР

для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas

ВЫВОДЫ

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

ВВЕДЕНИЕ

однонуклеотидный полиморфизм рибонуклеиновый ген

Одной из актуальных проблем биологии и медицины является проблема исследования первичной структуры генов и их функциональных частей, так как они связаны с регуляцией экспрессии этих генов. Изменение экспрессии жизненно важных генов может привести к различным заболеваниям.

В последнее время очень распространены исследования, направленные на выявление полиморфизмов, связанных с индивидуальной предрасположенностью к заболеваниям и устойчивостью организма к воздействию окружающей среды. Частота встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов может служить генетическими маркерами предрасположенности к различным заболеваниям.

В популяционных исследованиях и картировании широкое применение нашли однонуклеотидные полиморфизмы, расположенные в некодирующих регионах и не меняющие структуру и функцию белков.

Цель данной работы:

- Разработка метода анализа аллельных вариантов промоторной области гена APT-1 (однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G).

Задачи:

- Выявить аллельные варианты промоторной области гена APT-1 (однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G) в клетках опухолевого очага больных раком толстого кишечника методом прямого определения нуклеотидной последовательности.

- Разработать метод аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs)

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs - single nucleotide polimorphisms) - геномные позиции, в которых есть две отчетливые нуклеотидные аллели, причем каждая проявляется в значительной части человеческой популяции (La Framboise, 2009). SNPs являются частным случаем ONP.

ONP - вариабельные позиции в последовательности геномной ДНК, для которых частота встречаемости в популяции наименее распространенного варианта превышает 1%. В кодирующих регионах генома они встречается реже, чем в некодирующих. На тысячу оснований приходится одна вариабельная позиция (Ребриков и др., 2009)

SNPs являются однонуклеотидными заменами одного основания на другое. Каждая позиция SNP в геноме может иметь четыре варианта: один для каждого нуклеотида - A, C, G и T. (рис.1) Однако не все однонуклеотидные изменения являются SNPs. Классифицированные как SNP, два или более варианта последовательности должны быть представлены (наблюдаемы) менее чем у 1% и?двидуумов от всего насе?ения.

В геноме человека обнаружено около 10 миллионов однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs) (Kruglyak, Nickerson, 2001). Было показано, что SNPs встречаются через каждые 100-300 оснований. Во всем человеческом геноме содержится приблизительно от 10 до 30 миллионов потенциальных SNPs. Более чем 4 миллиона SNPs было опубликовано в разных банках данных. Многие из этих SNPs выполняют неизвестные функции (Perkin, 2005).

Изучение SNP ведется во многих организмах. Среди важнейших агрокультур генетическая модификация кукурузы, пшеницы, соевых, риса может увеличить высокий урожай при меньшем количестве удобрений, инсектицидов, гербицидов. Среди микроорганизмов и вирусов SNPs известны по причине их влияния на лекарственную устойчивость (Perkin, 2005).

Есть 2 типа замен нуклеотидных оснований, дающих SNPs:

Транзиция - случается между пуриновыми основаниями (A, G) или между пиримидиновыми основаниями (C, T). Этот тип замены составляет две трети всех SNPs. A (пурин) T (пиримидин) >G (пурин) C (пиримидин).

Трансверсия - случается между пуриновым и пиримидиновым основанием. A (пурин) T (пиримидин) > C (пиримидин) G (пурин).

SNP в кодирующей последовательности могут иметь 2 различных действия на образуемый белок:

Синонимичное - изменение не позволяет аминокислоте присоединиться к белку ею продуцируемому. Его также называют безмолвная мутация.

Несинонимичное - изменение дает модификацию закодированной аминокислоты. Незначительная мутация изменяет белок при изменении кодона. Бессмысленная мутация имеет результатом недостающий терминальный кодон. SNPs могут также случаться в регуляторной области генов. Эти SNPs способны изменять количество или хронометрировать продукцию белка (Kaleigh, 2002).

Наличие SNPs может определять предрасположенность к определенным заболеваниям, чувствительность к медикаментам и патогенам (Urquhart, 2011).

SNPs связаны с аутоиммунными заболеваниями, такими как диабет 1 типа, множественный склероз, ревматоидный артрит и системная красная волчанка и опухолевых - рак кишечника, легких, поджелудочной железы, различными видами карцином, лейкемией. (Hampe et al., 1999; Nagata, 1999).

Большую актуальность приобретают исследования по влиянию SNPs на экспрессию проапоптотических белков. Известно, что при развитии опухолевых процессов изменяются механизмы самоуничтожения клеток таким образом, что злокачественно трансформированные клетки экранируют цитотоксическое действие иммунной системы организма и приобретают конкурентные преимущества в росте. Механизмы ухода опухолевых клеток из-под иммунного надзора во многом касаются регуляции экспрессии проапоптотических белков, в частности мембранного рецептора смерти Fas (CD95). Изменения экспрессии Fas и/или FasL часто выявлются при опухолевых заболеваниях человека.

1.2 Fas-антиген

Fas/CD95/APO-1 антиген - гликозилированный трансмембранный белок типа с молекулярной массой 45 кДа, содержащий в своем составе 320 аминокислотных остатков.

В функциональном отношении Fas является биполярной молекулой. Ее внеклеточный участок необходим для взаимодействия с FasL, а цитоплазматический регион (DD - домен смерти) требуется для индукции апоптотического сигнала.

Fas (CD95) - трансмембранный протеин, опосредующий апоптоз (Nagata, 1994). Это член семейства рецепторов факторов некроза опухолей (TNF, NGF), проводящий апоптотический сигнал в чувствительные к апоптозу клетки (Leithauser et al., 1993; Kim et al., 2000).

Тримерная форма мембранной формы Fas антигена (Новиков, 2005)

Снижение или полное ингибирование экспрессии Fas (CD95) является важной особенностью злокачественной трансформации, которая приводила к потере дифференциации эпителиальных клеток и потере чувствительности к апоптозу (Besma Bel Hadj Jrad et al., 2006).

Экспрессия Fas может регулироваться определенными генетическими элементами, расположенными в 5'-некодирующей последовательности гена (промоторе). Вариации данной последовательности могут выражаться в различных уровнях экспрессии этого гена. Геномная организация гена Fas была определена, охарактеризован промоторный регион этого гена (Cheng et al., 1995). Этот регион охватывает последовательность в 2000 нуклеотидных пар и включает в себя основной промотор, энхансер и сайленсер (Rudert et al., 1995).

1.2.1 Однонуклеотидные полиморфизмы гена Fas

Имеется много данных о связи SNP гена Fas с опухолевыми и другими заболеваниями, которые вызваны нарушением функции апоптоза.

В промоторном регионе Fas было найдено несколько полиморфизмов, аллельные частоты которых влияют на экспрессию этого гена. Наиболее известен среди них Fas-670A/G, расположенный внутри энхансерного участка (Cheng et al., 1995).

Было показано, что полиморфизмы (Fas -670A/G (rs1800682) и Fas -1377G/A (rs2234767)) нарушают регуляцию промоторной активности гена Fas (Huang et al., 1997; Kanemitsu et al., 2002; Sibley et al., 2003). Встречаемость полиморфных аллелей Fas-670A/G была связана с чувствительностью индивидуумов к ревматоидному артриту (Lee et al., 2001). Аллель Fas -670A связана с чувствительностью к диффузному и кожному системному склерозу (SSc), определяя на генном уровне патогенез заболевания (Liakouli, Manetti, Pacini et al., 2009). Было показано, что Fas-670C/T (rs1800682,) ассоциирован с развитием инсульта у индивидов корейской популяции (Kang et al., 2010). Встречаемость Fas -670C/T связана с частотой заболеваемости кожным системным склерозом (Broen et al., 2009). Было определено, что частоты встречаемости однонуклеотидных полиморфизмов промотера Fas (SNPs) -670, -690 и -1377 влияют на развитие и протекание саркоидоза у афро-американцев (Wasfi et al., 2008) . Было показано, что частота аллельного варианта Fas-670AA не связана с чувствительностью к гипертонии, по сравнению с Fas-670GG, но наличие аллельного варианта Fas-670G/A может быть фактором риска заболевания инфаркта миокарда (Hanasaki et al., 2009). Показано, что Fas -670A/G и повышенные концентрации sFas связаны с присутствием антиганглиозидных антител при синдроме Джиллайн-Барр (дыхательный паралич) (Geleijnsab et al., 2004). SNP Fas -1377G/A может влиять на чувствительность индивидуумов к развитию гепатоклеточной карциномы (HCC), но не гепатита B (HBV) (Jung et al., 2007). Было обнаружено, что полиморфизмы в Fas (FASL-844C/T (rs 763110) и FASL-478A/T (rs10640513)) могут способствовать тромбоцитопении при системной красной волчанке (SLE) (Kelly et al., 2005).

С другой стороны, некоторые полиморфизмы Fas не влияют на развитие аутоиммунных и онкологических заболеваний.

Полиморфизмы -1377G/A и -670A/G гена FAS не влияют на транскрипцию Fas и не вовлечены в риск заболевания различными видами рака (рак легкого, рак кишечника, рак простаты, рак головы и шеи) (Zhang, Xue, Gong, 2009).

Частота встречаемости альтернативных аллельных вариантов SNPs гена Fas связаны также и с опухолевыми заболеваниями.

Было показано, что однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G нарушает сигнальные пути апоптоза и влияет на чувствительность клеток к развитию различных опухолей. Носители гомозиготного Fas-670GG генотипа имели значительно более низкий уровень выживаемости в отличие от носителей генотипа AA/AG при раке толстого кишечника. (Hofmann et al., 2009).

Частота встречаемости альтернативных аллельных вариантов Fas-670(A/G) была ассоциирована с частотой заболевания раком толстого кишечника у индивидуумов японской популяции, а генотип Fas -670 GG был связан с повышенным риском развития рака кишечника по сравнению с генотипом AA (Ueda et al., 2005).

Также показано, что частота встречаемости однонуклеотидного полиморфизма (SNP) Fas -670A/G связана с развитием рака кишечника (Engelmark, Renkema, Gyllensten, 2004).

Аллель Fas -1377A и генотип Fas -1377AA были связаны с выживаемостью, стадией или экспрессией Fas при раке толстого кишечника (Lerma et al., 2011).

Было показано, что функциональные полиморфизмы в Fas и Fas-лиганде (FasL) связаны с чувствительностью к раку легких. Показано, что Fas -1377G, Fas -670A, и FasL -844T варианты экспрессированы чаще на ex vivo-стимулированных T- клетках, чем Fas -1377A, Fas -670G и FasL -844C варианты (Sun, Zhou, Li et al., 2005).

Сообщается, что полиморфизмы Fas?1377G/A и FasLG-844C/T ассоциированы с риском заболевания раком носоглотки (Cao et al., 2010).

Также показано, что аллель Fas -670C могла быть использована как генетический маркер риска метастаз у пациентов раком носоглотки (Zhu et al., 2010).

Было продемонстрировано, что полиморфизм Fas-670 (GA>GG) был значительно связан с раком носоглотки в популяции Туниса. Этот полиморфизм связан не только с увеличением риска рака носоглотки у тунисцев, но также с регуляцией иммунного ответа, обнаруженного при этом раке (Besma Bel Hadj Jrad et al., 2006).

Было обнаружено, что генотипы Fas и FasL и гаплотипы Fas не имели значительных связей с риском заболевания раком желудка. Также не было обнаружено значительных связей между полиморфизмами Fas и FasL (Fas -1377G/A, Fas -670A/G и FasLG -844T/C) в развитии рака желудка в южно-китайской популяции (Wang et al., 2009).

Не было обнаружено связи риска заболевания раком поджелудочной железы с полиморфизмами Fas (Fas-1377G/A, Fas-670A/G, FasL-844T/C), но генетические вариации в генах FasL и CASP8 играют роль на ранней стадии рака поджелудочной железы (Yang et al., 2008).

Частота встречаемости полиморфизма Fas-670A/G не была связана с чувствительностью индивидуумов к множественному склерозу (Multipal Sclerosis), также не было обнаружено связи между встречаемостью полиморфизма гена Fas-670A/G и стадией заболевания. (Niino et al., 2002).

2. Материалы и методы исследований

Материалами для исследования явились 4 образца периферической крови здоровых доноров и 4 образца клеток опухолевого очага больных раком толстого кишечника, предоставленные клиникой Областного онкологического центра им. Семашко г. Нижнего Новгорода.

2.1 Ферменты и биопрепараты

Дезоксинуклеозидтрифосфаты в растворе - смесь 4-х дНТФ, по 2 мМ каждого из дНТФ (Fermentas, Латвия); Taq - ДНК полимераза, укомплектованная 10Xбуфером (ООО «Генные и клеточные технологии», Россия, Н.Новгород); M-MuLV обратная транскриптаза, укомплектованная 5Xбуфером (Promega, США).

2.2 Выделение тотальной РНК (Chomczynski et al., 1987)

Образцы периферической крови здоровых доноров были помещены в пластиковую пробирку (типа «Eppendorf») и подвергались лизированию.

К 200 мкл лизирующего раствора (6М ГИТЦ, 1% Тритон X100, 100мМ ацетат Na, pH 7.0, 2% в-меркаптоэтанол) добавлялся такой же объем периферической крови и перемешивался. Затем добавлялось 200 мкл смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1/1 pH 5.0). Смесь интенсивно перемешивалась на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия). Для разделения фракций проба центрифугировалась на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 14.5 тыс. об./мин в течение 15 минут.200 мкл водной фазы отбиралось в чистую пробирку, депротеинизированная РНК преципитировалась 200 мкл изопропилового спирта (20-60 минут при -20?С). РНК осаждали центрифугированием на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 15 тыс об./мин в течение 20 минут. Осадок промывался 800 мкл 75% этанола, центрифугировался 5 минут и сушился при комнатной температуре (или при 60?C в термостате) до исчезновения запаха спирта. Очищенная РНК ресуспендировалась в 20 мкл деионизированной воды, свободной от РНКаз и хранилась в холодильнике при -20?C до использования (не более 2 недель)

2.3 Обратная транскрипция (Дейвис, 1990)

В амплификационные пробирки вносили по 0.5 мкл R праймера (Fas GR-20), 4,5 мкл РНК, выделенной из лимфоцитов крови человека, 1 капля минерального масла. Смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе 94?С в течение 1мин. В отдельной пробирке готовили реакционную смесь для анализа необходимого числа проб как представлено в таблице 1.

Таблица 1 Состав реакционной смеси для проведения реакции обратной транскрипции

Количество проб	1	2	3	4	5
10XБуфер	2,5	5	7,5	10	12,5
dNTP	2	4	6	8	10
M-MuLV-ревертаза	0,5	1	1,5	2	2,5
2d H2O	17	34	51	68	85

Реакционную смесь вносили под масло, содержимое пробирки перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), проводили краткое центрифугирование в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Пробирки помещали в амплификатор «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), инкубировали по программе: 42?С - 40 мин.; 94?С - 5мин.

2.4 Полимеразная цепная реакция (Дейвис, 1990)

Для проведения ПЦР готовили необходимое количество реакционной смеси для анализа необходимого числа проб в пропорциях, представленных в таблице 2. Для устранения погрешности, вносимой дозаторами при смешивании микрообъемов, общую смесь готовили из расчета на одну пробу больше, чем необходимо.

Таблица 2 Состав реакционной смеси для проведения ПЦР

Количество проб	1	2	3	4	5
10XБуфер (мкл)	2,5	5	7,5	10	12,5
dNTP(мкл)	2	4	6	8	10
F-праймер (GR-20)(мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5
Tag-pol(мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5
2d H2O(мкл)	17	34	51	68	85
R-праймер (Fas-OF) (мкл)	0,5	1	1,5	2	2,5

Смесь хорошо перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин.

В маркированные пробирки объемом 0.5 мл вносили по 23 мкл полученной реакционной смеси и по 2 мкл ДНК, полученной в результате реакции обратной транскрипции. Компоненты перемешивали на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия), смесь кратко центрифугировали в микроцентрифуге «Eppendorf Centrifuge 5414» при 14 тыс. об/мин. Для предотвращения испарения жидкости реакционную смесь покрывали двумя каплями минерального масла. Реакционную смесь инкубировали в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по программе Fas Hot Start.

Таблица 3 Условия инкубации реакционной смеси в амплификаторе «Терцик»

Температура в 1 цикле	Длительность цикла, сек.	Общее количество циклов
94єС	60	45
94 єС	30
65єС	30
72єС	45
72єС	300

Таблица 4 Праймеры для выявления полиморфизма Fas -670 (A/G)

Праймеры	Нуклеотидная последовательность (5ґ-3ґ)
Fas snp F (A)	5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgA-3'
Fas snp F(G) alt	5'-ggTTAACTgTCCATTCCAgg -3'
Fas snp R	5'-TggCATgCTCACTTCAggTg -3'

Таблица 5 Первичная структура праймеров для амплификации промоторного участка гена FAS, содержащего олигонуклетидный полиморфизм Fas-670A\G

Праймер	Нуклеотидная последовательность 5'- 3'
FasFp	AgTgTgTCCAgTCTggAACT
FasRp	CgAggTAACTAAgTCgTTgA

Результаты реакции анализировали методом электрофореза в агарозном геле.

2.5 Визуализация результатов ПЦР методом электрофореза нуклеиновых кислот в 1,5% агарозном геле (Maniatis, 1982)

Готовили 1,5%-ный агарозный гель с лунками для внесения проб. Для этого 1,5 г агарозы разводили в 100 мл рабочего трис-ацетатного буферного раствора (24,2 г трис-(гидрокси)аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М раствора этилендиаминотетрауксусной кислоты, pH 8.0) и добавляли 10мкл 10%-ного водного раствора бромида этидия. Суспензию нагревали на водяной бане до полного растворения агарозы, периодически помешивая. Раствору давали остыть примерно до 50?С и заливали в форму для агарозного блока, вставляли гребенку для образования лунок и давали агарозе застыть до состояния геля.

Из-под слоя масла отбирали 10 мкл раствора амплифицированной ДНК и смешивали с 10 мкл буферного раствора для нанесения проб (50% глицерина, 0,25% бромфенолового синего в дистиллированной воде). Полученную смесь переносили в лунки геля. Камеру для электрофореза «Helicon» (г. Москва) подключали к источнику питания «Эльф-2» (Россия), соблюдая полярность. Проводили электрофорез в течение 15 минут при напряжении 200 вольт (краситель должен пройти не менее 2 см геля). Отключали ток. Помещали гель в окно трансиллюминатора «Biokom UVT-1» (Франция). Результат регистрировали с использованием системы видеодокументирования «VITRan».

2.6 Прямое определение нуклеотидной последовательности

Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты кДНК вырезали из агарозного геля с последующей элюцией и очищали с использованием набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Латвия) согласно рекомендациям производителя. Реакцию терминирования дидезоксинуклеозидтрифосфатами, меченными флюоресцентными красителями, проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit («Applied Biosystems», USA). К 5 мкл ДНК добавляли 1 мкл BigDye Terminator, 2 мкл буфера и 0.5 мкл праймера, инкубировали при 94С в течение 5 мин и проводили 25 циклов ПЦР по следующей программе: 94С - 10 сек, 50С - 10 сек, 62 - 4 мин. Реакционную смесь переосаждали изопропанолом, разводили в 20 мкл деионизованного формамида и прогревали при 94С в течение 5 мин. Затем проводили анализ нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК с использованием генетического анализатора ABI Prizm 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», USA).

3. Результаты и их обсуждение

3.1 Определение первичной структуры кДНК промоторного участка гена FAS в клетках опухолевых очагов больных раком толстого кишечника

С целью выявления аллельных вариантов однонуклеотидного полиморфизма Fas-670A/G) в промоторной области гена FAS была определена первичная структура 4 образцов нуклеотидных последовательностей промоторных областей гена FAS, выделенных из клеток опухолевого очага больных раком толстого кишечника.

Первичные последовательности хромосомных ДНК промоторных участков генов Fas сравнивали между собой и с последовательностями хромосомных ДНК промоторных участков данных генов, полученными в международной базе данных EMBL Gene Bank. В результате сравнения было обнаружено, что в 4 образцах выявлялись гомозиготные варианты аллеля по А (1 образец) и G (1 образец) и 2 гетерозиготы AG (2 образца) (рис.4).

Рис. 4 Первичная структура ДНК промоторной области гена Fas, выделенной из образца клеток опухолевого очага больного раком толстого кишечника

3.2 Разработка метода аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas

Поскольку метод прямого определения нуклеотидной последовательности промоторных участков сопряжен с большой сложностью, затратами времени и реактивов, нами был разработан более удобный метод аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas.

Для этого нами была подобрана комбинация специфических праймеров (двух прямых и одного обратного). Каждый из прямых праймеров был специфичен либо к аллельному варианту Fas-670A, либо к Fas-670G.

Из клеток периферической крови здоровых доноров была выделена тотальная ДНК. Полученная кДНК Fas амплифицировалась с помощью ПЦР со специфическими праймерами. Результаты амплификации визуализировались с помощью электрофореза в агарозном геле.

На первом этапе работы при ПЦР была задана температура отжига праймеров 55єС. (условия ПЦР см. в таблице 4). В результате было получено много неспецифических продуктов амплификации (рис.5).

Электрофореграмма детекции альтернативных аллелей гена Fas (подбор условий реакции при температуре отжига праймеров 55°С).

На втором этапе работы оптимизировались условия амплификации промоторных участков гена FAS. Была использована модификация метода ПЦР Hot Start, при которой амплификация неспецифических продуктов исключалась добавлением Taq-полимеразы в нагретую до 80°С реакционную смесь. Температура отжига праймеров варьировалась от 60єС до 65єС и увеличено количество циклов ПЦР до 45. (рис.6). В результате были получены специфические продукты амплификации промоторного участка гена FAS, содержащие аллельные варианты однонуклетидного полиморфизма Fas-670A\G. Наиболее оптимальными условиями ПЦР оказались при температуре отжига праймеров 62єС и количестве циклов 45.

Рис. 6 Электрофореграмма оптимизации условий ПЦР для детекции аллелей гена Fas

Выводы

- Выявлены аллельные варианты промоторной области гена APT-1 (однонуклеотидный полиморфизм Fas-670A/G) в клетках опухолевого очага больных раком толстого кишечника методом прямого определения нуклеотидной последовательности.

- При разработке метода аллельспецифической ПЦР для анализа однонуклеотидного полиморфизма -670A/G промоторного участка гена Fas подобран оптимальный температурный режим (62єС), количество циклов ПЦР (45) и специфические праймеры.

Список литературы

1. Новиков В.В., Добротина Н.А., Бабаев А.А. Иммунология. Н. Новгород: ННГУ им. Н.И. Лобачевского, 2005. 239 с.

2. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени» М.: БИНОМ, 2009. 223 с.

3. Broen J., Gourh P., Rueda B. et al. The FAS -670A>G polymorphism influences susceptibility to systemic sclerosis phenotypes // Arthritis. Rheum. 2009. Vol.60. Р.3815-3820.

4. Cao Y., Miao X.P., Huang M.Y. et al. Polymorphisms of death pathway genes FAS and FASL and risk of nasopharyngeal carcinoma // Mol. Carcinog. 2010.Vol.49. P.944-950.

5. Cheng J., Liu C., Koopman W.J. et al. Characterization of human Fas gene. exon/intron organization and promoter region // J. Immunol. 1995. Vol.154. Р.1239-1245.

6. Colella S., Yau C., Taylor J.M. et al. Making SNPs make sense // Pharmacogenetics. 2011. Vol. 12. P.1-2.

7. De Maria R., Boirivant M., Cifone M.G. et al. Functional expression of Fas and Fas ligand on human gut lamina propria T lymphocytes. A potential role for the acidic sphingomyelinase pathway in normal immunoregulation // J. Clin. Invest. 1996. Vol. 97. P.316-322.

8. Engelmark M. T., Renkema K. Y., Gyllensten U. B.. No Evidence of the Involvement of the Fas-670 Promoter Polymorphism in Cervical Cancer In Situ // Int. J. Cancer. 2004. Vol.112. P.1084-1085.

9. Geleijnsab Karin, Lamanb Jon D., Rijsab Wouter van et al. Fas polymorphisms are associated with the presence of anti-ganglioside antibodies in Guillain-Barrй syndrome (GBS) // Journal Home. 2005. Vol.161. P.183-189.

10. Hampe J., Shaw S.H., Saiz R. et al. Linkage of inflammatory bowel disease to human chromosome 6p. // Am. J. Hum. Genet. 1999. Vol.65. P.1647-1655.

11. Hanasaki Hiroko, Takemura Yukihiro, Fukuo Keisuke et al. Fas promoter region gene polymorphism is associated with an increased risk for myocardial infarctionFas gene polymorphism in cardiovascular disease // Hypertension Research. 2009. Vol.32. Р.261-264.

12. Hofmann Guenter, Langsenlehner Uwe, Langsenlehner Tanja. A common hereditary single nucleotide polymorphism in the gene of FAS and colorectal cancer survival // Journal of Cellular and Molecular Medicine.2009. Vol.10. P.1-12.

13. Huang Q.R., Morris D., Manolios N. Identification and characterization of polymorphisms in the promoter region of the human Apo-1/Fas (CD95) gene // Mol. Immunol. 1997. Vol.34. P.577-582.

14. Jrad B. B. H, Wijden M., Noureddine B. et al. A polymorphism in FAS gene promoter associated with increased risk of nasopharyngeal carcinoma and correlated with anti-nuclear autoantibodies induction // Cancer Letters. 2006. Vol.233. P. 21-27.

15. Jung Yong Jin, Kim Yoon Jun, Kim Lyoung Hyo et al. Putative Association of Fas and FasL Gene Polymorphisms with Clinical Outcomes of Hepatitis B Virus Infection // Intervirology. 2007. Vol. 50. Р. 369-376.

16. Kanemitsu S., Ihara K., Saifddin A. et al. A functional polymorphism in Fas (CD95/APO-1) gene promoter associated with systemic lupus erythematosus // J. Rheumatol. 2002. Vol.29. P.1183-1188.

17. Kang Sung Wook, Chung Joo-Ho, Kim Dong Hwan et al. A Promoter SNP (rs1800682, -670C/T) of FAS Is Associated with Stroke in a Korean Population // Genomics & Informatics. Vol. 8, №4. P.206-211.

18. Kelly J. A., Pociot F., Moser K. L. et al. Functional promoter haplotypes of the human FAS gene are associated with the phenotype of SLE characterized by thrombocytopenia // Genes and Immunity. 2005. Vol. 6. P.699-706.

19. Kim K.M., Lee K., Hong Y.S., Park H.Y. Fas-mediated apoptosis and expression of related genes in human malignant hematopoietic cells // Exp. Mol. Med. 2000. Vol.32. Р.246-254.

20. Kruglyak L., Nickerson,D.A. Variation is the spice of life. Nat. Genet. 2001. Vol.27. P. 234-236.

21. LaFramboise Th. Single nucleotide polymorphism arrays: a decade of biological, computational and technological advances // Nucleic Acids Research. 2009. Vol. 37, № 13. P. 4181-4193.

22. Lee Y.H., Ji J.D., Sohn J., Song G.G. Polymorphsims of CTLA-4 exon 1 +49, CTLA-4 promoter -318 and Fas promoter -670 in spondyloarthropathies // Clin. Rheumatol. 2001. Vol.20. P.420-422.

23. Leithauser F., Dhein J., Mechtersheimer G. et al. Constitutive and induced expression of Apo-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells // Lab. Invest. 1993. Vol.69. Р.415-429.

24. Lerma E., Romero M., Gallardo A. et al. Prognostic significance of the Fas-receptor/Fas-ligand system in cervical squamous cell carcinoma // Medicine. 2011.Vol. 452, №1. P.65-74.

25. Liakouli V., Manetti M., Pacini A. et al. The ?670G>A polymorphism in the FAS gene promoter region influences the susceptibility to systemic sclerosis // Ann. Rheum. Dis. 2009. Vol.68. P.584-590.

26. Nagata S. Apoptosis regulated by a death factor and its receptor: Fas ligand and Fas // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1994. Vol.354. Р.281-287.

27. Nagata S. Fas ligand-induced apoptosis // Annu. Rev. Genet. 1999. Vol.33. P.29-55.

28. Niino M., Kikuchi S., Fukazawa T. et al. An examination of the Apo-1/Fas promoter Mva I polymorphism in Japanese patients with multiple sclerosis // BMC Neurology. 2002. Vol.2. P.8.

29. Perkin Elmer. SNP and Genotyping Overview // Pharmacogenomics. 2005. Vol. 12. Р.1.

30. Rudert F., Visser E., Forbes L. et al. Identification of a silencer, enhancer, and basal promoter region in the human CD95 (Fas/Apo-1) gene // DNA Cell. Biol. 1995. Vol.14. Р.931-937.

31. Sibley K., Rollinson S., Allan J.M. et al. Functional FAS promoter polymorphisms are associated with increased risk of acute myeloid leukemia // Cancer Res. 2003. Vol.63. P.4327-4330.

32. Smith Kaleigh. Genetic Polymorphism and SNPs // Functional Genomics and Proteomics. 2002. Vol.14. Р.21.

33. Sun T., Zhou Y., Li H. et al. FASL -844C polymorphism is associated with increased activation-induced T cell death and risk of cervical cancer // J. of Experimental Medicine. Vol. 202, №7. P.967-974.

34. Ueda M., Terai Y., Hung Y.C. Fas gene promoter -670 polymorphism (A/G) is associated with cervical carcinogenesis // Gynecol. Oncol. 2005. Vol.98, №1. P.129-133.

35. Urquhart J. SNPs on display // Nano Letters. 2011. Vol.10. Р.1021.

36. Wang Meilin, Wu Dongmei, Tan Ming et al. FAS and FAS Ligand Polymorphisms in the Promoter Regions and Risk of Gastric Cancer in Southern China // Biochem. Genet. 2009. Vol.47. P.559-568.

37. Wasfi Y.S., Silveira L.J., Jonth A. et al. Fas promoter polymorphisms: genetic predisposition to sarcoidosis in African-Americans // Tissue Antigens. 2008. Vol.72, №1. P.39-48.

38. Yang Ming, Sun Tong, Wang Li et al. Functional Variants in Cell Death Pathway Genes and Risk of Pancreatic Cancer // Clin. Cancer Res. 2008. Vol.14, №10. P.3230-3236.

39. Zhang Zhizhong, Xue Hengchuan, Gong Weida et al. FAS promoter polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis based on 34 case-control studies // Carcinogenesis. 2009. Vol.30, №3 P.487-493.

40. Zhu Q., Wang T., Ren J. et al. FAS-670A/G polymorphism: A biomarker for the metastasis of nasopharyngeal carcinoma in a Chinese population // Clin. Chim. Acta.2010. Vol.411. P.179-183.

Размещено на Allbest.ru

...