Получение гексанового и ацетонового экстрактов из листьев черной смородины

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольная работа

Кузнецова А.А.



Введение

Цель работы: получение экстрактов листьев черной смородины в разных растворителех и изучение их качественного состава.

Задачи:

1. Получение гексанового и ацетонового экстрактов из листьев черной смородины

2. Поиск литературы по теме магистерской диссертации

3. Освоение методик эксперимента: определение восстанавливающей способности экстрактов.

4. Проведение спектрофотометрических измерений

5. Сбор литературы к обзорной статье, подготовка обзорной статьи

Изучение биологически активных веществ растительного сырья и получаемых на его основе экстрактов и фитопрепаратов в настоящее время является крайне актуальным. Известна их способность предотвращения оксидантного стресса организма, а также перекисного окисления липидов в составе различных пищевых и косметических продуктов, что определяет эти вещества как антиоксиданты. Они обладают рядом преимуществ перед синтетическими аналогами, такими, как многофакторность и мягкость воздействия на организм, биосовместимость, отсутствие или незначительный побочный эффект, хорошая переносимость и др.

Помимо замедления окислительных процессов образования свободных радикалов в организме антиокислители, как и консервирующие вещества, предназначены для продления сроков хранения липидсодержащих продуктов питания и косметических и фармацевтических продуктов. Они прерывают реакцию самоокисления жиров, в результате контакта с кислородом, содержащимся в воздухе и в самом продукте. Добавление антиокислителей защищает жиры и жиросодержащие продукты от прогоркания, предохраняет фрукты и результат их переработки от потемнения, замедляет ферментативное окисление вина, пива и безалкогольных напитков. В результате сроки хранения увеличиваются в несколько раз. Таким образом, антиоксиданты не только значительно тормозят окисление пищевых продуктов в процессе хранения, но и одновременно служат действующим началом продуктов лечебно-профилактического назначения, что делает актуальным их применение в рецептурах широкого спектра продуктов.

Простейшая классификация основана на растворимости веществ в водной и липидной фазе и позволяет выделить две группы антиокислителей:

v гидрофильные (водорастворимые; например, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, цистеин);

v липофильные (жирорастворимые; токоферолы, ретинол, билирубин).

Выбор антиоксиданта, наиболее подходящего для защиты конкретных жиров и масел в данном технологическом процессе, осуществляется опытным путем.

Ранее в работах были приведены итоги изучения химического состава гидрофильной фракции из листьев и плодов черной смородины, что позволило качественно и количественно охарактеризовать такие биологически активные соединения, как полисахариды, аминокислоты, макро- и микроэлементы, а также фенолокислоты и флавоноиды. В качестве экстрагента был использован этиловый спирт, широко применяющийся для извлечения биологически активных веществ из растительных материалов.

Для экстракции липофильных биологически активных веществ обычно используют органические растворители: хлороформ, гексан, диэтиловый эфир и т.д. С целью экстракции неполярных биологически активных веществ из листьев черной смороднины использовали гексан и ацетон.

Гексан - бесцветная, прозрачная, подвижная, легковоспламеняющаяся жидкость со слабым запахом. Практически не смешивается с водой, хорошо растворим во многих органических растворителях. Температура плавления -95,34 °C , кипит при 68,742 °C. При 20 ⁰С - плотность с = 0,65937 г/см³, диэлектрическая проницаемость е = 1,89.

Ацетон - подвижная, бесцветная, легколетучая жидкость с сильным запахом. Смешивается с водой, спиртом, бензином и другими растворителями в любой пропорции. Температура плавления: ?95 °C. Температура кипения 56°С. Температура вспышки 17°С. При 20 ⁰С - плотность с = 0.79079 г/см³, диэлектрическая проницаемость е = 20.70.

В последнее время черная смородина особенно привлекает внимание ученых в связи с высоким уровнем накопления в плодах антоцианов, значимость которых для лечения и профилактики заболеваний зрительного аппарата общепризнанна.

Листья содержат эфирные масла, в состав которых входят б-пинен, 1- и d-сабинен, d-кариофиллен; терпеновый спирт, фенолы витамин С, дубильные вещества, флавоноиды, органические кислоты, соли железа, калия, фосфора, марганца, йода, кальция, магния. Установлено, что в 100 г свежих листьев содержатся следующие количества фенольных соединений (в мг): флавонолов - 980-2700, катехинов - 574-3320, лейкоантоцианов - 504-1320, аскорбиновой кислоты - 260,1-310,5

Следует отметить, что в настоящее время большее внимание уделяется накоплению различных БАВ в плодах смородины, данные же относительно состава листьев смородины представлены не столь широко.



I. Приготовление и исследование густых экстрактов шиповника

1. Сырье

Для приготовления экстрактов были использованы сухие листья черной смородины, собранные в мае 2012 г. Сушили сырьё при комнатной температуре без доступа солнечного света.

2. Методика приготовления гексанового и ацетонового экстракта листьев черной смородины

Масса листьев для одного экстракта = 30,00 г.

Навеска измельченных листьев черной смородины (1 мм) помещалась в стеклянную емкость, после чего заливалась растворителем так, чтобы уровень растворителя был выше уровня сырья примерно на 1 см. Далее емкость плотно закрывали крышкой и помещали в темное место. Через три дня вытяжку сливали, а листья заливали новой порцией растворителя. Таким образом, было получено по 5 вытяжек каждого растворителя.

Процесс выделения основан на сходстве выделяемого компонента с растворителем: при пропускании последнего через смесь он «захватывает» с собой нужное вещество и выводит его из системы. Таким образом, на выходе получается смесь экстрагируемого вещества с растворителем, следовательно, в этой смеси не должно происходить никаких химических реакций (компоненты должны быть инертны друг к другу, наличие примесей в растворителе также может привести к нежелательным изменениям). Дальнейшее разделение основано на испарении растворителя, желательно использовать низкокипящие растворители, чтобы избежать термического разложения экстрагируемого вещества. Экстрагируемый компонент концентрируется в емкости для растворителя. Достоинство этого метода экстракции в том, что с навеской постоянно контактирует чистый растворитель, который не подвергается нагреванию. Нагревание в данном случае может привести к разложению экстрагируемых веществ. Однако этот метод требует больших временных затрат.

Окончание процесса обезжиривания определяли по празрачности растворителя, который сливали после отстаивания.

Масса листьев после экстракции: листья экстрагируемые ацетоном: m = 25,27г; листья экстрагируемые гексаном: m = 27,75 г.

3. УФ-спектрофотометрия экстрактов черной смородины

Для количественного определения БАВ в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия.

Они имеют ряд существенных преимуществ по сравнению, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных БАВ из растительного сырья.

Исследование качественного состава экстрактов черной смородины проводили спектрофотометрическим методом.

Спектрофотометрический метод основан на способности БАВ поглощать свет в определенной области спектра.

Спектры оптического поглощения экстрактивных вытяжек регистрировали на спектрофотометре VARIAN Cory 50 cons при комнатной температуре в диапазоне длин волн 220-800 нм. Раствором сравнения служили ацетон, этиловый спирт и гексан.

· Приготовления гексанового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:

Навеску гексанового экстракта помещали в пенициллинку и заливали 3 мл гексана. Тщательно перемешивали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл гексана. Концентрацию окрашенных экстрактов проводим по формуле:

· Приготовления ацетонового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:

Навеску гексанового экстракта 0,0095 г разбавили 3 мл ацетона. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл ацетона.

· Приготовления спиртового раствора гексанового экстракта листьев черной смородины:

Навеску гексанового экстракта 0,01 г разбавили 3 мл спирта. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл спирта.



Рис. 1 Спекты гексанового экстракта листьев черной смородины в различных растворителях.

· Приготовления гексанового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:

Навеску ацетонового экстракта помещали в пенициллинку и заливали 3 мл гексана. Тщательно перемешивали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл гексана. Концентрацию окрашенных экстрактов проводим по формуле:

Приготовления ацетонового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:

Навеску ацетонового экстракта 0,0095 г разбавили 3 мл ацетона. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл ацетона.

·

·

·

·

· Приготовления спиртового раствора ацетонового экстракта листьев черной смородины:

Навеску ацетонового экстракта 0,01 г разбавили 3 мл спирта. Тщательно перемешали до полного растворения. Из полученного раствора дозатором отобрали 100 мкл и разбавили 5 мл спирта.



Рис. 2 Спекты ацетонового экстракта листьев черной смородины в различных растворителях.

ацетоновый экстракт смородина гексановый

Полоса поглощения в УФ спектре при 450 нм, характерная для в-каротина присутствует в УФ спектрах гексанового экстракта.

4. Количественный анализ густых экстрактов

Методика определения содержания хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов. Количественное определение пигментов основано на их способности к поглощению лучей определенной длины волны. Регистрацию оптической плотности раствора пигментов проводят на спектрофотометре. При использовании спектрофотометрии для определения концентрации хлорофилла a и b в растворе без их разделения вопрос осложняется тем, что спектры хлорофиллов a и b сильно перекрываются и невозможно найти две длины волны, в которых поглощение обуславливалось бы полностью одним пигментом. Однако имеющиеся различия в спектрах поглощения обоих хлорофиллов все же позволяют выбрать точки, где поглощение одного пигмента заметно превышает поглощение другого. Это обстоятельство и используется при проведении количественного определения хлорофилла a и b без их разделения. Концентрацию хлорофилла a и b в вытяжке рассчитывают по формуле Вернона:

В 100 %-ном ацетоне:

C_a(мг/л) = 9,784•D₆₆₂ - 0,990•D₆₄₄, (3.1)

C_b(мг/л) = 21,426•D₆₄₄ - 4,650•D₆₆₂; (3.2)

Для определения концентрации каротиноидов (мг/л) в суммарной вытяжке пигментов может быть использована формула Веттштейна:

С_кар = 4,695•D_440,5 - 0,268(C_a+b), [45] (3.3)

Поскольку у нас имеются экспериментальные данные значений оптической плотности густого экстракта в 100%-ном ацетоне при длине волны 662 и 664 нм, то мы можем воспользоваться данным методом:

Ацетоновый экстракт:

C_a = 9,784• 0,07854- 0,990• 0,02197= 0,7467 (мг/л),

C_b= 21,426•0,02197- 4,650•0,07854= 0,1055 (мг/л),

С_кар = 4,695•0,11036- 0,268(0,7467 +0,1055) = 0,2897 (мг/л);

Гексановый экстракт:

C_a = 9,784•0,02876- 0,990•0,006884 = 0,2746 (мг/л),

C_b= 21,426•0,006884 - 4,650•0,02876= 0,01376 (мг/л),

С_кар = 4,695•0,05139- 0,268(0,2746 +0,01376) = 0,16399 (мг/л);

Установив концентрацию пигментов в вытяжке, определяли их содержание в исследуемом материале с учетом объема вытяжки и навески пробы:

A = V•C/(P•1000), (3.4)



где С - концентрация пигментов в мг/л; V - объем вытяжки в мл; P - навеска экстракта в г; А - содержание пигмента в растительном материале в мг/г экстракта.

Ацетоновый экстракт:

A_a = 8•0,7467 /(0,00323•1000) = 1,849 мг/г,

A_b = 8•0,1055 /(0,00323•1000) = 0,261 мг/г,

А_кар =8•0,2897 /(0,00323•1000) = 0,718 мг/г.

Гексановый экстракт:

A_a = 8•0,2746 /(0,0035•1000) = 0,628 мг/г,

A_b = 8•0,01376 /(0,0035•1000) = 0,0315 мг/г,

А_кар =8•0,16399 /(0,0035•1000) = 0,375 мг/г.

Таким образом, мы установили, что в 1 г ацетонового экстракта содержится 1,849 мг хлорофилла а, 0,261 мг хлорофилла b и 0,718 мг каротиноидов, а в 1 г гексанового экстракта - 0,628 мг хлорофилла а, 0,0315 мг хлорофилла b и 0,375 мг каротиноидов. Таким образом, можно сделать вывод, что ацетон обладает большим экстрагирующим действием, нежели гексан.

Методика определения суммарного содержания каротиноидов в пересчете на в-каротин.

Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют гексан. Содержание суммы каротиноидов (Х) в мг% в пересчете на в-каротин и абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; V - объем раствора, мл (100 мл); m - масса сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %; 2592 - удельный показатель поглощения 1% 1см E в-каротина при длине волны 450 нм в гексане.

Гексановый экстракт

мг%

Ацетоновый экстракт

мг%

Определение массовой доли каротина.

Раствор перемешать и колориметрировать на спектрофотометре при длине волны 450 им в кювете с рабочей длиной 10 мм. Параллельно измерить оптическую плотность раствора стандартного образца -- дихромата калия. В качестве раствора сравнения использовать экстрагент (соответственно гексан).

Содержание каротиноидов в пересчете на в-каротин (X_кар, мкг%) вычислить по формуле

где D - оптическая плотность исследуемого раствора;

D₀ - оптическая плотность раствора стандартного образца;

0,0208 -- количество в-каротина, соответствующие по окраске 1 мл стандартного раствора калия дихромата, мкг;

V-- объем экстракта, мл; 0,053643968

m - масса навески, г;

100--коэффициент пересчета в проценты

Гексановый экстракт

1,567 мг%

Ацетоновый экстракт

мг%

5. Определение восстанавливающей способности экстрактов

Цель работы: определить содержание йода в контрольном растворе с применением титрованного раствора тиосульфата натрия.

Посуда и реактивы:

Бюретка вместимостью 25 см³.

Конические колбы для титрования вместимостью 100 см³ -2 шт.

Мерный цилиндр вместимостью 50 см³. Химический стакан вместимостью 100 см3. Воронка диаметром 3 см. Часовое или покровное стекло. Экран для титрования.

Титрованный раствор тиосульфата натрия с установленной концентрацией. Раствор крахмала с массовой долей 1 %.

Порядок выполнения работы

Анализ. В колбу для титрования добавляют 10 см³ дистиллированной воды добавляют 2 см³ раствора серной кислоты, и прибавляют контрольный раствор йода в количестве 4 мл. Раствор немедленно титруют стандартизированным раствором тиосульфата натрия до перехода бурой окраски в светло-желтую. Добавляют 1 мл раствора крахмала, содержимое колбы окрашивается в синий цвет, титрование продолжают до обесцвечивания раствора от одной капли титранта. Титрование проводят не менее двух раз.

Количественное определение аскорбиновой кислоты основано на ее восстановительных свойствах. При взаимодействии с йодом она окисляется до дегидроаскорбиновой кислоты:



Для определения аскорбиновой кислоты применяют метод обратного титрования: к анализируемой пробе добавляют избыток йода, остаток не вступившего в реакцию с аскорбиновой кислотой йода титруют раствором тиосульфата натрия.

Цель работы: определить аскорбиновую кислоту в растворе.

Приборы, посуда и реактивы

Бюретка вместимостью 25 или 50 см³. Конические колбы для титрования вместимостью 100 см³ -2 шт.

Мерные цилиндры вместимостью 10 и 20 см³ - по 1 шт. Воронка диаметром 3 см. Часовое или покровное стекло. Промывалка с дистиллированной водой. Раствор серной кислоты, c(l/2H₂SO₄) = 6,0 моль/дм³. Раствор йода, с(1/2I₂) = 0,0034 моль/дм³. Раствор крахмала с массовой долей 1 %. Стандартизированный раствор тиосульфата натрия, c(l/lNa₂S₂0₃) = 0,001 моль/дм3.

Порядок выполнения работы

В колбу для титрования помешают 10,00 см³ дистиллированной воды, добавляют 2 см³ раствора серной кислоты и 1 мл раствора аскорбиновой кислоты (0,0001г/мл) вводят 4,00 см³ раствора йода, колбу прикрывают стеклом. В течение 5 мин аскорбиновая кислота окисляется, затем избыток йода оттитровывают раствором тиосульфата натрия до перехода бурой окраски в светло-желтую. Добавляют раствор крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания раствора. Выполняют два титрования.

Цель работы: определить восстанавливающую способность экстракта.

Приборы, посуда и реактивы

Бюретка вместимостью 25 или 50 см³. Конические колбы для титрования вместимостью 100 см³ -2 шт.

Мерные цилиндры вместимостью 10 и 20 см³ - по 1 шт. Воронка диаметром 3 см. Часовое или покровное стекло. Промывалка с дистиллированной водой. Раствор серной кислоты, c(l/2H₂SO₄) = 6,0 моль/дм³. Раствор йода, с(1/2I₂) = 0,0034 моль/дм³. Раствор крахмала с массовой долей 1 %. Стандартизированный раствор тиосульфата натрия, c(l/lNa₂S₂0₃) = 0,001 моль/дм3.

Порядок выполнения работы

В колбу для титрования помешают 10,00 см³ дистиллированной воды, добавляют 2 см³ раствора серной кислоты и 1 мл спиртового раствора экстрактов (0,003 г/мл) вводят 4,00 см³ раствора йода, колбу прикрывают стеклом. В течение 5 мин аскорбиновая кислота окисляется, затем избыток йода оттитровывают раствором тиосульфата натрия до перехода бурой окраски в светло-желтую. Добавляют раствор крахмала и продолжают титрование до обесцвечивания раствора. Выполняют два титрования. Рассчитывают средний объем титранта, затраченный на титрование.

Результаты:

Объем Na₂S₂0₃ затраченный на титрование контрольной пробы V₀=17,91мл

Объем Na₂S₂0₃ затраченный на титрование пробы с АК V_АК=12,56 мл

Объем Na₂S₂0₃ затраченный на титрование пробы с 1 мл спиртового раствора ацетонового экстракта черной смородиныV_Ац=9,11 мл

Объем Na₂S₂0₃ затраченный на титрование пробы с 1 мл спиртового раствора гексанового экстракта черной смородиныV_Гек=9,83 мл

По полученным данным можно предположить, что спиртовые растворы экстрактов обладают восстанавливающей способностью, поскольку объем тиосульфата натрия, пошедший на оттитровывание йода в растворах, содержащих экстракт меньше, чем в контрольной пробе. Таким образом, результаты подтверждают, что вещества, содержащиеся в экстракте восстанавливают йод в растворе, а следовательно, являются восстановителями и могут рассматриваться как антиоксиданты.

Размещено на Allbest.ru

...