Устройство микробиологической лаборатории

Можно применить и такой метод: в сложенные ладонями вместе кисти рук наливают 100 мл стерильной воды так, чтобы вода хорошо промыла пальцы. Стерильным тампоном протирают ладони и ногти. Воду собирают в стерильную склянку и туда же бросают тампон. Смывную воду перемешивают и производят аналогичные высевы. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 мл смыва при отсутствии кишечных палочек:



Количество микроорганизмов в 1 мл смыва с рук	Оценка чистоты
До 1000	Отлично
1000-5000	Хорошо
5000-10000	Удовлетворительно
Свыше 10000	Плохо

Периодически проводят контроль обработки рук хлорной известью, для чего отдельные участки рук протирают ватным тампоном, смоченным йодкрахмальным раствором (смесь растворов - 6% раствора йодистого калия и 4% раствора растворимого крахмала в равных соотношениях). Если тампон и поверхности рук в местах соприкосновения с тампоном окрашиваются в сине-бурый цвет, то это свидетельствует о присутствии ионов хлора.

Чистоту рук можно проверить также с помощью индикаторных бумажек для определения бактерий группы кишечной палочки. Для этого индикаторную бумажку смачивают в стерильной воде и накладывают на руку. Затем бумажку помещают в пакет, запаивают и термостатируют в течение 12 часов при 370С. Появление розовых пятен свидетельствует о присутствии БГКП.

Халаты, куртки, передники, перчатки из ткани периодически исследуют на присутствие кишечных палочек посевом 1 см3 смывной воды в среду Кесслера. Кишечные палочки на спецодежде должны отсутствовать.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1-е занятие

На первом занятии студенты знакомятся с методиками определения микроорганизмов в воздухе, воде и осуществляют посевы этих объектов на питательные среды. Готовят смывы с рук и далее проводят определение наличие кишечной палочки с использованием среды Кода.

Микробиологическое исследование воздуха седиментационным методом

Определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) и содержание микроскопических грибов и дрожжей.

Для каждого определения готовят по 2 чашки Петри с 10-15 см3 мясопептонного агара или среды для определения КМАФАнМ и сусло-агара или среды Сабуро. Чашки переносят в исследуемое помещение и помещают на развернутую бумагу, в которой они стерилизовались. Далее сдвигают крышки на самый край бортика чашки так, чтобы вся поверхность агаризованной среды была открыта полностью.

Чашки оставляют открытыми 5, 10 или 15 минут (время экспозиции) в зависимости от загрязненности воздуха. Затем их закрывают крышками, переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Чашки с МПА выдерживают в течение 24-48 часов при 370С, а со средой Сабуро -в течение 2-3 суток при 250С.

Подсчет колоний производят визуально и с помощью лупы. Подсчет колоний грибов и дрожжей ведут отдельно. Для определения содержания микроорганизмов в 1 м3 пользуются формулой, предложенной Омелянским, согласно которой на поверхности чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 минут столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Формула Омелянского:

Х = а1005100 / ST,

гдеа - число выросших в чашках колоний (среднее из двух);

S - площадь чашки Петри, см2;

Т - время экспозиции, мин;

100 - пересчет площади чашки на 100 см2;

5 - время экспозиции по Омелянскому, мин;

100 - пересчет на 1 м3 воздуха.

Микробиологическое исследование воды

Отбор проб

Кран или край спускной трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10-15 минут воду спускают, после чего производят отбор пробы в стерильную колбу (объем пробы не менее 500 см3). Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой над огнем.

Определение общего микробного числа (КМАФАнМ)

Для посева отбирают по 1 см3 воды и переносят в 2 чашки Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45…50 0С плотной питательной средой (МПА). После инкубации посевов подсчитывают количество колоний в каждой чашке, а затем результаты суммируют и делят на два.

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методоммембранных фильтров

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации выросших колоний.

Для анализа точно отмеряют 100 см3 воды и фильтруют этот объем через стерильный мембранный фильтр. После окончания фильтрования фильтр осторожно приподнимают фламбированным пинцетом и переносят в чашку Петри со средой Эндо. Поверхность фильтра с осевшими на ней микроорганизмами должна быть обращена вверх. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37 0С в течение 24 часов.

Результат считается отрицательным, если на фильтрах вообще не выросли колонии, или выросли колонии с неровными краями и поверхностью.

При наличии типичных лактозо положительных колоний, дающих отпечаток на обратной стороне мембранного фильтра и среде - темно красных, красных с металлическим блеском, а также лактозо отрицательных - розовых без отпечатков, подсчитывают число колоний каждого типа.

Для идентификации отбирают не менее 5 колоний каждого вида и делают посев на скошенный питательный агар. Посевы инкубируют при 370С в течение 16-18 часов. Далее проводят биохимические тесты с чистыми культурами: оксидазный тест и тест образования кислоты и газа при ферментации лактозы при температуре 37 0С для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С при определении термотолерантных колиформных бактерий.

Определение содержания общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Метод бродильных проб (или титрационный метод) основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую накопительную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду для идентификации выросших колоний.

Титрационный метод может быть использован:

при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом бродильных проб;

при анализе воды с большим содержанием взвешенных частиц;

в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры, препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Первый этап исследования заключается в посеве 3-х объемов воды по 100 см3 в концентрированную лактозопептонную среду. Посевы инкубируют при температуре 37 0С в течение 24-48 часов для определения общих колиформных бактерий и при 44 0С - при определении термотолерантных колиформных бактерий в течение 242 часов. Если в колбах не обнаружены признаки роста (об этом судят по отсутствию газа в поплавках) токолиформные бактерии отсутствуют в 100 см3.

На втором этапе исследований из пробирок и колб, где отмечено наличие роста и образование газа, производят высев петлей в сектора среды Эндо. Посевы на среде Эндо выдерживают в термостате при 37 0С в течение 18-20 часов. Отсутствие колоний, типичных для бактерий группы кишечных палочек, дает отрицательный ответ о содержании этих микроорганизмов в исследуемом объеме воды.

Определение споровых сульфит редуцирующих клостридий прямым посевом

Из каждой пробы воды делают посев 20 см3 в железосульфитный агар. Для этого в стерильные пробирки вносят по 10 см3 в 2 пробирки объемом 30 см3 или по 5 см3 в 4 пробирки вместимостью 15 см3. Посевы заливают горячим (75…80 0С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объемводы в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирки быстро охлаждают, помещая их в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 0С в течение 242 часов. Если после культивирования не наблюдается почернения среды в пробирках, то считают, что сульфит редуцирующие клостридии отсутствуют в 20 см3.

Исследование чистоты рук

Закрепленный на деревянном или металлическом стержне стерильный тампон смачивают стерильной водой (или физиологическим раствором) и протирают ими ладони, тыльную поверхность рук, под ногтями и между пальцами обеих рук. Тампон погружают в пробирку с водой, в которой проводилось смачивание, содержимое пробирки хорошо взбалтывают, отбирают 1 см3 и готовят разведения (1:10 и 1:100).

Для определения КМАФАнМ проводят посев разведений в чашки Петри на мясопептонный агар с последующим термостатированием при 370С в течение 48 часов. Остаток смыва вместе с тампоном высевают в пробирки с 5 см3 среды Кесслера и проводят культивирование при 43 0С в течение 24 часов.

Учет результатов исследований. Чистоту рук оценивают по количеству микроорганизмов в 1 см3 смыва при отсутствии газообразования в пробирке со средой Кесслера с поплавком (при отсутствии кишечной палочки). При оценке состояния рук по содержанию в смывной воде мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) руководствуются описанием, изложенным в разделе 4.1.4 данной лабораторной работы.

2-е занятие

На втором занятии студенты исследуют:

посевы воздуха на мясопептонном агаре и на среде Сабуро. Подсчитывают количество выросших колоний и по формуле Омелянского определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, содержание грибов и дрожжей в 1 м3 воздуха. Определение качественного состава микрофлоры воздуха проводят по методикам, описанным в разделах 2.2.4 и 2.2.5. На основании результатов исследований делаются выводы о санитарном состоянии и качественном составе микрофлоры воздуха.

Посевы водопроводной воды на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Подсчитывают количество выросших колоний на мясопептонном агаре. Если в чашках выросло более 50 колоний, то санитарное состояние воды неудовлетворительное. Внимательно рассматривают посевы воды на жидкой накопительной среде (лактозо-пептонной среде или среде Кесслера). Если на среде есть рост, то лаборанты к занятию делают пересев на среду Эндо. Студенты рассматривают посевы в чашках Петри на среде Эндо и при наличии типичных колоний готовят фиксированные мазки, окрашивают их по Граму. Если в мазках при микроскопии с объективом на х90 обнаруживаются грамотрицательные мелкие палочки, располагающиеся по одиночке, без спор, то считают, что в исследуемой пробе воды присутствуют кишечные палочки и делают вывод о том, что исследованная вода не соответствует требованиям СанПиНа и в 100 см3 воды обнаружены общие колиформные бактерии.

Посевы с рук на мясопептонном агаре и среде Кесслера. Делают вывод о чистоте рук.

Контрольные вопросы

Какая служба осуществляет государственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности?

Какие формы государственного санитарного надзора Вы знаете?

какими полномочиями наделены органы и учреждения государственного санитарного надзора?

Кто осуществляет внутриведомственный санитарный надзор на предприятиях молочной промышленности?

По каким микробиологическим показателям проводят оценку санитарно-гигиенического состояния воздуха?

В чем сущность седиментационного метода определения микроорганизмов в воздухе?

В чем заключается сущность аспирационного метода определения микроорганизмов в воздухе?

Каким образом можно снизить бактериальную обсемененность воздуха?

Какие микробиологические показатели определяются согласно ГОСТу в питьевой воде для оценки ее санитарного состояния?

Каким образом готовятся смывы с оборудования для оценки его санитарного состояния?

Как проводят контроль чистоты трубопроводов, шлангов, рукавов?

Какие микробиологические показатели определяют в смывах с оборудования, трубопроводов, посуды?

Каким образом проводят микробиологический контроль вспомогательных и упаковочных материалов?

Как определить качество мойки и дезинфекции посуды?

Как проводят микробиологический контроль чистоты рук работников?

Как проводят контроль обработки рук работников хлорной известью?

Как определить содержание микроорганизмов в 1 м3 воздуха?

Что такое коли-титр, коли-индекс воды?

Какие способы обеззараживания воды Вам известны?

Каким образом определяется коли-титр и коли-индекс в питьевой воде?

Как рассчитывается содержание микроорганизмов в 1 м3 воздуха при использовании седиментационного метода?

Какие микроорганизмы являются санитарно-показательными для воздуха и как они определяются?



БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Вербина Н.М., Каптерева Ю.В. Микробиология пищевых производств: Учебник. - М.: Агропромиздат, 1988. - 256 с.

2. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов».

3. ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».

4. ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов».

5. ГОСТ 25102-90 «Молоко и молочные продукты. Методы определения содержания спор мезофильных анаэробных бактерий».

6. Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 168 с.

7. Лерина И.В., Педенко А.И. Лабораторные работы по микробиологии: Учеб. Пособие для товаровед. и технол. фак. торг. вузов. - 2 изд., перераб. - М.: Экономика, 1986. - 128 с.

8. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. - М.: Изд-во стандартов, 1996.

9. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК 4.2.577-96. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. -94 с.

10. Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды: Методические указания МУК 4.2.671-97. - М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1997. -36 с.

11. Микробиологические основы молочного производства: Справочник / Л.А. Банникова, Н.С. Королева, В.Ф. Семенихина; Под ред. канд. техн. наук Я.И. Костина. - М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с.

12. Микробиология: Практикум / Л.Г. Бранцевич, Л.Н. Лысенко, В.В. Овод, А.В. Гурбик. - Киев: Вища школа, 1987. - 200 с.

13. Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов /К.А. Мудрецова-Висс, А.А.Кудряшова, В.П.Дедюхина. Владивосток: Изд-во ДВГАЭУ, 1997. 312 с.

14. Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. - М.: Агропромиздат, 1990. - 223 с.

15. СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». Действительно с 1 января 2002 г. - М.; изд-во стандартов, 2002.

16. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984 - 208 с.

17. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Колос, 1996. -271с.



ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИГОТОВЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ КРАСИТЕЛЕЙ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. КРАСИТЕЛИ

Фуксин основной спиртовой раствор - насыщенный

Фуксин основной кристаллический - 10 г

Этиловый спирт, 96%- 100 мл

Фуксин растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор может храниться долгое время в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной карболовый - фуксин Циля

Фуксин основной кристаллический - 1 г

Карболовая кислота (фенол)- 5 г

Этиловый спирт, 96- 10 мл

Дистиллированная вода- 100 мл

При приготовлении раствора предварительно взвешивают определенное количество (1 г) фуксина основного кристаллического, вносят в фарфоровую ступку и растирают с определенным количеством (5 г) карболовой кислоты, добавляя спирт небольшими порциями и дистиллированную воду до полного растворения кристаллов, после чего приливают оставшуюся воду. Приготовленный краситель ставят в термостат при 37 С на двое суток. Затем отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной карболовый устойчив и может храниться долго. Хранить следует в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной карболовый можно приготовить другим способом:

Вначале готовят два раствора.

1-й раствор

Фуксин основной кристаллический - 1 г

Этиловый спирт, 96- 10 мл

Смесь растирают в фарфоровой ступке до полного растворения кристаллов фуксина.

2-й раствор

Карболовая кислота- 5 г

Дистиллированная вода- 95 мл

Воду подогревают до 50 С для лучшего растворения карболовой кислоты. Второй раствор вливают в первый, хорошо взбалтывают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной, водный (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля - 10 мл

Дистиллированная вода- 90 мл

Водный фуксин нестоек, его лучше готовить непосредственно перед употреблением. Раствор водного фуксина может храниться не более 10 дней.

Карболовый генциановый фиолетовый

Генциановый фиолетовый (кристаллы) - 1 г

Этиловый спирт,96%- 10 мл

Карболовая кислота- 5 г

Дистиллированная вода- 100 мл

Техника приготовления карболового генцианового фиолетового такая же, как карболового фуксина Циля.

При приготовлении карболового генцианового фиолетового можно также готовить предварительно два раствора.

1-й раствор

Генциановый фиолетовый - 1 г

Этиловый спирт, 96%- 10 мл

2-й раствор

Карболовая кислота- 5 г

Дистиллированная вода - 95 мл

Последовательность и способ приготовления первого и второго растворов такие же, как и при приготовлении карболового фуксина Циля.

Приготовление красящих бумажек генцианвиолета (по Синеву)

Для приготовления бумажек фильтровальную бумагу предварительно испытывают на пригодность. Для этого полоску фильтровальной бумаги погружают в спиртовой раствор красителя (карболового генцианового фиолетового), высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно без пятен. Если небольшой кусок такой бумаги положить на стекло с несколькими каплями воды, он сразу же пропитается водой и краситель через несколько секунд перейдет в раствор. Бумагу для пропитывания нарезают полосками (шириной 2,5-3 см, длиной 30 см) и погружают в краситель так, чтобы смачивались обе поверхности. Затем полоски вынимают, высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37 С.

Пропитывать красящиеся бумажки можно также спиртовым раствором генцианвиолета следующего состава:

Генциановый фиолетовый (кристаллы) - 1 г

Спирт этиловый, 96- 100 мл

Глицерин- 5 мл

Метиленовый синий (насыщенный спиртовой раствор)

3 г метиленового синего растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор выдерживают 2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Раствор устойчив.

Раствор бриллиантовой зелени (раствор малахитового зеленого)

Водный насыщенный раствор готовится путем растворения 10 г малахитового зеленого в 10 мл дистиллированной воды. Спиртово-водный раствор: 10 г малахитового зеленого смешивается с 80 мл дистиллированной воды и 20 мл 96%-ного этанола.

Метиленовый синий 1:40

1 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают с 40 мл дистиллированной воды.

Метиленовый синий, щелочной раствор(по Леффлеру)

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора мителенового синего и 1 мл 1%-ного водного раствора гидроксида калия.

Метиленовый синий по Финку

Отдельно взвешивают 0,9 г гидрофосфата натрия, 13,6 дигидрофосфата калия и 0,1 г метиленового синего. Каждую навеску растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Смешивают 0,25 мл первого раствора с 99,75 мл второго и 100 мл третьего (рН 4,6).

Сафранин (водный)

10 мл 2,5%-ного раствора сафранина в 96%-ном этаноле смешивается со 100 мл дистиллированной воды.

Раствор Люголя (в модификации Грама)

В ступку вместимостью 30-50 мл помещают 1 г кристаллического йода и 2 г йодида калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды, продолжают растирать кристаллы и добавляют еще 5 мл воды. При этом йод растворяется в йодиде калия. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем до 300 мл. Раствор годен не более 30 дней, хранят его в прохладном месте, в темноте, лучше в посуде оранжевого цвета.

Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы

Кристаллический йод- 1 г

Йодид калия- 3 г

Вода дистиллированная - 300 мл

Раствор готовят так же, как и предыдущий.

Для обнаружения гликогена можно также использовать крепкий раствор йода

Кристаллический йод- 7 г

Йодид калия- 20 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Краска Муромцева

Готовят два раствора:

1-й раствор

Фуксин основной- 0,15 г

Спирт, 96%- 20 мл

Кристаллическая карболовая кислота - 10 г

2-й раствор

Метиленовый синий- 2,5 г

Дистиллированная вода - 200 мл

Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор туши для выявления капсул

Смешивают 10 мл жидкой натуральной туши с 90 мл дистиллированной воды. Затем раствор центрифугируют 15-20 мин. Верхний слой переносят в пробирку и автоклавируют 30 мин (0,05 МПа, температура 110 0С). После автоклавирования раствор отстаивают две недели, после чего его можно использовать.

2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

УНИВЕРСАЛЬНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Мясопептонный бульон. Приготавливают мясную воду: 1 кг говяжьего мяса, освобожденного от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают 2 л водопроводной воды. Фарш настаивают в воде 12…24 часа на холоде. За это время из мяса экстрагируются водорастворимые белки, аминокислоты, витамины, углеводы, минеральные и другие вещества. Настой фильтруют через двойной слой марли, мясо хорошо отжимают и фильтрат кипятят 30 мин для свертывания белков. Сняв жир, остывшую жидкость пропускают через ватно-марлевый фильтр и доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают по колбам или бутылкам и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20 мин.

Для приготовления мясопептонного бульона к мясной воде добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистого хлорида натрия, кипятят 10 мин, фильтруют через складчатый бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2…7,4 10% раствором двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Мясопептонный бульон должен иметь соломенный цвет и быть совершенно прозрачным. Его разливают в пробирки, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20-30 мин.

Питательный бульон можно приготовить из заменителей мяса (мясного экстракта, рыбного гидролизата) по способу, указанному на этикетке.

Мясопептонный агар готовится из мясопептонного бульона с добавлением 2…3% измельченного или порошкообразного агар-агара. Раствор нагревают до кипения и кипятят до полного растворения агара. Затем раствор охлаждают до 50 0С и осветляют взбитым куриным белком (1 белок на 1 л среды), смешанным с 30 мл воды, вновь доводят до кипения и кипятят 20 мин. Белок свертывается, оседает и осветляет среду. Горячий агар фильтруют через ватно-марлевый слой, доводят до рН 7,2…7,4, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1 МПа.

Пептонная вода. Растворяют 30 г пептона в 1 л дистиллированной воды и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1МПа.

Пептонную воду можно также приготовить следующим образом: к 1 л дистиллированной воды добавляют при нагревании 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 0,1 г нитрата калия. Фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН 7,6…7,8. Разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно по 30 мин в течение 3 сут.

Солодовое сусло. 250…300 г ячменного сухого солода крупного помола заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48-50 0С и, непрерывно помешивая во избежание образования комочков, поддерживают температуру в течение 30 мин. Затем температуру повышают до 55…58 0С, через 30 мин до 63 0С и на этом уровне выдерживают смесь до полного осахаривания крахмала. Готовую среду отжимают через полотняный фильтр, чтобы удалить дробину, затем фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию сухих веществ (СВ) при 20 0С, которая обычно составляет 18-20%. До нужной концентрации фильтрат разводят водопроводной водой. Для выращивания дрожжей солодовое сусло должно иметь концентрацию 6…8% СВ, для молочнокислых бактерий - 8…12% СВ, для мицелиальных грибов 3…4%, рН среды 5,6…6,0. При более низком значении рН сусло подщелачивают 10% раствором двууглекислой соды или гидроксида натрия. Далее сусло разливают в колбы или пробирки, закрывают их ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,05 МПа 30 мин.

Для приготовления данной среды можно также использовать неохмеленное заводское пивное сусло, доведенное до определенного содержания СВ и рН.

Сусло-агар. При приготовлении сусло-агара к солодовому суслу добавляют 2% агара. Для микроорганизмов, образующих кислоты добавляют также немного мела. Среду стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа или дробно текучим паром.

Среда используется для выделения, выращивания и хранения дрожжей, мицелиальных грибов, молочнокислых и уксуснокислых бактерий.

Дрожжевой автолизат. Способ 1: гомогенную массу из 1 кг прессованных хлебопекарных дрожжей и 1 л водопроводной кипяченой воды ставят в термостат при 50 0С, добавив несколько капель толуола, и выдерживают при периодическом перемешивании 72 ч. По окончании автолиза дрожжей массу нагревают в автоклаве при 0,02 МПа 30 мин. Остывшую массу фильтруют через двойной складчатый бумажный фильтр до полной прозрачности.

Прозрачный фильтрат содержит 0,9% азота. Фильтрат нейтрализуют до рН 6,8…7,0, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0.01…0,05 МПа в течение 10…20 мин.

Способ 2: 1 кг прессованных дрожжей смешивают с 4 л водопроводной воды и выдерживают в термостате при 55 0С в течение 24 час. Затем автолизат фильтруют и стерилизуют при давлении 0,05 МПа 20 мин.

СПЕЦИАЛЬНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среды для выявления стафилококков

Молочно-солевой агар: в 100 см3 питательного агара растворяют при кипячении 6,5 г хлорида натрия, стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин. К расплавленному и остуженному до 45С агару добавляют 10 см3на 100 см3 обезжиренного стерилизованного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри. Учитывают колонии с зоной просветления.

Желточно-солевой агар: к 150 см3 расплавленного и охлажденного до 45С 6%-ного солевого агара стерильно добавляют 50 см3 желточного раствора (1 желток куриного яйца растворяют в 150-200 см3 физиологического раствора). Быстро перемешивают и разливают в чашки Петри.

Среды для культивирования дрожжей и микроскопических грибов

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70…100 г свежих прессованных дрожжей (7…10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20…30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде 12 час. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят рН до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2…3 сут. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, после растворения агара вносят 4% глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среду можно готовить и на обычной 1%-ной пептонной воде.

Синтетическая среда Ридер для дрожжей. В состав среды входят (в г/л):сульфат аммония 3,сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5. дегидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия. Начальное значение рН среды 6,6.Для изучения размножения дрожжей добавляют 2% сахара, для исследования брожения 5…10%. Полная синтетическая среда содержит также витамины (в мкг/мл): инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновую кислоту 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновую кислоту 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 МПа.

Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель массой 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2% глюкозы и 2…3% агар-агара. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты.

Синтетическая среда Чапека для грибов. Состав среды (в г/л): сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают рН 4,0…5,5 10% раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 сут по 30 мин.

Полная среда с лизином для выявления несовершенных дрожжей. В 1 л водопроводной воды вносят (в г/л): глюкозу - 50, сульфат магния - 1, дигидрофосфат калия - 2, лактат калия - 12 мл 50% раствора, L(+) моногидрат лизина - 1, витаминный раствор (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляют (в г) инозитола 2, пантотената кальция 0,4, никотинамида 0,5, хлоргидраттиамина 0,1), агара - 20. рН среды составляет 5,0…5,2. Среду разливают в пробирки и стерилизуют 15 мин при 0,1 МПа.

Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей. На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среды для культивирования молочнокислых бактерий

Цельное молоко разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. Среду используют для изучения физиологических свойств молочнокислых бактерий.

Обезжиренное молоко отделяют от сливок путем сепарирования, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при тех же режимах, что и цельное молоко. Среду используют для изучения физиологических свойств микробов и для группового количественного учета молочнокислых бактерий.

Гидролизованное молоко. В стерильном обезжиренном молоке устанавливают рН 7,6…7,8. Молоко нагревают до 45 0С и к 1 л молока добавляют 0,5 - 1 г панкреатина, предварительно растворенный в теплой воде, и 5 мл хлороформа. Емкость с молоком плотно закрывают корковой пробкой, смесь тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 40 0С на 18…24 часа. Затем полученную прозрачную жидкость декантируют и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат разводят водой в 2 раза, устанавливают рН 7,0…7,2 и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 15 мин.

Агар с гидролизованным молоком. В гидролизованное молоко вносят 1,5…2,0% агар-агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10…15 мин.

Среда для количественного учета гнилостных бактерий

Молочный агар готовят путем внесения 20% горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2% водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков). Вокруг колоний гнилостных бактерий образуются зоны протеолиза и пептонизации.

Среда с говяжьим жиром. В состав среды входят: пептон - 1 г, дрожжевой автолизат - 0,3, двузамещенный фосфат натрия - 0,1 г, агар - 1,5 г, дистиллированная вода - до 100 мл, рН 7,0…7.4.

Отдельно готовят в пробирках стерильный говяжий жир. Среду стерилизуют при 121 0С (0,1 МПа) в течение 15 мин.

Среды для выявления и идентификации бактерий группы кишечной палочки

Среда Кесслер: к 1 л водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл свежей бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане 30 мин, помешивая, после чего фильтруют через вату, добавляют 2,5 г глюкозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки или колбы с поплавками в количествах, предусмотренных для контроля отдельных продуктов. Стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин. Цвет среды должен быть темно-фиолетовым.

Лактозо-пептонная (глюкозо-пептонная) среда. 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы (глюкозы) растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4…7,6. Среду разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,05 МПа 10…15 мин.

Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого,4…5 г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2…7,4, добавляют 1 мл 1,6% спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту 3…5 см и стерилизуют при 0,05МПа 10…15 мин. Правильно приготовленная среда - зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). Срок хранения такой среды не более 2-х недель.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар): в 5 мл стерильной воды растворяют 1 г лактозы, подогревают на водяной бане при 100 С в течение 5 мин, соблюдая стерильность, прибавляют к 100 мл расплавленного 2%-ного мясопептонного агара с рН 7,6-7,8. В отдельную стерильную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного накануне и профильтрованного 10%-ного раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 10%-ный раствор сульфита натрия до получения бледно-розового окрашивания. Полученную смесь вносят в расплавленный лактозный агар, тщательно перемешивают, избегают вспенивания, и разливают в стерильные чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной.

Среды для выявления сульфит редуцирующих клостридий других анаэробов

Железо-сульфитный агар. Основная среда. В 1 л стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при 0,05 МПа 10…15 мин.

20% раствор сульфита натрия и 8%-ный раствор железа сернокислого закисного готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20%-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8%-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, разливают с соблюдением правил стерильности в стерильные пробирки или флаконы.

Среда Китта-Тароцци. Проваренные и промытые водой кусочки печени или мяса опускают в пробирки и заливают мясопептонным бульоном с 1% глюкозы на Ѕ объема пробирки. Сверху приливают слой вазелинового масла высотой 1 см. Стерилизуют среду при 0,1 МПа в течение 15 мин.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

НОРМИРУЕМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ(выписка из СанПиН 2.3.2. 1078-01)

1. Мясо и мясопродукты; птица, яйца и продукты их переработки

		Масса продукта (г), в которой не допускается
Индекс, группа продуктов	КМАФАнМ, КОЕ/г, не Более	БГКП (коли- формы)	Сульфитреду- Цирующиеклостридии	S. aureus	Протей	Патогенные, в т.ч. сальмонеллы	Примечание
1.1. Мясо (все виды убойных животных) охлажденное	1103	0,1	-	-	-	25	Отбор проб из глубоких слоев, L.monocytogenes в 25 г не допускается
1.2. Полуфабрикаты мясные бескостные крупнокусковые	5103	0,001	-	-	-	25	L.monocytogenes в 25 г не допускается
1.3. Полуфабрикаты мясные рубленные	5106	0,0001	-	-	-	25	L.monocytogenes в 25 г не допускается
1.4. Колбасы полукопченые и варенокопченые	-	1,0	0,01	1,0	-	25	L.monocytogenes в 25 г не допускается
1.5. Изделия колбасные вареные (колбасы, сосиски, сардельки) - высшего и 1 сорта - второго сорта	1103 2,5 103	1,0 1,0	0,01 0,01	1,0 1,0	- -	25 25	В сосисках и сарделькахL. monocytogenes в 25 г не допускается
1.6. Паштет из печени (или мяса), в т.ч. в оболочках	1103	1,0	0,1	-	-	25	для продуктов, сроки годности которых превышают 2 суток: S.aure-us в 1,0 г не допуск-ся
1.7. Консервы пастеризован. из говядины или свинины	2102	1.0	0,1	1,0	-	25	B.cereusв 0,1 г не допускается
1.8. Консервы из говядины, свинины, конины стерилизованные	Должны удовлетворять требованиям промышленной стерильности для консервов группы А
1.9. Тушки и мясо птицы охлажденные замороженные	1104 1105	- -	- -	- -	- -	25 25	Отбор проб из глубоких слоев мышц L.monocytogenes в 25 г не допускается
1.10. Готовые быстро заморженные блюда из мяса птицы: жареные, отварные из рубленого мяса с соусами и/или гарнирами	1104 2104	0,1 0,1	- -	1,0 1,0	- -	25 25	Enterococсus не1104
1.11. Яйцо куриное столовое	5103	0.1	-	-	-	25	анализ проводят в желтках
Меланж	5105	0,1	-	1.0	1,0	25
Яичный порошок	5104	0,1	-	1.0	1,0	25
1.14. Яйцепродукты сублимационной сушки: желток белок, альбумин	5104 1104	0,01 0.1	- -	1.0 1,0	- -	25 25

2. Молоко и молочные продукты

Индекс, группа	КМАФАМ,	Масса продукта, в которой не допускается	Дрожжи,
Продуктов	КОЕ/г, не более	БГКП (коли-формы)	S. aureus	Патогенные, в т.ч. сальмонеллы	плесени, КОЕ/г, не более	Примечание
2.1.Молоко сырое: высший сорт первый сорт второй сорт	3105 5105 4106	- - -	- - -	25 25 25	- - -	Сомат. клетки не 5105/ см3 Сомат. клетки не 1106 /см3 Сомат. Клетки не 5106/см3
2.2.Молоко пастеризован. в потребительской таре во флягах и цистернах	1105 2105	0,01 0,01	1,0 0,1	25 25	- -	L. monocytogenes в 25 г не допускаются
2.3.Молоко топленое	2,5103	1,0	-	25	-
2.4.Жидкие кисломолочные продукты со сроком годности не72 ч	-	0,01	1,0	25	-
2.5.Сметана и продукты на ее основе	-	0,001	1,0	25	Дрожжи-50 Плесени -50	для термически обработанных продуктов - 0,01; для продуктов со сроком годности более 72 ч
2.6.Творог и творожные изделия со сроком годности не 72 ч	-	0,001	1,0	25	-
2.7.Творожные изделия, термически обработанные	-	0,01	1,0	25	Дрожжи, плесени 50
2.8.Молоко сгущенное с сахаром в потребительской таре	2104	1,0	-	25	-
2.9.Какао, кофе натуральный со сгущенным молоком и сахаром, сливки, сгущенные с сахаром	3,5104	1,0	-	25	-
2.10.Молоко коровье сухое цельное	5104	0,1	1,0	25	-
2.11.Молоко сухое обезжирен.: для непосредственного употребления для промышленнойпереработки	5104 1105	0,1 0,1	1,0 1,0	25 25
2.12. Сыр Российский	-	0,001	*	25	-	*S. aureusне более 500 КОЕ/г
2.13. Сыры плавленые - без наполнителей - с наполнителями (овощи,грибы и др.)	5х103 1х104	0,1 0,1	- -	25 25	Плесени 50дрожжи 50 Плесени 100дрожжи 100
2.14. Мороженое на молочной основе закаленное	1х105	0,01	1,0	25	-
2.15. Мороженое мягкое из сухих и жидких смесей	1х105	0,1	1,0	25	-
2.16. Масло вологодское	1х104	0,1	-	25	-
2.17. Масло сладко-сливочное и соленое любительское и крестьянское	1х105	0,01	-	25	-
2.18. Масло кисло-сливочное любительское и крестьянское	-	0,01	-	25	-
2.19. Масло шоколадное	1х105	0,01	-	25	-
2.20. Масло сливочноебутербродное	5х105	0,001	-	25	-
2.21. Масло коровье топленое	1х103	1,0	-	25	Плесени 200

3. Кондитерские изделия

Индекс, группа	КМАФАМ,	Масса продукта, в которой не допускается	Дрожжи,	Плесени,
Продуктов	КОЕ/г, не более	БГКП (коли-формы)	S.aureus	Патогенные, в т.ч. сальмонеллы	КОЕ/г, не более	КОЕ/г, не более	Примечание
Торты и пирожные бисквитные, слоеные, песочные, воздушные, заварные, крошковые с отделками, в т.ч. замороженные: сливочной белково-сбивной типа суфле фруктовой, помадной -из шоколадной глазури -жировой творожно-сливочной типа «картошка» заварным кремом	5104 1104 1104 5104 5104 5104 1104	0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01	0,01 0,01 0,1 0,1 0,1 0,01 1,0	25 25 25 25 25 25 25	100 50 50 50 - 50 50	50 100 100 100 - 100 100	в 0,1 г не допускается со сроком годности 5 и более суток дрожжи -50, плесени- 50 КОЕ/Г, не более со сроком годности 5 и более суток

4. Масличное сырье и жировые продукты

Индекс, группа	КМАФАМ,	Масса продукта (г),в которой не допускается	Дрожжи,	Плесени,
продуктов	КОЕ/г, не более	БГКП (коли-формы)	Патогенные, в т.ч. сальмонеллы	КОЕ/г, не более	КОЕ/г, не более	Примечание
4.1. Майонез в потребительской таредля промпереработки	- -	0,01 0,01	25 25	5102 1103	50 50
4.2. Кулинарные и кондитерские жиры	-	0,01	25	1103	1102
4.3. Маргарины столовые, бутербродные	-	0,01	25	5102	50
4.4. Кремы на растительных маслах	1104	0,01	25	50	50

5. Напитки

Индекс, группа	КМАФАМ,	Масса продукта (г), в которой не допускается
продуктов	КОЕ/г, не более	БГКП (коли-формы)	Патогенные, в т.ч. сальмонеллы	Дрожжи, плесени, КОЕ/г, не более	Примечание
5.1. Пиво разливное	-	1,0	25	-
5.2. Пиво непастеризованное в кегах в бутылках	- -	3,0 10,0	25 25	- -
5.3. Пиво пастеризованное и обеспложенное	500	10,0	25	40



6. Продукты питания для детей раннего возраста(продукты на молочной основе)

		Масса продукта (г), в которой не допускается
Индекс, группа продуктов	КМАФАнМ КОЕ/г, неболее	БГКП (коли-формы)	E.coli	S.aureus	Патогенные в т.ч. сальмонеллы и L.monocytogenes	B.cereus, КОЕ/г, не более	Плесени, КОЕ/г, не более	Дрожжи, КОЕ/г, не более	Примечания
6.1.Частично адаптированные молочные смеси: -инстантного приготовления - требующие термической обработки	2103 3103 2,5104	1,0 1,0	10 -	10 1.0	100 50	100 200	50 100	10 50	восстанавливаемых при 37-50 С восстанавливаемых при 75-850С
6.2.Молоко сухое для детского питания - инстантного приготовления - требующего кипячения после восстановления	2103 3103 2,5104	1,0 1,0	10 -	10 1.0	100 25	100 -	50 100	10 50
6.3. Каши сухие безмолочные быстрорастворимые	1104	1,0	-	-	50	200	100	50
6.4. Каши сухие молочные, требующие варки	5104	0,1	-	-	50	-	2102	100

Размещено на Allbest.ru

...