Бактеріальні хвороби плодових культур Закарпатської області

2) збудники термолабільні як в рослині, так і в переноснику і підвищенням температури можна добитися їх атенуації;

3) інокуляція соком хворої рослини стерильною особини комахи переносника призводить до зараження останнього, при цьому в тканини переносника з'являються частинки, що перевершують за розмірами відомі віруси[10].

Фітопатогенні представники виявляються в трьох родинах мікоплазм: Acholeplasma, Mycoplasma, Spiroplasma.

В даний час відомо більше 200 видів рослин з 59 родин, що вражаються мікоплазмами. Спільним для цих захворювань є поширення їх в зонах з помірним і теплим кліматом, сприятливим розвитку сисних комах - основних переносників. Найбільш шкідливими мікоплазмоз вважаються мікоплазмоз пшениці, пасльонових, винограду та деяких деревних культур. Мікоплазмоз відносяться до захворювань катастрофічним, часто приймають характер епіфітотій. Урожай пшениці може знижуватися на 80-90%, томатів - на 25-35%, картоплі - до 20% [14].

При заселенні мікоплазмами провідної системи рослин і виділення ними продуктів життєдіяльності зазвичай відбувається посилене утворення дегенеративних клітин флоеми, в результаті хворі рослини стають карликовими, жовтушними і в'януть. Відомі й прямо протилежні випадки - айстри і тютюн, заражені мікоплазмами, живуть набагато довше, так як у них затримується початок репродукції рослин. Зазвичай в уражених мікоплазмами рослинах порушуються процеси регуляції росту і змінюється габітус - утворюються в надлишку додаткові бруньки і пагони, порушується домінування верхівки. Рослини набувають вигляду «відьминої мітли» через утворення додаткових бічних пагонів. У них зменшується розмір міжвузлів (карликовість), листя, змінюються генеративні органи, що призводить до безпліддя. Після ураження припиняється плодоношення [12].

Першими ознаками жовтухи є просвітлення судин інфікованого листка, який поступово втрачає зелене забарвлення, процес пожовтіння поширюється і на інші листки, тобто жовтуха - системне захворювання.

З 40 найбільш відомих мікоплазмозів пасльонових самими шкідливими вважаються «відьмині мітли» картоплі та столбур томатів. В уражених рослин картоплі утворюється безліч тонких стебел, дрібних бульб, які проростають розгалуженими пагонами. Мікоплазми виявляються у флоемі і ситовидних трубках стебел і листя. При столбурі томатів через 20-30 діб після інфікування листя стає хлоротичними, краї їх піднімаються. Мікоплазми зазвичай виявляються в ситовидних трубках, вкрай рідко в клітинах мезофілла або кореня. Кількість клітин мікоплазм в одній рослинної досягає 100 [10].

Найбільш простим способом діагностики мікроплазмозів є обробка хворих рослин антибіотиками тетрациклінового ряду. Якщо після такої обробки рослина одужує, то роблять висновок про мікоплазменну природу захворювання. Для рослин, що знаходяться на останніх стадіях вегетації, такий спосіб є неефективним. У даному випадку можливе використання електронної мікроскопії або інших мікроскопічних методів з подальшим фарбуванням зрізів.

У зв'язку з тим, що мікоплазми дуже важко культивуються і виділяються в чисту культуру, для доведення їх патогенних властивостей використовують наступний прийом: соком хворих рослин заражають стерильних комах-переносників, а потім згодовують їм здорові рослини. Оскільки різні збудники можуть індукувати на рослинах подібні симптоми, для ідентифікації можуть використовуватися і індикаторні рослини. В якості таких індикаторних рослин використовуються барвінок, певні сорти томатів, тютюну та ін. Різні форми захворювань проявляються на індикаторних рослинах по-різному, залежно від видової приналежності збудника [11].

При визначенні видової приналежності мікоплазм використовують серологічні методи, а також методи, засновані на дослідженні їх унікальних властивостей: потреби в стеринах, здатності до гідролізу сечовини, синтезу каротиноїдів.

Мікоплазми можуть мати як специфічних, так і неспецифічних хазяїв. При дослідженні особливостей їх поведінки і в тих, і в інших, виявилося, що розмноження і зростання відбувається по-різному в клітинах специфічних або неспецифічних хазяїв. Звичайним місцем їх проживання є ситовидні елементи флоеми хворих рослин. Кількість клітин мікоплазм коливається від кількох до повного заповнення об'єму рослинної клітини. Часто мікоплазми розташовуються вздовж цитоплазматичної мембрани [10].

Ймовірно, за ступенем прояву такого симптому як хлоротичність листя і визначається кількістю клітин мікоплазм. Коли їх небагато, то транспорт пластичних речовин відбувається відносно нормально, якщо мікоплазм багато, то закупорюються судини і хлоротичність листя виражена сильніше [11].

На специфічних рослинах-господарях взаємодія мікоплазм з їх клітинами відбувається в три етапи:

1-ий етап. Проникнення мікоплазм в молоді паренхіматозні клітини флоеми, де вони взаємодіють з мембранними елементами клітини. Реакція клітини-господаря проявляється в утворенні окремих виростів мембрани, спрямованих у бік клітин мікоплазм. Мембранні структури рослинних клітин розбухають і зливаються з мембранними структурами мікоплазм.

2-й етап. Подальший розвиток інфекції характеризується порушенням нормального метаболізму рослинної клітини. На 3-4 добу цитоплазма інфікованих молодих клітин темніє від насичення рибосомами і полісомії, що свідчить про посилення метаболізму уражених клітин.

3-й етап. У хлоропластах міститься підвищена кількість крохмалю, що призводить до розвитку хлорозу і руйнування клітин [10].

У клітинах неспецифічних рослин-господарів подібні явища не спостерігаються, мікоплазми в таких клітинах не виявляють тропізму до мембран рослинних клітин. Передбачається, що при адсорбції на мембранних елементах клітин-господарів мікоплазми отримують можливість брати з них необхідні живильні субстрати (жирні кислоти, холестерин) [14].

Вважається, що основні чинники патогенності у більшості мікоплазм ті ж, що і у інших бактерій, за винятком тих, які визначаються наявністю клітинної стінки. До числа найбільш часто зустрічаються у мікоплазм факторів патогенності можна віднести продукцію фітотоксинів і ферментів. Spiroplasma citri утворює два типи токсинів, які викликають в'янення рослин і затримують проростання насіння. Одним з факторів патогенності можна також вважати конкуренцію мікоплазм з рослинами-господарями за певні продукти метаболізму (цукру, амінокислоти) [6].

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Рослинний матеріал для досліджень відбирали у багаторічних насадженнях Закарпатської області протягом 2010 - 2014 рр. Відбір зразків із симптомами бактеріального ураження органів дерев проводили в різні періоди вегетації - навесні (період цвітіння), влітку (інтенсивний ріст пагонів) та восени.

Виділення патогена. Висновок про природу патогена не можна зробити виходячи тільки з симптомів захворювання. Одні й ті ж або подібні симптоми можуть бути викликані видами мікроорганізмів, які часто дуже далекі один від одного в систематичному відношенні. Майже однотипні симптоми спостерігаються, наприклад, при бактеріозах квасолі, викликаних трьома різними організмами (Р.phaseolicola, Х.phaseoli і Х.рhаseolivar. fuscans). При встановленні діагнозу хвороби недостатньо одного лише уявлення про характер її симптомів. Для цього необхідно виділити і ідентифікувати збудника, і переконатися в патогенних властивостях ізольованої культури [19].

Найбільш доцільно дотримуватись постулатів Коха, які з невеликими змінами можуть бути використані при вивченні фітопатогепних мікроорганізмів.

1. Встановити наявність бактерії в ураженій тканині рослини після її мікроскопування.

2. Виділити бактерії в чисту культуру.

3. Провести зараження сприйнятливої рослини-хазяїна з метою одержання вихідних симптомів.

4. Реізолювати бактерії з інокульованої тканини.

5. Порівняти вихідну і реізольовану бактеріальну культури і ідентифікувати бактерії.

При зборі зараженого матеріалу необхідно вжити заходів для подальшого успішного виділення бактерій. З практики добре відомо, що рослини, взяті з полів для дослідження причини їх захворювання, зазвичай сильно вражені. Виділення патогена з таких рослин досить складне або взагалі неможливе через заселення їх тканин вторинною сапрофітною мікрофлорою. Бактерії можна виділити значно успішніше зі свіжого рослинного матеріалу, на якому є первинні симптоми ураження. Мішечки з пластику непридатні для транспортування і зберігання уражених матеріалів через небезпеку розмноження в закритому і вологому середовищі постійно присутніх на матеріалі сапрофітів. Сухий матеріал більш придатний для виділення збудника, ніж вологий. Зразка для лабораторних досліджень слід перевозити і зберігати між двома шарами паперу [19].

У процесі вивчення уражених листків не рекомендується використовувати хімічні засоби для їх поверхневої стерилізації, так як ці речовини можуть легко дифундувати в тканині листа і вбити бактеріальні клітини. Для поверхневої дезінфекції матеріалу найбільш підходящим є розчин гіпохлоріта або іншого дезінфектанта. Найбільш поширений метод занурення матеріалу в 0,5 %-вий розчин хлорокса (Nа-гіпохлорита, розчин 1:9) на 2 хвилини, після чого матеріал ретельно промивають дистильованою водою і продовжують вивчення. При дослідженні листя найкраще промити їх поверхню проточною водопровідною водою.

Процес виділення збудника хвороби з листя полягає в наступному: частини ураженого листка разом зі здоровою тканиною вирізають стерильним ножем і поміщають на поверхню передметного скла, попередньо простерилізованого в полум'ї горілки. На поверхню предметного скла наносять одну краплю стерильної водопровідної або пептонної води і гострою бритвою роблять кілька зрізів листа в області ураження. Через 1-2 хв. бактерії почнуть дифундувати з ураженої тканини в пептонну воду. Препарат покривають покривним склом і вивчають під мікроскопом при збільшенні не менше 400 разів. Найкраще працювати із збільшенням 800-1500 разів [19].

На місці зрізу можна спостерігати невелику хмарку бактерій, що дифундують з пораженої тканини в зовнішнє середовище. Для їх детального розгляду можна використовувати масляну іммерсію або фазовий контраст. Опис цих методів можна знайти в будь-якому керівництві по мікробіології.

Можливість використовувати зрізи особливо важлива при вивченні уражень судинних пучків, захворювань стебла і провідних судин, коли досліджують ту частину, на якій помітні первісні симптоми захворювання. Уражені стебла ріжуть на частини довжиною 3-4 см, розщеплюють в довжину, і судинні пучки мацеруються. З більш мясистих стебел, коріння або бульб бактерії легко виділяють, здавивши пальцями уражені тканини так, щоб бактерії вийшли назовні разом з соком.

З пухлин і тканин ксилеми бактерії виділяють таким чином: невеликий шматочок ксилеми, промитої з поверхні, занурюють у спирт і підпалюють його. Спирт горить 1-2 сек., після чого поверхність стає стерильною. Для поверхневої стерилізації можна використовувати також 0,5%-вий розчин Хлорокса. Бактеріальний препарат з мацерованої знебарвленої тканини або живої тканини готовий для дослідження.

Аналогічні методи стерилізації та виділення патогена можуть бути використані при вивченні тих уражень, збудник яких знаходиться під насіннєвою оболонкою (наприклад, при захворюваннях квасолі). Якщо ж патоген поселяється па поверхні насіннєвої оболонки (при захворюваннях гороху або томатів), то проводити поверхневу стерилізацію не можна [19].

Мікроскопічне дослідження ураженої рослини.

Дослідження бактеріальних уражень рослин під микроскопом не дає достатньої інформації. Часто подібне вивчення рослинного матеріалу не дозволяє навіть визначити, чи є дане захворювання бактеріальним за походженням. Причина цього полягає в тому, що при такому дослідженні бактеріальні клітини часто можна сплутати з окремими клітинами рослини, зернами крохмалю і хлорофілу. Бактеріальні клітини, що містяться в рослині, часто не мають навіть тієї форми, яка притаманна їм при культивуванні на штучних поживних середовищах. Вони меншого розміру і неправильної палочковидної форми. Бактерії, що виявляються в препаратах зі старих плям виразки, втрачають свою рухливість. Значно легше вивчати бактерії з молодих уражених ділянок листка. На пізніх стадіях розвитку захворювання мікроскопічну картину дуже спотворює присутність сапрофітних мікроорганізмів, оскільки під мікроскопом їх неможливо відрізнити від фітопатогенних. Тому мікроскопічне дослідження служить лише для отримання загальної інформації про причину захворювання. Таке вивчення набуває значно важливіше значення при фарбуванні тканин, коли бактерії стають різко відмінними за забарвленням від здорових і уражених тканин рослини [16].

Мікроскопічне дослідження уражених тканин з використанням забарвлених зрізів (диференційне фарбування). При вивченні деяких зразків ураженого рослинного матеріалу, таких як стебло або шкірястий листок, зрізи можна приготувати, використовуючи гостру бритву. Тонкі зрізи готують з уражених тканин рослини, укладаючи їх між шматочками писушеної серцевини рослини бузини. Перед використанням край бритви змочують спиртом і отримані зрізи поміщають у воду. Метод диференційного фарбування по Стоутону:

1. Фарбування карболтіоніном 5 хв (0,1г тіоніна синього на 100мл 5%ного фенолу, що містить дистильовану воду).

2. Промивання у воді.

3. Перенесення в 95%-ний спирт.

4. Диференційне фарбування Оранжем G на протязі кількох хвилин. (Оранж G розчинений в абсолютному спирті.)

5. Промивання тканин абсолютним спиртом [19].

6. Після перенесення в ксилол зріз накривають покривним склом і поміщують в бальзам.

У готовому забарвленому препараті бактеріальніклітини темно-синього кольору, стінки клітин целюлози - жовті або зелені, лігніфіковані тканини - світло-сині [19].

Отримання чистих культур. Виділення патогeнів проводять на щільних середовищах. Після розливу їх і застигання в чашках Петрі чашки слід деякий час підсушити перед посівом бактерій. Це сприяє виділенню конденсаційної вологи, яка осідає на поверхні середовищ. Ці краплі конденсату не дають можливості отримати ізольовані колонії, так як бактерії плавають в них. Поверхня чашок Петрі з агаром підсушується 30 хв. при 50°С. Металевою петлею бактерії наносять штрихом на поверхню агару в чашках. На стерильному предметному склі готують суспепзію бактерій із заражених рослинних тканин.

Для отримання ізольованих колоній бактеріальну суспензію найкраще наносити штрихом. Спочатку петлю занурюють у суспензії бактерій і на поверхні чашки Петрі зліва направо наносять 5 штрихів. Потім петлю вносять в помум'я пальника і, повернувши чашку на 90°, роблять справа на ліво ще 5 штрихів. Потім чашку знову повертають праворуч на 90° і роблять штрихи справа наліво. При цьому досягається таке розведення суспензії, при якому виростають окремі колонії бактерій. Після 48-72год інкубації при 28°С різні типи колоній переносять в пробірки зі скошеним агаром. При вивченні бактеріальних культур, ізольованих з уражених рослинних тканин, звичайно досліджують морфологію клітин і колоній, біохімічні і патологічні методи [19].

Ідентифікація патогенна. Через морфологічні особливості бактерій для їх вивчення не завжди можуть бути використані методи, що застосовуються в мікології. Оскільки визначення грибів і вищих рослин основане на їх морфолог них ознаках, незначні морфологічні відмінності між окремими видами бактерій роблять можливим використанням цих же методів у мікробіoлогії. Деякі фітопатогенні бактерії настільки схожі, що їх не можна розрізнити, використовуючи тільки класичні методи ідентифікації. Для визначення патогенних бактерій використовують наступні критерії:

1) тест на патотснность для відбору патогенного ізолята;

2) вивчення морфології бактеріальної клітини і колонії;

3) визначення фізіологічних і біохімічних властивостей бактерій;

4) дослідження патогенності для визначення кола господарів [8].

Тест на патогенність для відбору патогенного ізолята. Найкраще спочатку виконати просте і швидке дослідження патогенності бактерій, так як згодом потрібно вивчати біохімію лише тих культур, патогенність яких доведена. Визначити патогенність культури можна протягом 24год, використовуючи метод інфікації Клемента. Він грунтується на реакції надчутливості рослин.

Культури бактерій, отримані після ізоляції, беруться з чашок і суспендується в стерильній водопровідній воді. Число бактеріальних клітин в 1мл такої суспензії, яке визначається за показником оптичної щільності, має становити 10^7-8. Шприцом суспензію вводять в міжклітинний простір здорового невідділеного листка тютюну. Цей метод дозволяє вводити кілька суспензій в різні ділянки одного і того ж листа тютюну.

Оскільки некрози або інші симптоми ураження на тютюні можуть викликатися тільки фітопатогенними бактеріями (не сапрофітами), то цей метод можна застосувати для швидкого відбору патогенного ізолята. Вивчати слід лише той ізолят, який індукує некрози на індикаторній рослині [19].

Зберігання бактеріальних культур. Зазвичай фітопатогенні бактерії зберігають свою вірулентність в лабораторних умовах тривалий час, але деякі види втрачають життєздатність відносно швидко. Псевдомонади залишаються життєздатними протягом багатьох місяців без пересіву, в той час як ксантомонади гинуть протягом 1-2 тижнів при рості на звичайних і використовуваних бактеріальних середовищах [19].

Методика діагностики опіку плодових Erwinia amylovora. Прискорена діагностика опіку плодових Erwinia amylovora.

1. Стерильним скальпелем на межі ураженої і здорової кори роблять зрізи, добре подрібнюють і кладуть 1 грам в пробірку з 10 мл фізрозчину, який містить 5% сахарози;

2. Ставлять в термостат на 1 годину;

3. Частину приготовленої суміші кип'ятять протягом 30 хвилин;

4. Охолоджують і відбирають 1 мл екстракту, добавляють 0,5 мл нор-мальної кролячої сироватки;

5. Витримують в термостаті протягом 30 хв. при температурі 37°С і центрифугують 5 хв. при 3000 обертів.

6. В преципітаційні пробірки вносять: в одну 0,25 мл нормальної, в другу - 0,25 мл імунної до Е. amylovora сироватки крові кролика;

7. Із центрифугату обережно набирають надосадову рідину пастерівсь-кою піпеткою і обережно нашаровують її спочатку на поверхню нормальної, а потім імунної сироватки в преципітаційних пробірках. Облік реакції проводять через 30 хв., 2 години, 4 години (рис 2.1) [8].

Б) Зараження незрілих плодів груші чутливих сортів до Erwinia amylovora екстрактом з кори зразків: з некип'яченого екстракту, підготов-леного раніше для реакції кільцепреципітації, шприцом відбирають 0,5 мл рідини, нею інфікують попередньо вимиті і протерті 5% розчином перекису водню плоди груші і ставлять їх у вологу камеру при температурі 27°С. Облік проводять через 24,48 і 72 години.

В) Виділення бактерій на середовища:

З цього ж екстракту роблять висів бактерій на середовище Кінга та картопляний агар з дріжджовим екстрактом. Облік проводять через 24, 36,48 годин[4].

Другий день:

При наявності на середовищі Кінга нефлюорисцируючих слизистих колоній проводять їх відбір і сіють на селективні середовища Б3 та Кросса і Гурмана.

Облік характеру росту проводять через 24, 48, 60 годин. Колонії Erwinia amylovora на середовищі 03 мають оранжеве забарвлення, колонії інших видів набувають голубого або зеленого кольору.

На середовищі Кроса і Гудмана бактерії Erwinia amylovora утворюють колонії з кратероподібним заглибленням по середині, що добре спостерігається під мікроскопом при збільшенні 15х або 30" [8].

Склад поживних середовищ для ізоляції та ідентифікації

Картопляний агар з дріжджовим екстрактом

Картопля - 200 г

Агар-агар - 20 г

Дріжджовий екстракт - 10 мл

Водопровідна вода - 1000 мл

рН - 7,0 [8].

Розділ 3. Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження проводились на базі Закарпатського територіального відділу карантину рослин УЗР УААН та кафедрі генетики, фізіології рослин і мікробіології ДВНЗ «УжНУ».

Для визначення основних бактеріальних захворювань плодових рослин, які є небезпечними на даний період в Закарпатській області, були використані дані по виявленню карантинних бактеріальних хвороб в регіоні за 2007-2013 рр. та проаналізовані результати маршрутних обстежень, здійснювані спільно з співробітниками Закарпатського територіального відділу карантину рослин УЗР УААН (таблиця 3.1.).

Обстеженню підлягали насадження зерняткових, кісточкових плодових дерев, а також декоративних та дикорослих культур (глід, кизил, горобина, троянда, спірея, керія та ін). Особливо важливе значення мають обстеження розсадників, де вирощується посадковий і прищепний матеріал, до початку реалізації із них продукції. Проводився огляд вибірково в плодових та декоративних насадженнях регіону. Обстеження проводились у три строки:

1-ранньовесняний (період розпускання бруньок і цвітіння),

2-літній (період інтенсивного росту дерев),

3-осінній (період посиленого сокоруху).

У весняний період проводили суцільне обстеження, де оглядали кожне дерево. Влітку і восени обстеження проводили вибірково, оглядаючи кожне десяте дерево. Звертали увагу на дерева, які пригнічені і висихають, мають пошкоджені квіти, кору та інші ознаки, які характерні для бактеріозів, що визначаються як карантинні.

Таблиця 3.1. Обстеження плодових культур на виявлення карантинних бактеріальних захворювань в Закарпатській області(2007-2013рр.)

№ п/п	Дата	Місце обстеження	Культура	Результат
Ужгородський р-н
1	26.07.2007	с. Сторожниця	Яблуня	Еrwinia аmуlovora
2	26.07.2007	с. Сторожниця	Груша	Е. аmуlovora
3	26.07.2007	с. Малі Геївці	Груша	P. agolovera
4	26.07.2008	с. Червоне	Груша	Е. аmуlovora
5	18.08.2008	с. Червоне	Груша	Е. аmуlovora
6	18.08.2008	с. Червоне	Айва	-
7	08.04.2009	с. Селенці	Груша	Е. аmуlovora
8	23.05.2009	с. Нижнє Солотвино	Абрикос	Е. аmуlovora
9	05.06.2009	с. Селенці	Груша	Е. аmуlovora
10	24.07.2009	м. Ужгород	Абрикос	-
11	03.06.2010	с. Червоне	Айва	-
12	20.06.2010	с. Оноківці	Слива	Xanthomonas arboricola
13	10.07.2010	с. Сторожниця	Яблуня	Е. аmуlovora
14	05.04.2011	м. Ужгород	Груша	-
15	30.08.2011	с. Оноківці	Яблуня	-
16	27.09.2011	с. Мала Добронь	Яблуня	-
Мукачівський р-н
17	01.07.2009	с. Страбичово	Груша	Е. аmуlovora
18	01.07.2009	с. Ракошино	Груша	Е. аmуlovora
19	03.06.2010	с. Страбичово (на 2-х ділян-х)	Груша	Е. аmуlovora
20	24.06.2010	с. Великі Лучки	Яблуня	Е. аmуlovora
21	27.09.2011	с. Страбичово	Груша	-
Берегівський р-н
22	31.07.2007	с. Гать	Яблуня	-
23	26.06.2008	с. Бовтрадь	Айва	-
24	01.07.2009	с. Батєво	Яблуня	-
25	20.07.2010	с. Гать	Яблуня	-
Виноградівський р-н
26	05.06.2009	с. Петрово	Груша	-
Воловецький р-н
27	28.06.2010	с. Нижні Ворота	Абрикос	-
28	05.06.2012	с.Ракошино, Мукачівський р-н	Груша	X. arboricola
29	25.06.2013	с.Гать, Берегівський р-н	Персик	X. arboricola
30	14.05.2013	с. Селенці, Ужгородський р-н	Айва	X. arboricola
31	14.05.2013	с. Селенці, Ужгородський р-н	Яблуня	Е. аmуlovora

Відповідно до статті 25 Закону України « Про карантин рослин» затверджено «Перелік регульованості шкідливих організмів (бактеріальні хвороби)». Серед них названі такі бактеріози:

1. Erwinia amylovora (Burrill) Winslowetal. - Бактеріальній опік плодових.

2. Xanthomonas arboricola pv. pruni (Smith) Vauterinetal. - Бактеріальна плямістісь листя кісточковіх

При виявленні підозрілих на зараженість дерев відбирали зразки для ідентифікації збудника. Для відбору зразка з ураженими квітками секатором зрізали верхню частину пагону довжиною біля 10 см. При ураженні листків чи одночасно квітів і листків на одній гілці зрізали пагін довжиною 15-20 см. При наявності виразок на корі гілок зрізали відрізки довжиною до 20 см. При ураженні скелетних гілок чи стовбура робили спили гілок або глибокий зріз кори. Відрізки гілок, пагонів і кори зрізали із захопленням здорових частин рослини таким чином, щоб добре була помітна межа між здоровою та ураженою тканиною. В залежності від уражених частин і ступеня ураження з одного дерева, по можливості відбирали 3-5 зразків із різних частин рослини. При переході від одного дерева до іншого інструменти дезинфікували 1%-ним формаліном або 10% розчином гіпохлорита натрію (хлорокс) протягом 2-х секунд. До кожного зразку додавалась етикетка, на якій пишеться назва дерева, сорту, вік, місце і час відбору з описанням ознак хвороби. Відібрані зразки пакувались окремо в папір. Не можна запаковувати в пергамент, кальку, целофан та поліетилен, оскільки це призводить до розвитку сапрофітних грибів, що утруднює виділення бактеріальної культури. Зразки були доставлені в карантинні лабораторії протягом двох днів, де і проводився аналіз зразків та ідентифікація збудника, і, по необхідності, проводилась повна бактеріологічна експертиза чи використовувалась прискорена діагностика.

Обстеження проводилися у квітні-травні - перед початком та у фазу цвітіння, в червні - в період швидкого росту пагонів та в середині липня - під час плодоношення.

Період цвітіння. Проводилося візуальне обстеження насаджень на початку цвітіння. Симптоми ураження бактеріальним опіком мали наступний характер: квітки в суцвіттях темніли, набуваючи спочатку коричневого, а потім чорного забарвлення, згодом всихало все суцвіття; уражені квітки не опадали, створюючи враження обпалених вогнем дерев. Найчастіше спочатку уражувались одна - дві квітки, від яких згодом інфекція передавалась на все суцвіття, що, ймовірно, обумовлювалось нерівномірністю розпускання квіток.

Період росту пагонів. У період інтенсивного росту молодих пагонів хвороба спостерігалися за такими симптомами: слабкі симптоми на листках, які темніли, та зелених плодах, що зморщувались і всихали; налиті рідиною молоді пагони, на корі яких спостерігався маслянистий слід від висохлого ексудату; зморщені та почорнілі, але не опалі уражені молоді плоди.

Період плодоношення. Під час фітопатологічного обстеження плодових насаджень в період плодоношення в липні на них були такі характерні симптоми бактеріального опіку - гачкоподібно зігнуті кінчики пагонів. Ззовні та на зрізах гілок уражена тканина чітко відмежовувалась від здорової.

Подальшої інтенсифікації розвитку хвороби відмічено не було.

Найбільш небезпечним на сьогоднішній час є опік плодових, який був вперше виявлений у Закарпатті в 2003р. Також зустрічається захворювання, збудником якого є Xanthomonas arboricola.

X. arboricola pv. pruni є аеробними, рухливими, грамнегативними, 0,2-0,8х0,8-1,7 мкм, з одним полярним джгутиком. Колонії вологі, блискучі, опуклі, слизисті і виробляють жовтий нерозчинний у воді пігмент.

Бактеріальна плямистість є важливою хворобою персика, нектарини, абрикоса, сливи, волоського горіха та інших. Симптоми цього захворювання включають плями на листках та фруктах, і виразки. На фруктах до симптомів включають виразки, тріщини, зміну тканини, яка може зробити плоди більш сприйнятливі до бурої гнилі та інших грибкових інфекцій. Важкі інфекції, плямистості листя може призвести до ранньої дефоліації. Важкі дефоліації можуть призвести до зниження розміру плодів і сонячних опіків та розтріскування плодів. Ранні дефоліації дерев знижують зимостійкість рослин.

Xanthomonas може заразити велику різноманітність видів, включаючи перець, рис, цитрусові, бавовну, помідори, сою. Деякі види Xanthomonas викликати локалізовані плямистості листя або смуги на листі, в той час як інші системно поширюватися і викликати чорна гниль або хвороби листя занепаду.

Симптоми захворювання, що викликається Xanthomonas arboricola включають плями на фруктах, плями на листі, і виразки. Симптоми на фруктах включають виразка, тріщин, гумування тканини, яка може зробити плоди більш сприйнятливі до бурої гнилі, Rhizopus та інших грибкових інфекцій. Важкі випадки плямистості листя може призвести до ранньої дефоліації.

На листках персика інфекція спочатку проявляється на нижній поверхні як маленькі, блідо-зелені до жовтого, круглої або нерівної форми плями з легким потемнінням в центрі. Ці плями незабаром стають дуже помітні на верхній поверхні, вони збільшуються і темнішають (в темно-фіолетові, коричневі або чорні). Безпосередньо навколишні тканини можуть стати жовтими. Хворі ділянки випадають зазвичай після потемніння, але вони можуть випадати до зміни кольору. Часто темне кільце ураженої тканини набуває форму «свердловини».

Бактеріальний опік плодових. Збудник: Erwinia amylovora. Карантинна хвороба розвивається більш ніж на 170-ти культурних та дикорослих видах рослин, більшість з яких належать до родини розових. Плодові культури по чутливості до опіку можна розмістити в такому порядку: груша, яблуня, айва, слива, абрикос, вишня, персик і т.д. Декоративні та дикорослі: кизил, глід, фотинія, піроканта, горобина, китайська айва, японська мушмула, спірея, керія, троянда. Існує виражена сортова різниця в чутливості до захворювання. Уражує майже всі плодові культури, а також глід, горобину й інші. В Україну хвороба потрапила з посадковим матеріалом, і на цей час зареєстрована в Закарпатській і Чернівецькій областях. Уражуються квіти, листки, пагони, гілки, стовбур, корінь, плоди.

Розвиток хвороби починається з верхньої частини дерева. Навесні, коли температура сягає +18°С, раптово починають в'янути й буріти суцвіття, листя та молоді пагони. Суцвіття й листя згодом чорніють, але не опадають. Характерна ознака хвороби -- верхня частина ушкодженої гілки вигинається у вигляді гачка. Недозрілі плоди теж в'януть, зморщуються, чорніють і так само залишаються на дереві. Уражені дерева виглядають як пошкоджені вогнем, обпалені. На корі уражених гілок і на плодах з часом з'являються краплини ексудату. Спершу вони безбарвні, потім стають жовтими або темно-коричневими і застигають у вигляді кульок. Виділення ексудату -- головна ознака, яка відрізняє ервінію від інших бактеріальних хвороб.

Улітку хвороба затухає, але наступної весни з початком сокоруху відновлюється з іще більшою інтенсивністю. Хворобу поширюють краплини дощу й комахи, передусім попелиці, короїди, бджоли, а також птахи. Окрім того, може передаватися з садовим реманентом і посадковим матеріалом. Шкідливість бактеріального опіку плодових дуже велика, може призвести до масової загибелі насаджень.

Властивості збудника бактеріального опіку плодових.. Клітини Erwinia amylovora являють собою палички із заокругленими кінцями та перитрихальним розташуванням джгутиків, грамнегативні, оксидазонегативні, спор та капсул не утворюють, факультативні анаероби, оптимальна температура росту становить 27 - 30⁰С.

Виділені з уражених зразків бактерії через 48 год. утворювали на картопляному агарі круглі, з рівними краями, блискучі колонії сірувато-білого кольору, напівпрозорі, маслянистої консистенції, зморшкуваті або з рівною гладкою поверхнею. У разі додавання до інкубаційного середовища дріжджового автолізату ріст колоній завершувався через 24 год. Для остаточної ідентифікації ізолятів вивчали їх здатність засвоювати різні органічні сполуки та синтезувати ферменти. За всіма ознаками досліджувані ізоляти були ідентичні колекційному штаму E. amylovora 2024 і штамам, описаним у літературі [8].

Висновки

1. Найбільшою загрозою насадженням плодових рослин серед збудників бактеріальних захворювань є фітопатогени представлені грампозитивними та грамнегативними бактеріями і мікоплазмами, серед яких найчастіше зустрічаються бактерії родів Pseudomonas, Xanthomonas, Agrobacterium, Erwiniа, Clavibacter, Cоrynebacterium, Streptomyces.

2. Бактеріальний опік плодових, збудником якого є Erwinia amylovora, що здатна спричиняти епіфітотії.

3. На основі вивчення морфологічних, культуральних, біохімічних властивостей та антигенного складу ізоляти, виділені з уражених тканин плодових культур в Закарпатській області, віднесені до E. аmylovora та X.arboricola.

4. Встановлено, що у разі високої інтенсивності захворювання збудник бактеріального опіку плодових проникає на значну відстань від видимої межі ураження, тобто, реальна межа поширення інфекційного процесу не збігається з візуальним її проявом.

5. Найуразливішими до патогену є зелені однорічні пагони, натомість у багаторічних гілках захворювання поширюється значно повільніше, при цьому уражена тканина від здорової чітко не відмежовується. Такі гілки доцільно видаляти повністю.

6. Відзначено селективний вплив однорічних пагонів та багаторічних гілок на агресивність популяцій E. аmylovora. В період інтенсивного росту дерев в уражених тканинах молодих пагонів E. аmylovora міститься у високоагресивній формі. У скелетних гілках та стовбурі інфекційний процес відбувається значно повільніше, ніж в молодих гілках, оскільки тут превалюють неагресивні форми патогену.

7. В умовах інтенсифікації сільськогосподарського виробництва проблема боротьби з фітопатогенними мікроорганізмами на Закарпатті не втрачає своєї актуальності.

Список використаних джерел

· Бактериальные болезни растений / ред. Израильский В.П. / М.: Колос, 1979.

· Билай В.И.,Э Гвоздяк Р.И., Скрипаль И.Г. и др.: Пол ред. Билай В.И. Микроорганизмы - возбудители болезней растений - Киев:Наук.думка, 1988

· Бичко А.С. Мікробіологія з основами вірусології: Конспект лекцій для студ. педвузів зі спец. 7.070.401 «Біологія» / Глухівський держ. педагогічний ін-т ім. С.М.Сергєєва-Ценського. - Глухів 1999. - 26 с.

· Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.-- М., 1984.- 87 с.

· Бургвиц Г.К. Бактериальные болезни растений - Ленинград: «Академия наук», 1936

· Бургвиц Г.К. Фитопатогенные бактерии - Ленинград: «Академия наук», 1935

· Векірчик К.М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. - К.: Либідь, 2001. - 312 с.

· Виявлення, діагностика та локалізація бактеріального опіку плодових: тимчасові методичні вказівки: К, 2000

· Воробьов А.А. Микробиология - М., «Медицина», 2003

· Воронкевич И.В. Выживаемость фитопатогенных бактерий в природе, 1974.

· Генкель П.А. Физиология растений. М., 1975.

· Горленко М.В. Бактериальные болезни растений. М.: Колос, 1981.

· Григорцевич Л.Н.,Макаревич А.И. Защита плодовых деревьев от болезней- Мн.: «Современное слово», 1998

· Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов. -- 4-е изд., стер. -- М.: Издательский центр «Академия», 2003. -- 464 с.

· Дацищин О.В., О.В. Гвоздєв, Ф.Ю. Ялпачик,Ю.П. Рогач; За ред. О.В. Дацищина. Механізація переробки і зберігання продовольчої продукції: Навч. посібник - К.: Мета,2003.

· Егоров М.Ю. Практикум по микробиологии. - М.: Изд. МГУ, 1988. - 220 с.

· Желдакова Р. А., Мямин В. Е. Фитопатогенные микроорганизмы: Учеб.- метод. комплекс для студентов биол. фак. спец. «Биология» - Мн.: БГУ, 2006. - 116 с.

· Защита растений от болезней/В. А. Шкаликов, О. О. Белошапкина, Д. Д. Букреев и др.; Под ред. В. А. Шкаликова. -- 3-е изд., испр. и доп.-- М.: КолосС, 2010.-- 404 с.,

· Кирай З., КлементЗ. Методы фитопатологии - М.,Колос - 1974

· Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбокова М.С Практична мікробіологія: Посібник.-Тернопіль: Укрмедкнига, 2004.-440с

· Корчагин В.Н. Вредители и болезни плододых и ягодных культур - М. Колос, 1971

· Кудрявцева З.Н. Микробиология с основами фитопатологии - Минск, 1968.

· Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., 1972. - 390с.

· Лысак В.В. Микробиология: учеб.пособие: БГУ, 2007

· Мигаль А.В., Чепур С.С. Методичні вказівки до лабораторниз робіт з курсу „Фітопатологія” для студентів вищих навчальних закладів III-IV рівнів акредитації напряму „Лісове та садово-паркове господарство. - Ужгород: Вид-во УжНУ „Говерла”, 2011.

· Микроорганизмы - возбудители болезней растений. Киев, Наукова думка, 1988.

· Руководство для изучения бактериальных болезней растений. М.: Колос, 19669.

· Семенкова И.Г., Соколова Э.С. Фитопатология - М.,2003 - 480с.

· Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. Изд. «Медицина». Москва 1967.

· Станчева Йорданка. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Болезни плодовых, ягодных, орехоплодных культур и винограда - Болгария: 2005

· Тарр С.А. Основы патологии растений, - М.:Мир, 1975.

· Хохряков М.К. Определитель болезней растений. - М., 2003

· Черемисинов Н.А. Общая патология растерий. Учебное пособие для университетов и сельхозвузов - М.: «Высшая школа»,1973

· Чикин Ю.А. Общая фитопатология (часть 1): учебное пособие. - Томский госуниверситет - Томск, 2001 - 170 с.

· Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. - М.: Мир,1987. - 567с.

· Janse J. D. Phytobacteriology: principles and practice. CABI Publishing, 2005

· Molecular Plant-Microbe Interactions. Edited by Kamal Bouarab,Normand Brisson, Fouad Daayf, CABI Publishing, 2009.

· Plant Innate Immunity. Editor L. C. VAN LOON, Elsevier, 2009.

· Richard N. Strange. Introduction to Plant Pathology, John Wiley & Sons Ltd, 2003.

Размещено на Allbest.ru

...