Получение посевного материала для промышленного культивирования микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«ПЕНЗЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» (ПГТА)

Кафедра биотехнологии и техносферной безопасности

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

Дисциплина «Биотехнология белка и биологически активных веществ»

на тему: Получение посевного материала для промышленного культивирования микроорганизмов

Выполнил:

Руководитель:

Черкасова Г.Н.

Пенза 2012

Задание

на курсовую работу по дисциплине «Биотехнология белка и биологически активных веществ»

Студенту Кочетковой Е.В. Группа 08БТ

Тема работы: «Получение посевного материала для промышленного культивирования микроорганизмов.»

Исходные данные:

1. Введение: виды белковых и биологически активных веществ, получаемые путем микробиологического синтеза, дать краткую характеристику процессов, осуществляемых на биотехнологической стадии типовой технологической схемы.

2. Технология подготовки посевного материала для промышленного культивирования микроорганизмов в ферментаторах большой вместимости, включая:

- методы поддержания продуцента в рабочем состоянии и сохранения его ценных свойств,

- способы хранения культур продуцентов,

- технологическую схему получения посевного материала (блок-схема) с описанием процессов, проводимых на стадиях

- а) получение рабочих партий посевного материала на агаризованной среде в пробирках, сыпучем субстрате и т.д., б) получение вегетативного посеаного материала, включая технологию культивирования микроорганизмов, в) характеристику аппаратурного оформления процессов вырвщивания посевного материала.

Руководитель: Черкасова Г.Н.

Задание получил 6 февраля 2012 г.

Студент: Кочеткова Е.В.

Содержание

Ведение

1. Технология подготовки посевного материала для промышленного культивирования

2. Способы хранения культур микроорганизмов

3. Технологическая схема получения посевного материала (блок-схема)

4. Особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов

5. Аппаратурное оформление процесса выращивания посевного материала

Список литературы

Ведение

К группе белковых препаратов, получаемых биотехнологическим способом, относятся:

- Ферментные препараты (группа фармакологических средств, способствующих улучшению процесса пищеварения. В настоящее время на рынке представлено множество различных ферментных препаратов)

- Аминокислоты (органические соединения, в молекуле которых одновременно содержатся карбоксильные и аминные группы. Аминокислоты могут рассматриваться как производные карбоновых кислот, в которых один или несколько атомов водорода заменены на аминные группы.);

- Продукты микробного происхождения(они дополняют вещества, получаемые классическим способом, а частично и заменяют их);

- Белковые концентраты (белок является основной составляющей человеческого тела, и хронический недостаток белка в рационе любого человека приводит к нарушению обмена веществ, нарушению работы внутренних органов, снижению сопротивляемости организма к инфекциям. Поэтому белковые концентраты являются продуктами широкого назначения и должны применяться независимо от уровня вашей физической активности, а порой и вопреки ей.);

-Белковые изоляты (изолят - куда более чистый продукт, чем концентрат. Его получают методом продолжительной фильтрации или ионного обмена. В итоге производитель получает сухую массу, содержащую более 95% белковых фракций. Лактозы и жиров в изоляте почти нет, а это означает, что изолят идеален для приема как с целью лечения белковой недостаточности, так и для коррекции белка до и после тренировок. Плюс изолят гораздо дешевле гидролизата, поэтому его могут себе позволить широкие слои населения.);

- Токсины (яд биологического происхождения. Вещества бактериального, растительного или животного происхождения, способные угнетать физиологические функции, что приводит к заболеванию или гибели животных и человека. По химической природе все токсины -- белки или полипептиды.);

- Анатоксины (препарат, приготовленный из токсина, не имеющий выраженных токсических свойств, но при этом способный индуцировать выработку антител к исходному токсину. Обычно инактивация токсина производится путём длительного выдерживания в тёплом разбавленном растворе формалина. Анатоксины используются для профилактики инфекционных заболеваний, в основе патогенеза которых лежит интоксикация: дифтерии, столбняка, отравлений токсином стафилококка, и т. п.);

- Токсические белки энтомопатогенных бацилл.

Биотехнологическая стадия- это основная стадия ботехнологического производства, на которой происходит преобразование сырья биологическим объектом в целевой продукт.

Сначала на этой стадии идет накопление биомассы, а затем образуется целевой метаболит.

Основные процессы биотехнологической стадии:

1) Биоконверсия

2) Биокатализ

3) Биоокисление

4) Метановое брожение

5) Биокомпостирование

6) Биосорбция

7) Бактериальное выщелачивание

8) Биодеградация

Биоконверсия (биотрансформация) заключается в видоизменении молекул органических веществ под действием микробных клеток или ферментов и в превращении их в новые соединения.

Особенности биоконверсии: идет превращение веществ - субстратов в структурно - родственные соединения; не идет полная деградация субстрата, присутствуют лишь незначительные изменения продукта, которые приводят к получению целевого продукта. Процессы биоконверсии используют в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, очистке окружающей среды (вод) и т.д.

Процессы биоконверсии бывают односубстратные и многоубстртные. К односубчтратным относятся процессы биотрассформации и биокатализа, а к многосубстратным все остальные.

Биокатализ- это химическое превращение вещества, протекающие с использованием биокатализаторов ферментов.

Биоокисление - это процесс потребления загрязняющих веществ микроорганизмами, которые используют при биологической очистке сточных вод.

Метановое брожение - это разложение органических веществ, содержащихся в твердых и жидких отходах метанобразующими бактериями в анаэробных условиях. При этом не только разлагаются бактерии, но и выделяется метан, который можно использовать как топливо.

Биокомпостирование - это процесс разложения микроорганизмами органических веществ, в том числе вредных, содержащихся в твердых отходах, растительных и животных остатках, в результате которого получаются органические удобрения.

Биосорбция - это накопление бактериями и грибами различных микроэлементов и концентрация их в местах массового развития этих микроорганизмов.

Бактериальное выщелачивание - это процесс перевода нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием микроорганизмов.

Биодеградация - это способность микроорганизмов разлагать сложные молекулы веществ на более простые соединения.

1. Технология подготовки посевного материала для промышленного культивирования

Посевным материалом называют чистую культуру микроорганизма-продуцента, «размноженную» до такого количества (объема), которое необходимо для засева промышленных аппаратов.

Для получения посевного материала используют исходную культуру продуцента, хранящуюся в центральной заводской лаборатории (ЦЗЛ).

Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны ее название (род, вид), коллекционный номер, серия и дата выпуска, средний уровень активности, срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Чтобы свойства культуры-продуцента оставались без изменения, ее надо хранить в соответствующих условиях. При длительном хранении, особенно при частых пересевах, легко изменчивыми (вариабельными) являются прежде всего физиологические признаки культуры, т. е. те, которые представляют наибольший интерес для получения целевого продукта.

Учитывая особую важность сохранения свойств культуры-продуцента, познакомимся со способами хранения культур, применяемыми в настоящее время. Некоторые из них используются непосредственно на заводах микробиологической промышленности.

Преимущественно методом сохранения продуцента в рабочем состоянии является метод естественного отбора.

2. Способы хранения культур микроорганизмов

Способы длительного хранения культур основаны на свойствах микроорганизмов ограничивать или даже прекращать клеточный обмен веществ при изменении внешних условий. Так, при охлаждении процессы жизнедеятельности клеток резко замедляются, а при замораживании и обезвоживании клетки приходят в состояние анабиоза и преданабиоза. Однако такие клетки сохраняют жизнеспособность и при создании нормальных условий полностью восстанавливают присущие им свойства.

Наиболее распространены следующие способы хранения культур.

Хранение в холодильнике. Это самый простой способ, заключающийся в том, что готовую культуру на агаризованной среде в пробирках помещают в холодильник и хранят при температуре + 4 - 4°С в течение 1 - 2 мес. Для более длительного хранения культуру необходимо пересевать, чтобы сохранить ее физиолого-биохимические свойства. Длительные промежутки между пересевами недопустимы, так как микроорганизмы в процессе хранения потребляют из среды питательные вещества и накапливают продукты обмена, вредно влияющие на их свойства. Кроме того, в процессе хранения среда обезвоживается, что может привести не только к изменению свойств культуры, но и к ее гибели.

Хранение под слоем минерального масла. На твердых средах под слоем стерильного вазелинового масла или парафина можно хранить культуру несколько месяцев. Толщина слоя масла над поверхностью агар-агара должна быть не менее 1 см, чтобы предохранить среду от высыхания. При большей толщине слоя масла может произойти гибель аэробной культуры из-за недостатка кислорода. Культуру заливают стерильным маслом после того, как она достигнет полной физиологической зрелости.

Хранение в сыпучих материалах. Этот способ нашел широкое применение, благодаря простоте и надежности. Заключается он в том, что суспензию микроорганизмов или спор наносят на предварительно простерилизованный сыпучий материал (почву, песок, глину, зерно), высушивают при комнатной температуре и хранят в стеклянной посуде, закрытой ватной пробкой. Чтобы возобновить культуру с сыпучего материала делают смыв на чашки Петри и высевают на питательный агар-агар. Срок хранения культуры в зависимости от вида микроорганизмов может достигать нескольких месяцев.

Замораживание и хранение при температуре ниже -- 20 °С.

При таком способе культура сохраняется несколько месяцев, однако следует избегать многократных оттаиваний и замораживаний. Некоторые культуры можно хранить в замороженном состоянии при температурах--165-196°С (температура жидкого азота). Культуру замораживают в 10%-ном водном растворе глицерина и помещают в ампулы, которые запаивают. Ампулы хранят в контейнере с жидким азотом. В этих условиях некоторые микроорганизмы сохраняют все физиолого-био-химические свойства в течение нескольких лет. посевной культивирование микроорганизм почва

Сублимационная сушка. В настоящее время сублимационная сушка считается наиболее перспективным способом длительного хранения микроорганизмов. Этот способ отличается сложностью и проводится в несколько этапов. Вначале в культуру микроорганизмов добавляют так называемую защитную среду (сахарозу, бульон и др.), которая предохраняет клетки от инактивации за счет снижения лиофильного взаимодействия воды с клетками, разливают в стерильные ампулы и закрывают стерильными ватными тампонами. . Затем проводят быстрое замораживание при температуре --35-;--78 °С. Ампулы с замороженной культурой переносят в вакуум-сушильный аппарат и подвергают сублимационной (из твердой фазы в газообразную) сушке при комнатной температуре и остаточном давлении 1 --10 кПа в течение 25--30 ч.

Сублимационно высушенные культуры могут сохраняться 5--6 лет без потери физиологических особенностей и способности к быстрому росту.

Этот способ называют также хранением культур в лиофилизованном состоянии.

В заводских условиях чаще всего используют способы хранения культур в холодильнике или под слоем вазелинового масла.

3. Технологическая схема получения посевного материала (блок-схема)

Готовый посевной материал

1. Исходную культуру размножают на скошеной агаризованной среде.

2. Выращенную культуру переносят в колбу, содержащею жидкую питптельную среду(18-36ч.)

3. Готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор), в который предварительно вносят парафины и минеральные соли(12-14ч.)

4. Все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится простерилизованная питательная среда (12-14ч.)

5. Перед приемом дрожжевой суспензии с предыдущей стадии в аппарате готовят питательную среду путем подачи парафина, растворов питательных солей и микроэлементов. Перекачивают засевные дрожжи с предыдущей стадии и начинается процесс выращивания при непрерывной аэрации и перемешивании. (Процесс накопления дрожжей длится 10-- 12 ч.)

4. Особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов

Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы:

- культура микроорганизмов;

- питательная среда;

- аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

- средства контроля и управления процессом.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства препаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление, как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Так, при производстве бактериальных препаратов целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой, - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную смесь. В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, способ культивирования называют поверхностным. Когда же микроорганизмы распределяются по всему объему жидкой питательной среды, культивирование называют глубинным (жидкофазным). В таком случае кислород поступает к клеткам в результате интенсивной операции перемешивания. Последний способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд./см-3, а при применении принудительной аэрации урожайность достигает 50-60.

2. Процесс легко управляем. С целью длительного поддержания роста и размножения микроорганизмов в процессе их культивирования дополнительно вводят углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования.

3. Процесс максимально технологичен. Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах (ферментерах) складывается из следующих этапов:

- отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;

- приготовление посевной микробной культуры;

- приготовление и стерилизация питательных сред;

- подготовка биореактора к посеву;

- выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над процессом культивирования. Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

- стерилизацию оборудования и коммуникаций;

- приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования.

5. Аппаратурное оформление процесса выращивания посевного материала

Приготовление посевного материала в зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических особенностей состоит из нескольких последовательных этапов: исходная культура (в пробирке) --выращивание на скошеной агаризованной среде ( в пробирках)-- выращивание в колбах на качалке на жидкой среде (одна -- две стадии)--выращивание в посевном аппарате (инокуляторе -- один или несколько)-- накопление культуры микроорганизмов в малом ферментаторе--посевной материал.

На рис. 1 для примера показана схема приготовления посевного материала, применяемая в производстве дрожжей на предельных углеводородах нормального строения -- н-парафинах нефти.

Рис. 1. Схема приготовления посевного материала.

Выращивание посевного материала производится по следующим стадиям: 1 -- получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода; 2 -- выращивание посевного материала в малом посевном аппарате (вместимостью 300 л); 3-- выращивание дрожжей в большом посевном аппарате (вместимостью 3200 л); 4 -- накопление культуры дрожжей в малом ферментаторе (вместимостью 50 м3).

Первая стадия выращивания посевного материала осуществляется в заводской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошеной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность).

Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50--100 мл жидкой питательной среды. Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении (28--30 °С). Перемешивание культуры, которое осуществляется встряхиванием качалки (120--240 об/мин), увеличивает скорость роста культуры, благодаря интенсификации массообмена. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 18-- 36 ч. Эту стадию выращивания необходимо контролировать по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.

На второй стадии выращивания посевного материала готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор), в который предварительно вносят парафины и минеральные соли в определенных количествах. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т. д. Объем питательной среды в аппарате не должен превышать 60% общего объема. Важное значение имеет количество внесенного в аппарат посевного материала. При малом количестве посевного материала требуется более длительный период инокуляции. Поэтому в посевной аппарат вносят обычно посевного материала 10-- 12% от объема питательной среды.

Во время приготовления посевного материала в аппаратах необходимо поддерживать оптимальный режим культивирования. Для контроля регулярно отбирают пробы и проводят их микробиологический и биохимический анализ. Культивирование продолжают до тех пор, пока в среде не накопится дрожжей 14--20 г/л (в расчете на сухую массу). Обычно процесс заканчивается за 12--14 ч.

Третья стадия культивирования посевного материала осуществляется в посевном аппарате объемом 3,2 м3. Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится простерилизованная питательная среда. Коэффициент перехода от одного аппарата к другому зависит от конкретных условий выращивания каждой культуры микроорганизмов. Если этот переход осуществляется в фазе экспоненциального роста, то коэффициент перехода по отношению к объему следующего аппарата равен обычно 10. Процесс выращивания длится 12--14 ч. Четвертая стадия процесса осуществляется в аппарате объемом 50 м3. Перед приемом дрожжевой суспензии с предыдущей стадии в аппарате готовят питательную среду путем подачи парафина, растворов питательных солей и микроэлементов. Среду доводят до оптимальных значений рН и температуры, перекачивают засевные дрожжи с предыдущей стадии и начинают процесс выращивания при непрерывной аэрации и перемешивании. Процесс накопления дрожжей длится 10-- 12 ч. Когда концентрация абсолютно сухих дрожжей (АСД) в среде составит 14--17 г/л, дрожжевую суспензию можно подавать в производственные ферментаторы.

Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.

Список литературы

1) Беккер М.Е. Введение в биотехнологию Пер с латышского. - Рига.: Изд. «Звайгэне», 1987

2) Бирюков В.В.Основы промышленной биотехнологии. -М.,2004.-296с

3) Елинов Н.П. Основы биотехнологии. - СПб.: фирма «наука». 1995

Размещено на Allbest.ru