Биотехнологии в микробиологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Глицериновое брожение, как альтернативный вариант спиртового брожения

Схема глицеринового брожения

Другим примером нарушения нормального метаболизма дрожжей, хотя и не нашедшем практического применения, является спиртовое брожение в щелочной среде. Нормальный процесс требует для своего протекания слабокислой среды (рН=4,0-5,0). При увеличении значения рН выше нормы происходит изменение нормального метаболизма дрожжевых клеток. Образующиеся из ПВК две молекулы ацетальдегида перестают восстанавливаться НАД•Н и начинают диспропорционировать с образованием одной молекулы этанола и одной молекулы уксусной кислоты, которая, взаимодействуя со щелочью, возвращает величину рН к нормальному значению. Роль акцептора водородов в это время выполняют молекулы фосфодиоксиацетона (по аналогии с процессом глицеринового брожения).

С энергетической точки зрения глицериновое брожение и брожение в щелочной среде менее выгодны, по сравнению с процессом нормального спиртового брожения (1 молекула АТФ на 1 молекулу глюкозы). Однако эти метаболитические пути являются альтернативными, запасными вариантами гликолиза, позволяющими клеткам не только выжить в неблагоприятных условиях, но и нейтрализовать их.

2. Особенности микробиологического получения лизина и триптофана

Производство лизина. По содержанию лизина наименее сбалансированы белки злаковых культур, у которых его дефицит составляет от 20 до 50 %. На территории России недостаток лизина в кормах не может быть восполнен за счет сои, поэтому в нашей стране производство этой аминокислоты было организовано первым. Для удовлетворения потребностей животноводства в лизине крупнотоннажное производство налажено в Испании, Франции, Японии и США.

В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот - лизина, метионина и треонина. При этом образование лизина и треонина в клетке бактерии находится под строгим метаболическим контролем. У типичных продуцентов L-лизина -- Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum - фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является уникальным аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при одновременном связывании аллостерического центра с молекулами L-треонина и L-лизина. При одновременном накоплении треонина и лизина в избыточной концентрации аспартаткиназа ингибируется и их синтез останавливается, при понижении концентрации любой из двух аминокислот процесс активизируется.

Для того, чтобы добиться избыточного накопления в клетке целевой аминокислоты (лизина) используют два основных подхода.

Первый подход основан на использовании мутантных штаммов, у которых не синтезируется или не функционирует фермент - гомосериндегидрогеназа, в результате у них блокирован синтез треонина и метионина, т.е. одной из аминокислот ингибирующей совместно с лизином аспартаткиназу. Поскольку обойтись без этих двух аминокислот клетки не могут, то такие мутанты являются ауксотрофами по треонину и метионину, т.е. для их нормального выращивания необходимо добавлять готовый метионин и треонин в питательную среду. Если добавлять эти аминокислоты в небольших (лимитирующих) количествах, достаточных только для восполнения минимальных потребностей клеток, то внутриклеточная концентрация треонина будет у них существенно ниже той, что вызывает блокаду с аспартаткиназы. Поэтому при любых высоких концентрациях лизина в клетке ингибирования аспартаткиназы не будет. Таким образом, можно добиться сверхсинтеза лизина в количествах многократно превышающих потребности клеток-продуцентов.

Второй подход основан на использовании мутантных штаммов у которых имеются дефекты в структурном гене, определяющем конформацию аспартаткиназы. Такой фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям своего аллостерического ингибитора -- лизина и эффект ретроингибирования не проявляется.

Как уже отмечалось, в избыточных количествах аминокислоты токсичны для продуцирующих их клеток. Поэтому, важным фактором, обеспечивающим их максимальный сверхсинтез, является создание условий для максимально возможного и быстрого их выведения (секреции) из клеток в культуральную среду, а так же и из самой культуральной среды. Увеличение секреции достигается обычно увеличением проницаемости клеточных мембран. Практически, проницаемость клеточной мембраны увеличивают либо с помощью мутаций, либо путем изменения состава питательной среды. В последнем случае в культуральной среде создают дефицит биотина (1 -- 5 мкл/л), добавляют пенициллин (2 - 4 мкг/л), детергенты (твин-40 и твин-60) или производные высших жирных кислот (пальмитаты, стеараты). Биотин контролирует содержание в клеточной мембране фосфолипидов, а пенициллин нарушает биосинтез клеточных стенок бактерий, что повышает выделение аминокислот в среду. Удаление аминокислот из культуральной жидкости в процессе культивирования (без остановки процесса) достигается ее отбором и пропусканием через колонку с соответствующими сорбентами, обычно ионообменными смолами. Иногда в среду для культивирования добавляют нетоксичные вещества, которые взаимодействуют с молекулами аминокислот и переводят их в нерастворимое состояние (в осадок). Часто проводят и процедуру коррекции величины рН среды, поскольку накопление больших количеств аминокислоты может сильно отклонить ее от оптимального значения.

Для культивирования штаммов микроорганизмов при производстве аминокислот как источники углерода наиболее доступны углеводы - глюкоза, сахароза и реже фруктоза и мальтоза. Для снижения стоимости питательной среды в качестве источников углерода используют вторичное сырье: свекловичную мелассу (маточный раствор после выделения кристаллов сахара в процессе упаривания сахарсодержащих жидкостей), молочную сыворотку, гидролизаты крахмала, сульфитные щелока. Технология этого процесса совершенствуется в направлении разработки дешевых синтетических питательных сред на основе уксусной кислоты (до 1,5%), пропионовой кислоты, метанола, этанола (до 1 %) и н-парафинов. В качестве источников азота применяют мочевину и соли аммония (сульфаты и фосфаты). Для успешного развития микроорганизмы нуждаются в стимуляторах роста, в качестве которых выступают экстракты кукурузы, дрожжей и солодовых ростков, гидролизаты отрубей и дрожжей, витамины группы В. Кроме того, в питательную среду добавляют необходимые для жизнедеятельности макро- и микроэлементы (Р, Са, Mg, Mn, Fe и др.). На процесс биосинтеза аминокислот существенное влияние оказывает снабжение воздухом, при этом степень аэрации индивидуальна для производства каждой конкретной аминокислоты.

Опыты показали, что лизин появляется в культуральной среде начиная с середины экспоненциальной фазы роста культуры клеток микроорганизма и достигает максимума к ее концу. Поэтому на первой стадии технологического процесса формируют биомассу продуцента, которую выращивают в специальных посевных аппаратах в течение суток (рН 7,0-7,2; температура 28 - 30 °С), а затем подают в производственный ферментер, заполненный питательной средой. Лизин начинает поступать в культуральную жидкость через 25-30 ч после начала ферментации. По завершении процесса ферментации (через 55 - 72 ч) жидкую фазу отделяют от культуры клеток микроорганизма фильтрованием и используют для выделения из нее лизина.

Высокоочищенные препараты лизина получают после фракционирования фильтрата культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на катионите.

Производство триптофана. Триптофан достаточно часто является лимитирующим фактором питания, так как его содержание в традиционных продуктах (рыба, молоко, кормовые дрожжи) в 3 раза ниже, чем в стандартном белке.

Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина. Однако при выращивании мутантных штаммов в среде с минимальной концентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, избыточное накопление триптофана в среде все равно не наблюдается, что объясняется особенностью процессов регуляции биосинтеза триптофана у микроорганизмов.

Наряду с другими ароматическими аминокислотами у микроорганизмов и растений триптофан образуется из метаболитов углеводного обмена - эритрозо-4-фосфата и фосфоенолпирувата.

Процесс новообразования ароматических аминокислот идет через шикимовую и хоризмовую кислоты. Метаболическим предшественником триптофана служит антраниловая кислота, которая возникает из хоризмовой кислоты под действием антранилат-синтетазы. Образующийся триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез этого фермента индуцируют ступенчатым введением предшественника - антраниловой кислоты (0,1--0,3 %), которая достаточно легко может быть получена методом химического синтеза:

В связи с этой особенностью промышленное производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.

Биомассу дрожжей выращивают при температуре 30 °С в среде, содер-жащей свекловичную мелассу, мочевину и минеральные компоненты. Через сутки в ферментер вводят 5 %-й спиртовой раствор антраниловой кислоты и 50 %-й раствор мочевины, а через 3 -4 ч после введения предшественника дополнительно добавляют источник углерода (25 %-й раствор мелассы). Антраниловую кислоту и мочевину подают через каждые 6 ч, а мелассу - через каждые 12 ч. Процесс двухступенчатой ферментации завершается через 144 ч и обеспечивает содержание триптофана в культуральной среде до 6 г/л.

Кроме триптофана микробиологическим способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серии и треонин.

Менее распространены одноступенчатые технологии получения триптофана на основе ауксотрофных мутантов бактерии Bacillus subtilis, осуществляемые по схеме, близкой к способу получения лизина. Длительность одноступенчатого процесса 48 ч, а концентрация триптофана в культуральной среде составляет 10 г/л.

После сушки культуральной жидкости получают кормовой концентрат триптофана (ККТ), который включает белки, свободный триптофан, витамины В_ь В₂ и PP. Высокоочищенные кристаллические препараты триптофана образуются после дополнительной очистки культуральной жидкости методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной катионитом (сорбция при рН 1,0; элюция 5%-м раствором гидроксида аммония в смеси с пропанолом-2). Элюаты кристаллизуют; кристаллы отмывают и высушивают. Кристаллический препарат содержит до 99 % триптофана.

Характерная особенность процессов получения аминокислот микробиологическим способом, равно как и других биотехнологических производств, - полное использование побочных продуктов, что превращает большинство из них в безотходные и экологически чистые технологии. Например, осадок микроорганизмов-продуцентов и промывные воды, содержащие ценные ингредиенты, такие, как белки, остатки аминокислот, витаминов, минеральных солей и микроэлементов, высушивают и используют в качестве кормовых препаратов.

3. Турбидостатический режим работы ферментера

Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем культуральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей питательной средой.

В зависимости от того, на каком принципе основано поддержание постоянства концентрации клеток различают турбидостатический и хемостатический режимы непрерывного культивирования.

При турбидостатическом режиме культивирования постояннство концентрации клеток обеспечивается управляемым изменением скорости протока жидкости через аппарат за счет подачи больших или меньших объемов питательной среды. Наиболее распространенным методом определения концентрации клеток в культуральной жидкости является измерение светорассеивания (мутности) выходящего из ферментера потока с помощью прибора-нефелометра, измеряющего мутность жидкости по величине светорассеяния. Сам прибор посредством электрической схемы связан с насосом для подачи питательной среды или вентилем (краном), регулирующим эту подачу. Повышение концентрации клеток в культуральной жидкости, приводит к увеличению светорассеяния, что автоматически вызывает увеличение объема подаваемой в аппарат свежей питательной среды, и что, в свою очередь, приводит к вымыванию избыточных клеток. Наоборот, при уменьшении светорассеяния (снижении концентрации клеток) скорость протока жидкости через аппарат уменьшается и соответственно уменьшается процесс их вымывания из ферментера.

Недостатком турбидостатического режима является то, что в этом режиме невозможно достигнуть полного усвоения питательных веществ и при выделении целевого продукта они могут безвозвратно теряться или загрязнять его, усложняя процесс очистки. При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу и искажения его показаний. Однако имеются и определенные преимущества. Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения его от заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм.

4. Отрицательные последствия пенообразования в ферментере. Способы пеногашения

Большинство микробиологических процессов сопровождается интенсивным выделением различных газов (CO₂, H₂, CH₄ и др.), что часто приводит к обильному пенообразованию. Это является крайне нежелательным процессом, так как чрезмерное вспенивание в ферментере ограничивает полезную емкость аппарата, нередко является причиной заражения среды посторонней микрофлорой, приводит к потерям культуральной жидкости, уходящей с пеной из аппарата. В большинстве случаев пеногашение осуществляют с помощью добавления химических пеногасителей - поверхностно-активных веществ природного и химического происхождения. Однако в последнее время все больше внимания обращается на механические пеногасители, использование которых исключает или резко сокращает введение химических пеногасителей, которые иногда бывают токсичными для микроорганизмов-продуцентов или являются ингибиторами ферментов.

Все механические пеногасители разделяются на два типа - роторные и циклонные. Принцип действия механических пеногасителей заключается в разрушении пузырьков воздуха или их дроблении при контакте с рабочим органом. Применяются как встроенные в аппарат, так и выносные механические пеногасители.

В случае роторных пеногасителей рабочим органом является обычно вращающийся диск с лопастями, выступами, прорезями либо пакет кони-ческих сепарационных тарелок.

Довольно широко используются пеногасители циклонного типа. Поступающая из аппарата воздушно-пенная струя двигается по винтовому каналу в верхней части циклона и после попадания в полую нижнию часть его закручивается как в вихре. В результате жидкость собирается в центе вихря и падает вниз, удаляясь через нижний патрубок, а воздух уходит через верх. Наилучший эффект в этом случае достигается обычно при их совместном использовании с химическими пеногасителями.

5. Достоинства и недостатки химических способов иммобилизации ферментов

фермент микробиологический брожение триптофан

Химические методы иммобилизации ферментов представляют иммобилизацию ферментов путём образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

ПРЕИМУЩЕСТВА

1. Обеспечение высокой прочности связи объекта с носителем. При достаточно широком варьировании условий (рН, температура и т.д.) фермент, клетка не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов. Однако расположение фермента относительно носителя на расстоянии одной ковалентной связи создаёт трудности в осуществлении каталитического процесса. Ферменты отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, или спейсер), в роли которой чаще всего выступают полифункциональные агенты бромциан, гидразин, глутаровый диальдегид. В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединённые между собой ковалентными связями.

2. Благодаря химическим методам многоточечного ковалентного закрепления белковой структуры удается достигнуть наибольших эффектов стабилизации ферментов.

Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.

6. Векторные вакцины

Эти вакцины принципиально отличаются от вакцин других типов тем, что имуногенные белки не вводятся в готовом виде в имунизируемый организм с компонентами вакцины (клетки микроорганизмов и продукты их разрушения), а синтезируются в непосредственно в нем, за счет экспрессии кодирующих их генов, которые в свою очередь переносятся в имунизируемый организм с помощью специальных векторов. Наиболее широко “векторные вакцины” создаются на основе вируса коровьей оспы (ВКО), а так же ряда других условно- или малопатогенных вирусов (аденовирус, полиовирус, вирус ветряной оспы).

ВКО имеет широкий спектр хозяев (позвоночных и беспозвоночных), остается жизнеспособным в течение многих лет после лиофилизации (испарения воды с помощью замораживания) и не обладает онкогенными свойствами, а потому весьма удобен для создания векторных вакцин.

Векторные ВКО-вакцины позволяют провести иммунизацию сразу от нескольких заболеваний. Для этого можно использовать рекомбинантный ВКО, который несет несколько генов, кодирующих разные антигены.

Живая рекомбинантная векторная вакцина имеет ряд преимуществ перед неживыми вирусными и субъединичными вакцинами:

1) образование и активность аутентичного антигена практически не отличается от такового при обычной инфекции;

2) вирус может реплицироваться в клетке-хозяине и увеличивать количество антигена, который активирует продукцию антител В-клетками (гуморальный иммунитет) и стимулирует выработку Т-клеток (клеточный иммунитет);

3) встраивание нескольких генов антигенных белков в геном ВКО еще больше уменьшает его вирулентность.

7. Рибозимы. Перспективы использования рибозимов в качестве лекарств

Рибозимы - это природные РНК, обладающие каталитической активностью (РНК-ферменты); их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплементарной РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а каталитический “головка молотка” расщепляет ее в специфическом сайте. Модифицируя субстратсвязываюшую последовательность, можно получить рибозим, специифичный в отношении определенной мРНК.

Создание «терапевтического» рибозима - сложный процесс. Связано это с трудностью получения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. В одном из экспериментов синтезировали олигодезоксинуклеотид, который содержал каталитический домен (примерно 20 нуклеотидов), фланкированный гибридизующимися с мРНК-мишенью последовательностями (они же выступали в роли праймеров), амплифицировали его, встроили в эукариотический экспрессирующий вектор и трансфицировали полученной конструкцией клетки. Образовавшийся после транскрипции рибозим расщеплял мРНК-мишень и подавлял трансляцию белка, ответственного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций.

Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезированы олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их получения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития.

8. Пептидомиметики и пептоиды

Одним из перспективных направлений в создании новых типов лекарственных препаратов является использование соединений, называемых „пептидомиметиками“. Прямой перевод этого термина с латыни на русский означает «имитирующий, подражающий пептиду».

Многие из ферментных субстратов, например ангиотензиноген, ангиотензин, фибриноген (как предшественник фибрина), белки вируса иммунодефицита GAG и GAG-POL (предшественники протеазы и других белков ВИЧ) и многие лиганды ферментов и рецепторов, такие как серпины, энкефалины, нейрокинины, соматостатин, фибриноген, витронектин и другие, являются либо низкомолекулярными пептидами, либо белками. Взаимодействие этих лигандов с их биомишенями осуществляется, как правило, с помощью небольшого концевого участка полипептидной цепи, содержащего всего несколько аминокислот («рабочая часть ключа»), а остальная часть полипептида или белка стабилизирует определенное пространственное расположение данной части макромолекулы (“рукоятка ключа”). Показательным примером этого может служить пептидный мотив RGD (аргинин, глицин, аспартат), который взаимодействует с различными интегриновыми рецепторами в совершенно разных конформациях.

Если создаваемое нами лекарство должно подействовать на мишень, природный лиганд для которой такой пептид, то этот пептид можно взять в качестве соединения-лидера. Однако пептиды в качестве лекарств не слишком удобны: плохо растворяются в воде, легко расщепляются протеолитическими ферментами организма.

Поэтому на основе такого пептида создается лекарство- пептидомиметик - соединение, способное взаимодействовать с той же мишенью, но содержащее различные непептидные (неприродные) структурные элементы. Пептидомиметики способны копировать или противодействовать биологической активности природных белковых молекул, аналогами которых они являются.

По своей структуре пептидомиметики могут представлять собой полипептидную цепочку, построенную из молекул неприродных б-аминокислот или D-изомеров природных, часто замещенных по атому азота. Введение таких аминокислот (особенно б,б-дизамещенных) в ключевые позиции биологически активных пептидов, как правило, приводит к существенному повышению протеолитической и конформационной стабильности, селективности действия и улучшению фармакокинетических параметров потенциальных лекарств.

В принципе, пептидомиметики вовсе не обязательно должны иметь классическую полипептидную структуру. Главное, чтобы они могли эффективно имитировать полипептидный лиганд и обладать высоким сродством к биомишени. Поэтому в структуры пептидомиметиков часто вводят различные фрагменты - заместители и функциональные группы никогда не встречающиеся в природных полипептидах, которые являются биоизостерическими аналогами определенных участков природных пептидов.

Результатом успешного применения пептидомиметического подхода являются используемые в клинической практике анти - ВИЧ препараты нелфинавир, ампренавир, а так же бензодиазепиновые препараты.

Литература

1. Ю.О. Сазыкин, С.Н.Орехов, И.И.Чекалиева. Биотехнологя. Издательский центр "Академия", М. 2006. 256 с.

2. Т.А Егорова, С.М. Клунова, Е,А,Живухина. Основы биотехнологии. Издательский центр "Академия", М. 2003. 208 с.

3. Б.Глик, Дж.Пастернак. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М. "Мир". 2002. 590 с.

4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник. М.: Изд-во МГУ, 1994. 512 с.

5. Инженерная энзимология. Учебно-методическое пособие для студентов 5 курса фармацевтического факультета. Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006. 104 с.

Составители: Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В.

6. Методы выделения и очистки продуктов биотехнологических производств. Учебно-методическое пособие для студентов 5 курса фармацевтического факультета. Нижний Новгород: Изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2006. 104 с. Составители: Османов В.К., Бирюкова О.В., Борисов А.В., Борисова Г.Н., Мацулевич Ж.В.

Размещено на Allbest.ru